張 珂， 王夢(mèng)迪， 董 笛， 胡乃文， 晁躍輝， 曾會(huì)明

(北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院，北京 100083)

大葉落地生根是景天科伽藍(lán)菜屬多年生肉質(zhì)草本植物，不定芽入土即可形成新的植株，故名“落地生根”，原產(chǎn)于非洲馬達(dá)加斯加，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。大葉落地生根具有較高的研究?jī)r(jià)值，它不僅是研究景天酸代謝(Crassulacean acid metabolism，CAM)途徑的模式植物[2]，也是研究高等植物無(wú)性繁殖的模式植物[3]。大葉落地生根葉緣凹陷處會(huì)形成可進(jìn)行無(wú)性繁殖的不定芽，這一特質(zhì)可用來(lái)研究植物體細(xì)胞全能性，為植物組織培養(yǎng)等相關(guān)應(yīng)用的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)[4]。

隨著功能基因組學(xué)研究的逐步深入，蛋白互作成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，研究蛋白質(zhì)之間的相互作用是研究基因功能的重要方法[5]。酵母雜交技術(shù)是高靈敏度的分子生物學(xué)技術(shù)，可以在酵母體內(nèi)分析蛋白質(zhì)互作或蛋白質(zhì)與核酸互作[6]。同時(shí)，該技術(shù)既能免去純化蛋白質(zhì)復(fù)雜操作且在一定程度上還能反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況[7]。酵母雜交技術(shù)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)互作方面的研究，用以揭示已知蛋白或基因參與調(diào)控動(dòng)植物特定代謝過(guò)程的分子機(jī)制。趙倩倩等[8]構(gòu)建了玉米不同時(shí)期籽粒cDNA文庫(kù)，并從中初步篩選到了玉米籽粒灌漿期重要調(diào)控蛋白ZmSCL1的互作因子。姜紅巖等[9]探究ZjNAC2在脅迫響應(yīng)中的作用機(jī)制時(shí)，成功從日本結(jié)縷草酵母雜交文庫(kù)中篩選到4個(gè)與抗病過(guò)程相關(guān)的互作蛋白。酵母雜交技術(shù)的關(guān)鍵在于構(gòu)建高質(zhì)量的基因文庫(kù)。因此，構(gòu)建高容量的cDNA酵母文庫(kù)對(duì)酵母雜交的篩選具有重要意義。目前，對(duì)于大葉落地生根不定芽的研究集中在功能基因的克隆及表達(dá)分析方面[10-11]，尚未見(jiàn)利用酵母雜交技術(shù)探究其分子調(diào)控機(jī)理的研究。

S-腺苷高半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-homocysteine hydrolase,SAHH)是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)甲基化反應(yīng)的關(guān)鍵酶。SAHH基因影響著植物的生長(zhǎng)發(fā)育，抑制該基因的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致植物器官的發(fā)育缺陷，如煙草花和葉的畸變[12]。本課題組[13]前期在干旱誘導(dǎo)的大葉落地生根不定芽差減cDNA文庫(kù)中篩選到KdSAHH基因片段，并利用熒光定量技術(shù)發(fā)現(xiàn)KdSAHH基因在不定芽發(fā)育過(guò)程中上調(diào)表達(dá)明顯。為探究KdSAHH基因在大葉落地生根不定芽發(fā)育過(guò)程中分子調(diào)控機(jī)制，本研究利用SMART技術(shù)構(gòu)建了高容量大葉落地生根酵母雜交cDNA文庫(kù)和pGBKT7-KdSAHH誘餌載體，以期為利用酵母雜交技術(shù)從大葉落地生根cDNA文庫(kù)中篩選出KdSAHH的互作因子，揭示KdSAHH基因調(diào)控下游響應(yīng)基因從而影響不定芽發(fā)生的分子機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大葉落地生根培養(yǎng)于北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所光照培養(yǎng)箱，選擇株齡為1年且不定芽生長(zhǎng)穩(wěn)定的大葉落地生根為試驗(yàn)材料。RNA提取試劑盒、PCR純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自O(shè)MEGA公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SmaⅠ限制性內(nèi)切酶、無(wú)縫連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司(日本)。文庫(kù)構(gòu)建試劑盒、酵母轉(zhuǎn)化試劑盒、Y187菌株、酵母表達(dá)載體pGADT7,Y2HGold酵母菌株、酵母誘餌載體pGBKT7，X-α-Gal，AbA，Matchmaker Insert Check PCR Mix 1均購(gòu)自Clontech公司。大腸桿菌感受態(tài)E.coli DH5α購(gòu)自Transgen公司。

