肖文芳 李 佐 陳和明 呂復(fù)兵

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境園藝研究所/廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點實驗室，廣州 510640)

蝴蝶蘭屬(Phalaenopsis)為蘭科商品化程度最高的屬，具極高的觀賞價值和商業(yè)價值，是全球最重要的觀賞花卉之一?；ㄉ怯^賞花卉最重要的性狀評價指標(biāo)之一，直接影響其觀賞價值和商業(yè)價值[1]。有別于絕大多數(shù)觀賞花卉的單色花和少數(shù)復(fù)色花，蝴蝶蘭的花瓣和萼片具豐富的顏色分布類型，除勻色花外，絕大多數(shù)種質(zhì)資源的花瓣和萼片為雙色，可分為底色和斑色，一般底色為整朵花的主色，斑色的顏色分布類型則包括陰影、鑲邊、條紋、線紋、網(wǎng)紋、斑點、斑塊、陰影和鑲邊、線紋和斑點、鑲邊和線紋、鑲邊與線紋和斑點[2]。植物花色屬于復(fù)雜的數(shù)量性狀，受多基因控制，遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜[3]。蝴蝶蘭原生種眾多，商品品種經(jīng)過一百多年的雜交選育，血統(tǒng)復(fù)雜，與原生種參考基因組的比對效率極低，且花色調(diào)控機制極為精細，通過轉(zhuǎn)錄組和簡化基因組測序挖掘性狀相關(guān)基因和關(guān)聯(lián)分子標(biāo)記仍然是目前研究商品品種花色遺傳機制的重要手段[1,4]，但尚未開發(fā)出花色相關(guān)分子標(biāo)記。

特異位點擴增片段測序(Specific-locus amplified fragment sequencing，SLAF)是一種根據(jù)物種個性化設(shè)計方案的簡化基因組測序技術(shù)，能夠獲取全基因組范圍內(nèi)的多態(tài)性標(biāo)簽并快速準(zhǔn)確篩選性狀關(guān)聯(lián)單核苷酸多態(tài)性(Single-nucleotide polymorphism，SNP)。群分法(Bulked segregant analysis，BSA)與SLAF的結(jié)合，能夠進一步加快對復(fù)雜性狀定位的速度，目前已在水稻黃葉轉(zhuǎn)綠基因定位[5]、玉米果皮纖維素含量相關(guān)基因定位[6]、大豆酸性磷酸酶活性候選基因挖掘及功能標(biāo)記開發(fā)[7]、大豆半矮稈基因定位[8]、紅麻第一花節(jié)位置相關(guān)SNP篩選[9]、辣椒果實花青素積累相關(guān)基因定位[10]和紫薇矮化性狀相關(guān)SNP標(biāo)記篩選[11]等研究得到成功運用。SLAF-BSA技術(shù)目前在蘭科植物上還沒有應(yīng)用，但Lu等[12]單獨利用SLAF技術(shù)成功構(gòu)建了一張包含了8 573個SLAF標(biāo)簽的石斛蘭高密度遺傳圖譜，并篩選出5個與石斛多糖含量相關(guān)的數(shù)量性狀座位(Quantitative trait locus,QTL)；Wang等[13]利用SLAF技術(shù)對文心蘭長期繼代培養(yǎng)中的體細胞無性系變異進行鑒定和篩選，證明SLAF技術(shù)在蘭科植物上適用。

蝴蝶蘭花底色直接決定整株花的主色調(diào)，且在傳統(tǒng)雜交育種過程中發(fā)現(xiàn)底色與斑色是互不干擾的2個獨立遺傳性狀。細化花色這一復(fù)雜性狀，針對性地篩選與底色相關(guān)的分子標(biāo)記，去除斑色的干擾，能夠更精準(zhǔn)獲取與單個性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，為輔助育種提供更精確有效的篩選依據(jù)。本研究基于SLAF-BSA技術(shù)，對2個親本和雜交F1代構(gòu)建的2個極端性狀混池(黃色底色混池和白色底色混池)DNA文庫進行簡化基因組測序，與花底色性狀進行關(guān)聯(lián)分析篩選相關(guān)標(biāo)記位點，并在F1代群體及其他種質(zhì)資源中進行驗證，為蝴蝶蘭分子標(biāo)記輔助育種及花色改良基因工程提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以‘黃金豹’蝴蝶蘭(Phal.Frigdaas Oxford)為母本，‘白天使’蝴蝶蘭(Phal.Join Angel)為父本構(gòu)建雜交群體，共獲得505個雜交后代，黃色底色個體與白色底色個體的比例為273∶232。后代可根據(jù)底色和斑色分為11個組(圖1)，性狀分離具體信息詳見李佐等的研究[14]。從Group 1、3、5、7和9這5個黃色底色群體中隨機選取33個單株加上Group 11中的2個單株組成黃色底色混池(ab)，從Group 2、4、6、8和10這5個白色底色群體中隨機選取35個單株組成白色底色混池(aa)，其中Group 11中的2個單株對應(yīng)斑紋最少的Group 4。所有實驗材料均栽培保存于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所白云基地蘭花資源圃中，于2018年采用統(tǒng)一孔徑打孔器分別等量采集樣品倒數(shù)第二片葉頂端中部的葉片組織，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 雜交親本及F1代個體代表株系的花部Fig.1 Flower characters of 11 Phalaenopsis F1 offspring groups and the parents

1.2 試驗方法

1.2.1主要試劑及儀器

主要試劑：SNaPshot相關(guān) PRISM?SNaPshotTM Multiplex Kit試劑盒購自Applied Biosystems公司；TaqHotStart DNA Polymerase購自Kapabiosystems公司；SAP酶購自Fermentas公司；ExoI酶、RsaI酶、HaeⅢ酶和CIP酶購自New England Biolabs(NEB)公司。

主要儀器：NanoDrop 2000(Thermo公司，美國)；HiSeqTM 2500測序平臺(Illumina公司，美國)；Beckman Allgre 21R高速冷凍離心機(Beckman公司，美國)；BC-subMIDI電泳儀(北京六一儀器廠)；JY300C電泳槽(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；BioSens SC 810B凝膠成像儀(上海山富科學(xué)儀器有限公司)；PTC-100PCR儀(MJ Research公司，美國)；3730XL測序儀(ABI公司，美國)。

采用改良的CTAB法[4]提取所有樣品DNA，利用1%瓊脂糖電泳和NanoDrop 2000檢測DNA的完整性和純度。經(jīng)純度和完整性檢驗合格后將黃色底色單株和白色底色單株DNA分別等量混合成終濃度為40 ng/μL的黃色底色DNA混池和白色底色DNA混池，用于后續(xù)SLAF測序。

1.2.3文庫構(gòu)建、測序及SLAF標(biāo)簽開發(fā)

通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)已有的小蘭嶼蝴蝶蘭(Phal.equestris)基因組和鐵皮石斛(Dendrobiumcatenatum)基因組等蘭科植物基因組對本研究采用的商品品種的參考性極低，因此采用無參考基因組的測序方法，以水稻基因組(Oryzasativa)為參考來評估實驗建庫的準(zhǔn)確性，利用酶切反應(yīng)預(yù)測軟件SLAF_Predict 進行系統(tǒng)分析，根據(jù)其重復(fù)序列、GC含量和基因特點等確定采用RsaI+HaeIII雙酶切對樣本基因組DNA分別進行酶切。得到的酶切片段進行3′端加A處理、連接Dual-index測序接頭、PCR擴增、純化、混樣和切膠選取目的片段，文庫質(zhì)檢合格后用Illumina HiSeqTM2500測序平臺進行測序。對測序得到的各樣品的reads數(shù)據(jù)進行評估，通過reads間聚類的方法，在親本和混池中開發(fā)SLAF標(biāo)簽。

1.2.4SNP_index關(guān)聯(lián)分析

SNP_index是通過尋找混池之間基因型頻率的顯著差異，用Δ(SNP_index)統(tǒng)計從而進行標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析的一種方法。Marker與性狀關(guān)聯(lián)度越強，Δ(SNP_index) 越接近于1。以大于99% Marker的Δ(SNP_index)的值作為閾值，大于該閾值的標(biāo)記則為與性狀顯著關(guān)聯(lián)的標(biāo)記。計算方法如下：

SNP_index(ab)=Mab/(Pab+Mab)

(1)

SNP_index(aa)=Maa/(Paa+Maa)

(2)

Δ(SNP_index)= SNP_index(aa)-SNP_index(ab)

(3)