1.2 大葉落地生根總RNA的提取

選取大葉落地生根長(zhǎng)勢(shì)良好且均一的根、莖、葉、花以及不定芽組織混勻，稱取0.1 g于液氮中研磨至粉末狀，采用試劑盒提取總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，并用紫外分光光度計(jì)NanoDorp 2000測(cè)量其質(zhì)量與濃度。

1.3 cDNA的合成

1.3.1cDNA第一鏈合成 取1 μg RNA為模板，與1 μL CDS Ⅲ Primer Mix混勻并加水至4 μL體系中72℃溫浴2 min，冰浴2 min后加入2 μL 5×第一鏈緩沖液，1 μL DTT，1 μL dNTP Mix，1 μL SmartscribeTM反轉(zhuǎn)錄酶，然后置于42℃保溫10 min，加入1 μL SMART III寡核苷酸，42℃保溫1 h，然后加入1 μL RNase H，37℃保溫20 min。將一鏈產(chǎn)物-20℃保存。

1.3.2LD PCR 取2 μL cDNA第一鏈產(chǎn)物和10 μL 10×Advantage 2 PCR緩沖液，2 μL 50×dNTP Mix，2 μL 5′ PCR引物，2 μL 3′ PCR引物，2 μL 50×Advantage 2 Polymerase Mix加水至100 μL體系中混勻。5′PCR引物：5′-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3′，3′ PCR引物：5′-GTA-TCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3′。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s；95℃ 15 s，68℃ 6 min，18個(gè)循環(huán)；68℃ 5 min。然后利用PCR純化試劑盒純化其產(chǎn)物。

1.4 cDNA文庫(kù)的均一化

1.4.1雜交 取1 μg ds cDNA，8 μL 2×雜交反應(yīng)緩沖液加水至16 μL體系的PCR小管中混勻后均分4份，置于PCR儀中98℃保溫2 min后，迅速轉(zhuǎn)移到68℃水浴鍋中5 h。

1.4.2DSN消化 68℃預(yù)熱2×DSN主緩沖液。取4 μL雜交后的cDNA,5 μL預(yù)熱2×DSN主緩沖液和1 μL DSN溶液(分別為DSN，1/2 DSN，1/4 DSN，DSN儲(chǔ)存緩沖液)于4個(gè)PCR小管混勻，置于PCR儀中68℃保溫25 min，每管加入10 μL 2×DSN終止緩沖液后室溫放置5 min，將產(chǎn)物-20℃保存。

1.5 DSN消化后兩次PCR放大

1.5.1第一次放大 取5 μL 10×Advantage 2 PCR緩沖液，1 μL 50×dNTP Mix，5 μL 10×GC溶解溶液，1 μL 5′ PCR引物，1 μL 3′ PCR引物，1 μL 50×Advantage 2 Polymerase Mix和1 μL消化后產(chǎn)物加水至50 μL體系的PCR小管中混勻，并分別標(biāo)記為DSNP1，1/2 DSNP1，1/4 DSNP1，DP1。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s；95℃ 15 s，68℃ 6 min，17個(gè)循環(huán)；68℃ 5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后選擇模板進(jìn)行第二次放大。

1.5.2第二次放大 取10 μL 10×Advantage 2 PCR緩沖液，2 μL 50×dNTP Mix，10 μL 10×GC溶解溶液，2 μL 5′ PCR引物，2 μL 3′ PCR引物，2 μL 50×Advantage 2 Polymerase Mix和2 μL稀釋十倍后一次放大產(chǎn)物加水至100 μL體系的PCR小管中混勻。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s；95℃ 15 s，68℃ 6 min，24個(gè)循環(huán)；68℃ 5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后利用純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。