式中：Maa和Paa分別表示白色底色混池(aa)來源于母本和父本的深度；Mab和Pab分別表示黃色底色混池(ab)來源于母本和父本的深度。

1.2.5SNaPshot技術(shù)篩選SNP分子標(biāo)記

根據(jù)關(guān)聯(lián)分析獲得的標(biāo)記，參照Hommais等[15]的方法設(shè)計引物，在父母本和后代11個組群中每組挑選1株未在建庫中使用的子代、2個白色底色種質(zhì)資源和2個黃色底色種質(zhì)資源驗證并篩選底色相關(guān)SNP標(biāo)記。預(yù)擴增采用10 μL反應(yīng)體系：2 μL (20 ng/μL)樣本基因組DNA、1 μL 10×Buffer I、0.8 μL dNTP、2 μL預(yù)擴增引物(F+R，5 μmol/L)、0.1 μL KAPATaqHotStart DNA 聚合酶 (5 U/μL)、4.1 μL ddH2O。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火(50～60 ℃)30 s，72 ℃延伸 30 s，共10個循環(huán)；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取2 μL產(chǎn)物上2%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量。每個樣本的預(yù)擴增產(chǎn)物等比例混合后取4 μL，加入SAP酶1.33 μL，ExoI酶(20 U/μL)0.27 μL 混合成5.6 μL體系37 ℃酶切1 h，75 ℃變性20 min。取酶切后產(chǎn)物1.2 μL，加2 μL延伸引物混合物、0.5 μL ABI Mix、0.4 μL 10×Buffer I和0.9 μL ddH2O，96 ℃變性10 s、50 ℃退火5 s、60 ℃延伸30 s，共進行30個循環(huán)的延伸反應(yīng)。取延伸反應(yīng)產(chǎn)物6 μL 加入1 μL CIP酶，37 ℃ 1 h、75 ℃ 15 min進行純化。96孔板中每孔加入分子量內(nèi)標(biāo)0.5 μL，甲酰胺8.5 μL，純化后延伸產(chǎn)物1 μL，95 ℃ 變性3 min，于3730XL測序儀檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計與評估

經(jīng)Illumina HiSeq TM 2500測序平臺進行測序，對父本、母本、白色底色混池和黃色底色混池測序數(shù)據(jù)的reads數(shù)量、Q30和GC含量等進行統(tǒng)計，共獲得37.90 M reads數(shù)據(jù)，測序平均Q30為92.57%，平均GC含量為38.47%，具體結(jié)果見表1。測序質(zhì)量值Q30是評估高通量測序單堿基錯誤率的重要指標(biāo)，測序質(zhì)量值越高對應(yīng)的堿基測序錯誤率越低，本研究中4個樣本的測序質(zhì)量值Q30均在90%以上，說明測序堿基錯誤率低，所獲數(shù)據(jù)合格。

第一，經(jīng)由引導(dǎo)附近人們參與到營造林活動中的方式，有助于增加農(nóng)村就業(yè)機會，促使廣大農(nóng)民可以經(jīng)由投入勞務(wù)的方式獲取相應(yīng)的收入，對更好的維護和諧社會的穩(wěn)定性具有積極意義。第二，經(jīng)由項目建設(shè)，加大力度宣傳以及應(yīng)用多種現(xiàn)代化的經(jīng)濟林高產(chǎn)栽培技術(shù)等，有助于激發(fā)群眾的種植發(fā)展熱情，有助于推進產(chǎn)業(yè)發(fā)展進程。第三，對果樹林實施有效的一次性種植操作，其穩(wěn)產(chǎn)收獲期超過二十年，有助于確保農(nóng)民的收入穩(wěn)定。

表1 樣品測序數(shù)據(jù)評估和SLAF標(biāo)簽統(tǒng)計Table 1 Statistic results of sample sequencing data assessment and SLAF tag

2.2 SLAF標(biāo)簽和SNP標(biāo)記的開發(fā)

剔除各組樣本間的重復(fù)SLAF標(biāo)簽數(shù)，本研究在4組樣本中共開發(fā)出164 874個不同的SLAF標(biāo)簽，SLAF標(biāo)簽親本平均測序深度為42.05×，混池平均測序深度為46.00×。其中父本的測序深度為52.41×，母本的測序深度為31.68×，aa池的平均測序深度為54.17×，ab池的平均測序深度為37.82×。針對所有樣本開發(fā)得到的SLAF標(biāo)簽，根據(jù)等位基因數(shù)和基因序列之間的差異進行多態(tài)性分析，共得到3種類型的SLAF標(biāo)簽：包含SNP/Indel多態(tài)性位點的多態(tài)型SLAF標(biāo)簽、沒有多態(tài)性位點的非多態(tài)性SLAF標(biāo)簽和位于重復(fù)序列區(qū)的SLAF標(biāo)簽。其中多態(tài)性SLAF標(biāo)簽共有21 031個，多態(tài)性比例為12.76%。

2.3 關(guān)聯(lián)分析

根據(jù)親本基因型來源對得到的21 031個多態(tài)性SLAF標(biāo)簽，進行標(biāo)記篩選。過濾親本測序深度5×以下的標(biāo)記，根據(jù)親本的測序信息確定每個標(biāo)記等位基因的親本來源，選取一種基因型來源于父本，另一種基因型來源于母本的多態(tài)性SLAF標(biāo)簽共1 451 個進行后續(xù)的關(guān)聯(lián)分析。通過Δ(SNP_index)的方法，以大于99% Marker的Δ(SNP_index)的值0.745 5作為閾值，篩選出15個與性狀關(guān)聯(lián)程度較顯著的候選標(biāo)記，含27個SNP位點(表2)。根據(jù)15個候選標(biāo)記的擴增序列比對及注釋分析，未能發(fā)現(xiàn)定位于功能基因上的SNP位點。

表2 與蝴蝶蘭花底色性狀關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記Table 2 SNP markers associated with the flower ground color in Phal.

2.4 蝴蝶蘭花部底色相關(guān)SNP分子標(biāo)記的開發(fā)

根據(jù)關(guān)聯(lián)分析獲得的15個標(biāo)記的序列信息和SNP所在位點，過于靠近序列5′端或3′端的SNP位點不能進行有效擴增和檢測，設(shè)計出來自于14個標(biāo)記片段上21個SNP位點的引物，通過對父母本、11個子代代表株和4個不同底色種質(zhì)資源的基因組DNA為模板進行擴增和檢測，篩選出2個引物Marker35886(SNP為擴增序列的第60位堿基)和Marker70907(SNP為擴增序列的第147位堿基)的SNP位點鑒定效果較好(引物序列信息見表3)，在父母本中的SNP檢測結(jié)果與SLAF測序結(jié)果一致，而在其他種質(zhì)資源中的檢測率分別達到 66.67% 和73.33%，2個引物聯(lián)合使用的檢測率達到93.33%，具體檢測結(jié)果見表4。

表3 SNaPshot測序中Marker35886和Marker70907的相關(guān)引物序列信息Table 3 Primer sequences of Marker35886 and Marker70907 used in the SNaPshot

表4 Marker35886和Marker70907在不同種質(zhì)資源中的檢測結(jié)果Table 4 Detection results of Marker35886 and Marker70907 in different germplasm resources

3 討 論

SLAF-BSA技術(shù)能夠克服沒有參考基因組和基因組復(fù)雜等問題，高通量地開發(fā)與復(fù)雜性狀關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記[7]。Ye等[11]通過SLAF-BSA技術(shù)篩選出2個與紫薇矮化性狀高度關(guān)聯(lián)的標(biāo)簽，組合檢測效率可達93%；Li等[9]利用SLAF-BSA技術(shù)篩選到與紅麻第一花節(jié)位緊密相關(guān)的一個SNP位點，檢測效率達到91.2%；Wang等[10]通過SLAF-BSA技術(shù)篩選定位到12個基因與辣椒果實花青素的積累相關(guān)。本研究基于雜交F1代分離群體，利用SLAF-BSA技術(shù)在全基因組范圍上篩選蝴蝶蘭花瓣黃白底色相關(guān)SNP，并在未參與構(gòu)建混池的后代和4個其他種質(zhì)資源中進行驗證，找到2個與蝴蝶蘭黃白底色相關(guān)性較高的SNP位點，聯(lián)合檢測效率達93.33%，說明SLAF-BSA技術(shù)適用于蘭科植物復(fù)雜性狀相關(guān)標(biāo)記篩選。