1.6 大葉落地生根cDNA酵母文庫(kù)構(gòu)建與克隆鑒定

按照酵母轉(zhuǎn)化試劑盒說(shuō)明書(shū)制備Y187酵母感受態(tài)，并參照趙倩倩等[8]酵母共轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞。吸取200 μL轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞液鋪展到規(guī)格為直徑150 mm的平板上，共計(jì)100塊平板。30℃倒置溫育平板直到克隆出現(xiàn)。4℃冷卻平板3～4 h，每個(gè)平板加入5 mL冷凍培養(yǎng)基，使用無(wú)菌的玻璃棒并輕輕的攪動(dòng)，收集液體。吸取100 μL 10倍、100倍和1 000倍的酵母稀釋液鋪展到在規(guī)格為直徑100 mm SD/-Leu的平板上檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率。文庫(kù)滴度(CFU·mL-1)=平板上的單克隆個(gè)數(shù)/平板上涂布菌液的體積(μL)×1×103(μL)，文庫(kù)總?cè)萘?文庫(kù)滴度(CFU·mL-1)×文庫(kù)菌液總體積(mL)。隨機(jī)挑取24個(gè)單克隆菌落，使用Matchmaker Insert Check PCR Mix 1進(jìn)行PCR檢測(cè)。上游引物序列T7：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′，下游引物序列3′AD：5′-AGATGGTGCACGATGCACAG-3′。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 1 min；98℃ 10 s，55℃ 30 s，68℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)插入片段大小。

1.7 pGBKT7- KdSAHH載體的構(gòu)建及Y2H Gold酵母轉(zhuǎn)化

根據(jù)KdSAHH基因序列(GenBank登錄號(hào):KF953475)設(shè)計(jì)引物。上游引物序列pGBKT7-KdSAHH-F:5′-ATGGCCATGGAGGCCGAATTCG-CGCTTATCGTCGAGAAAAC-3′，下游引物序列pGBKT7-KdSAHH-R:5′-CTGCAGGTCGACGG-ATCCCCTCAGTACCTGTAGGCAGCAG-3′。提取實(shí)驗(yàn)室保存測(cè)序結(jié)果正確的大腸桿菌菌液的質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃ 10 s；98℃ 10 s，68℃ 70 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。pGBKT7載體用SmaⅠ單酶切后與PCR產(chǎn)物一同純化回收并用無(wú)縫連接酶進(jìn)行載體與PCR產(chǎn)物的連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)中，37℃倒置培養(yǎng)。挑取單菌落進(jìn)行PCR及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將檢測(cè)正確的菌液送至生物公司測(cè)序。提取測(cè)序正確的pGBKT7-KdSAHH重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化至Y2HGold酵母感受態(tài)中。

1.8 誘餌蛋白自激活檢測(cè)

挑取轉(zhuǎn)化成功的酵母單菌落培養(yǎng)于SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，30℃過(guò)夜培養(yǎng)，取10 μL 10倍、100倍和1 000倍酵母稀釋液滴至SD/-Trp，SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)，觀察并記錄酵母生長(zhǎng)情況和生長(zhǎng)狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大葉落地生根總RNA的提取

將提取的總RNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示(圖1)，28S和18S條帶清晰明亮，完整性好。紫外分光光度計(jì)NanoDorp 2000測(cè)量濃度為300 ng·μL-1，A260/A280值為2.11，A260/A230值為2.01，表明RNA質(zhì)量好、純度高，無(wú)蛋白、酚類物質(zhì)和有機(jī)溶劑等的污染，滿足建庫(kù)要求。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA注：Marker為T(mén)rans2K Plus DNA Marker；1和2為總RNANote:Marker indicate Trans2K Plus DNA Marker;1 and 2 indicate total RNA

2.2 雙鏈cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及均一化處理

以1 μg RNA為模板利用SMART技術(shù)反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，再以其為模板進(jìn)行LD-PCR合成雙鏈cDNA。對(duì)雙鏈cDNA進(jìn)行用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示(圖2A)，雙鏈cDNA條帶主要分布在750～3 000 bp之間，且條帶成彌散狀。將質(zhì)量良好的雙鏈cDNA進(jìn)行文庫(kù)均一化處理并經(jīng)DSN消化后兩次PCR放大處理。結(jié)果顯示(圖2B)，處理后的雙鏈cDNA條帶均一且呈彌散狀，表明均一化效果好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 雙鏈cDNA瓊脂糖凝膠電泳(A)；均一化cDNA瓊脂糖凝膠電泳(B)Fig.2 Agarose gel electrophoresis of dscDNA(A);Agarose gel electrophoresis of normalized ds cDNA(B)注：Marker為T(mén)rans2K Plus DNA Marker；1為雙鏈cDNA；2為均一化cDNANote:Marker indicate Trans2K Plus DNA Marker;1 indicate ds cDNA;2 indicate normalized ds cDNA

2.3 大葉落地生根cDNA酵母文庫(kù)構(gòu)建與質(zhì)量檢測(cè)

將ds cDNA轉(zhuǎn)化至提前制備好的Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞中。菌液稀釋液鋪展在100 mm SD/-Leu平板上倒置培養(yǎng)3～4 d后，在1 000倍稀釋液的平板上大約有酵母單菌落320個(gè)(圖3A)。根據(jù)文庫(kù)滴度和文庫(kù)總?cè)萘抗娇梢缘贸鏊鶚?gòu)建的文庫(kù)滴度為3.2×106CFU·mL-1，文庫(kù)總?cè)萘繛?.8×107CFU。

圖3 不同濃度文庫(kù)菌液的單菌落Fig.3 The clone of different concentrations library suspension注：A為稀釋1 000倍的菌液；B為稀釋100倍的菌液；C為稀釋10倍的菌液Note:A indicate 10-3 library dilution;B indicate 10-2 library dilution;C indicate 10-1 library dilution

從100 mm SD/-Leu平板上隨機(jī)挑取24個(gè)酵母單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)隨機(jī)插入片段長(zhǎng)度。電泳結(jié)果顯示(圖4)，重組率為91.7%，24個(gè)單克隆中除第10和23無(wú)條帶外其余均有清晰的單一條帶，且擴(kuò)增條帶大小不一，插入片段長(zhǎng)度在250～2 000 bp范圍內(nèi)。

圖4 大葉落地生根cDNA酵母文庫(kù)插入片段大小檢測(cè)Fig.4 The insertion size range of yeast cDNA library of Kalanchoe daigremontiana注：Marker為T(mén)rans2K Plus DNA Marker；1～24為擴(kuò)增產(chǎn)物Note:M indicate Trans2K Plus DNA Marker；1～24 indicate amplifications products

2.4 誘餌載體pGBKT7-KdSAHH構(gòu)建及酵母轉(zhuǎn)化

將已完成PCR擴(kuò)增的KdSAHH片段與酶切后的pGBKT7誘餌載體純化連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌中。挑取單菌落搖菌，然后進(jìn)行菌液PCR鑒定及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖5)，1 800 bp附近出現(xiàn)清晰條帶，將該菌液送至生物公司測(cè)序。返還測(cè)序結(jié)果正確，誘餌載體pGBKT7-KdSAHH構(gòu)建成功。提取測(cè)序正確的pGBKT7-KdSAHH重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化至Y2HGold酵母感受態(tài)。取100 μL菌液均勻鋪展到SD/-Trp培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2～3 d。菌落能正常在營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，說(shuō)明表達(dá)蛋白對(duì)酵母無(wú)毒害作用。

圖5 誘餌載體瓊脂糖凝膠電泳Fig.5 Agarose gel electrophoresis of bait vector注：Marker為T(mén)rans2K Plus DNA Marker；1為誘餌載體Note:Marker indicate Trans2K Plus DNA Marker;1 indicate bait vector

2.5 載體轉(zhuǎn)錄自激活檢測(cè)

通過(guò)觀察酵母單菌落在營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況和生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄自激活檢測(cè)。酵母菌在SD/-Trp固體培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，在SD/-Trp/X-α-Gal固體培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)且不顯藍(lán)色，在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA固體培養(yǎng)基上不能正常生長(zhǎng)且不顯藍(lán)色(圖6)。載體轉(zhuǎn)錄自激活檢測(cè)表明，KdSAHH不具備轉(zhuǎn)錄自激活活性，可以進(jìn)行下一步酵母雜交試驗(yàn)篩選互作蛋白。