花色主要由花朵中花青素、類胡蘿卜素及甜菜色素的含量及分布決定[16]，并且還受到色素細胞的pH、金屬離子、輔助色素[17]及花瓣表皮細胞形態(tài)[18]等因素的影響。目前，蝴蝶蘭花朵中主要花色素的合成途徑已較為清楚，關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子陸續(xù)被克隆和研究，但對整體調(diào)控機制的解析仍然很淺。研究發(fā)現(xiàn)，絕大部分花青素合成途徑相關(guān)結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子的表達量在紅色蝴蝶蘭花瓣中都顯著高于白色蝴蝶蘭[19]，UFGT基因與紅花的形成高度相關(guān)[20]，PeMyb2、PeMyb11和PeMyb12的不同表達比例會造成紅色蝴蝶蘭花瓣的不同顏色分布類型，沉默PeMyb2、PeMyb11和PeMyb12會分別導(dǎo)致整體紅色、紅色斑紋和紅色脈絡(luò)的消失[21]。黃色蝴蝶蘭花瓣中F3’H、UF3GT、bHLH的表達量低于紅色蝴蝶蘭花瓣中的表達量，但PAL和PSY的表達量高于紅色蝴蝶蘭花瓣中的表達量[1]。紫色蝴蝶蘭(Phal.schilieriana)花瓣中DFR的表達水平高于白色蝴蝶蘭[22]?；谶@些關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的研究，Sudarsono等[23]

開發(fā)了一系列針對花色相關(guān)基因的SNP引物，并用于30份蝴蝶蘭種質(zhì)資源的聚類分析。但蝴蝶蘭分子標(biāo)記目前主要是用于種質(zhì)資源的親緣關(guān)系鑒定和品種鑒別上[24-25]，很少有能夠與性狀關(guān)聯(lián)的標(biāo)記被開發(fā)出來[4,26]。在對蘭科植物短距手參(Gymnadeniarhellicani)的研究中發(fā)現(xiàn)，SNP多態(tài)性導(dǎo)致一個R2R3-Myb轉(zhuǎn)錄因子提早終止表達，使得其調(diào)控的ANS基因表達量降低，花中紅色花青素減少，從而出現(xiàn)了有別于野生型黑紅色花的淺紅色花和白色花[27]。但基于6個花色相關(guān)結(jié)構(gòu)基因開發(fā)的SNP未能根據(jù)花色將不同顏色的蝴蝶蘭資源區(qū)分開[23]，表明蘭科植物花色形成和調(diào)控機制極其復(fù)雜且具有特異性，花色相關(guān)SNP的篩選不能局限于個別已知相關(guān)基因，需擴大到全基因組范圍內(nèi)進行。

本研究利用SLAF-BSA技術(shù)在全基因組范圍篩選到2個與蝴蝶蘭花瓣黃白底色相關(guān)的SNP標(biāo)記，聯(lián)合檢測效率達93.33%，可作為有效的分子標(biāo)記位點在蝴蝶蘭育種早期進行輔助選擇。這樣的檢測效率在蝴蝶蘭漫長的育種過程中，特別是旨在特定選擇黃色底色或白色底色后代的育種計劃中，是一個可接受的可靠水平。但是，本研究中鑒定出的是連鎖標(biāo)記而不是關(guān)聯(lián)到了關(guān)鍵基因本身的標(biāo)記，在實際育種過程中存在一定的局限性，且本研究采用的雜交群體母本及后代存在斑紋，盡管在構(gòu)建2個不同底色混池的時候采用了斑紋對應(yīng)分離的個體，盡量屏除了斑紋對后續(xù)建庫分析的影響，但仍會在一定程度上影響篩選出的SNP位點與底色的相關(guān)性高低。另外，2個標(biāo)記在雜交后代和其他種質(zhì)資源中的擴增結(jié)果并不完全與SLAF測序結(jié)果一致，表明測序結(jié)果也存在一定技術(shù)層面的錯誤率。針對本研究存在的局限性，也基于蝴蝶蘭花色這一復(fù)雜性狀涉及眾多基因和調(diào)控通路的現(xiàn)狀，在單一雜交群體中篩選的少量相關(guān)SNP位點不能完全代表大量種質(zhì)資源中的多態(tài)性，因此后續(xù)還需引入更多的研究手段對更多的種質(zhì)資源進行分析和驗證，進一步加強相關(guān)研究來完善蝴蝶蘭花部底色關(guān)聯(lián)分析。

4 結(jié) 論

通過對蝴蝶蘭不同花瓣底色的親本和雜交分離后代混池進行SLAF測序，共獲得21 031個多態(tài)性SLAF標(biāo)簽，關(guān)聯(lián)分析篩選出27個與黃白花瓣底色關(guān)聯(lián)性較高的SNP位點，在未參與構(gòu)建混池的后代和4個其他種質(zhì)資源中進行驗證，最終篩選得到2個聯(lián)合檢測效率達93.33%的SNP標(biāo)記，表明SLAF-BSA分析方法可以用于蘭科植物花色等復(fù)雜性狀相關(guān)SNP位點的篩選。