圖6 pGBKT7-KdSAHH載體轉(zhuǎn)錄自激活檢測(cè)Fig.6 Self-activation detection of pGBKT7-KdSAHH注：A為稀釋1 000倍的菌液；B為稀釋100倍的菌液；C為稀釋10倍的菌液Note:A indicate 10-3 library dilution;B indicate 10-2 library dilution;C indicate 10-1 library dilution

3 討論與結(jié)論

cDNA文庫(kù)已廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域的各項(xiàng)研究，因此構(gòu)建高容量的cDNA文庫(kù)是進(jìn)行有效研究的重要基礎(chǔ)[14]。文庫(kù)質(zhì)量主要從文庫(kù)代表性及重組序列的完整性這兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)[15-16]。本研究建庫(kù)材料來(lái)源于大葉落地生根各個(gè)植物組織，為cDNA種類的完整性提供保障。經(jīng)過(guò)文庫(kù)菌液稀釋涂板檢測(cè)(圖3A)，文庫(kù)滴度為3.2×106CFU·mL-1，達(dá)到低豐度mRNA篩選要求(>1×106CFU·mL-1)，文庫(kù)總?cè)萘繛?.8×107CFU，由此可見(jiàn)，所建文庫(kù)含有的遺傳信息較豐富，文庫(kù)代表性好。隨機(jī)挑取24個(gè)酵母單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖4)，檢測(cè)隨機(jī)插入片段長(zhǎng)度在250～2 000 bp范圍內(nèi)，文庫(kù)多態(tài)性好，重組率為91.7%。同時(shí)，通過(guò)觀察含有pGBKT7-KdSAHH載體的酵母菌在營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況和生長(zhǎng)狀態(tài)，證明KdSAHH不具備轉(zhuǎn)錄自激活活性，可用于后續(xù)酵母雙雜交試驗(yàn)。

本研究采用由美國(guó)Clontech公司推出的SMART技術(shù)[17]和DSN技術(shù)[18]構(gòu)建大葉落地生根全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)。將SMART技術(shù)所需RNA少、操作步驟少、用時(shí)較短且獲得的文庫(kù)全長(zhǎng)比例高等優(yōu)點(diǎn)與DSN酶的選擇性降解雙鏈核酸分子中的DNA這一特點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，解決了建庫(kù)過(guò)程中mRNA純化效果不好且低豐度表達(dá)的基因易丟失的問(wèn)題[19]，同時(shí)還增加篩到稀有基因的可能性。但用上述方法構(gòu)建的文庫(kù)中有個(gè)別克隆片段偏小，插入片段的平均長(zhǎng)度略小于1 000 bp。韋春艷等[20]在構(gòu)建陸地棉酵母雙雜交cDNA文庫(kù)時(shí)，文庫(kù)插入片段同樣偏小，但并未影響后續(xù)試驗(yàn)的開(kāi)展?？傮w來(lái)說(shuō)，本試驗(yàn)構(gòu)建的大葉落地生根cDNA酵母文庫(kù)質(zhì)量較高，滿足后續(xù)酵母雜交試驗(yàn)的要求。

目前，在大葉落地生根不定芽發(fā)生過(guò)程中已經(jīng)鑒定出一些重要調(diào)控蛋白[21-22]，但具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不清楚。以已知調(diào)控蛋白為誘餌，構(gòu)建誘餌表達(dá)載體，通過(guò)酵母雜交技術(shù)在大葉落地生根cDNA酵母文庫(kù)篩選互作蛋白，該研究思路為探究大葉落地生根基因功能及功能基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供幫助。本研究成功構(gòu)建了高容量的大葉落地生根cDNA酵母文庫(kù)和pGBKT7-KdSAHH誘餌載體，轉(zhuǎn)錄自激活檢測(cè)表明KdSAHH無(wú)轉(zhuǎn)錄自激活活性。接下來(lái)利用酵母雜交技術(shù)進(jìn)行KdSAHH互作驗(yàn)證等試驗(yàn)的開(kāi)展將為揭示KdSAHH基因調(diào)控下游響應(yīng)基因從而影響不定芽發(fā)生的分子機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)。