田 琪，盧俊瑞*，謝志強，盧博為，劉金彪

（1.天津理工大學化學化工學院，天津300384；2.南開大學化學學院，天津300071；3.天津大學化工學院，天津300072；4.天津瑞嶺化工有限公司，天津300384）

熒光成像作為一種可視化觀測技術(shù)在小分子檢測方面得到了廣泛應(yīng)用。熒光探針是當今科學和醫(yī)學等領(lǐng)域不可或缺的工具，用于臨床診斷、生物化學、材料科學以及環(huán)境化學等方面。熒光探針的主要作用原理在于以熒光光譜為手段，通過受體與待測物之間的特異性結(jié)合，從而改變熒光基團結(jié)構(gòu)，導致熒光光譜發(fā)生改變。通過觀測這種前后變化就可實現(xiàn)對待測物質(zhì)定性或定量分析。

許多熒光探針的合成可以提高光穩(wěn)定性，并將發(fā)射波長調(diào)諧到紅色或近紅外區(qū)700~1 100 nm，以避免發(fā)射染料的光漂白，加強在熒光成像過程中穿透程度。近紅外分子探針的熒光成像技術(shù)具有背景干擾低、對細胞損傷小、樣品穿透性強、檢測靈敏度好等優(yōu)點，展現(xiàn)了較好的應(yīng)用前景。因此，近紅外熒光染料在生物檢測領(lǐng)域具有許多的優(yōu)勢[1-4]。

熒光探針種類繁多，如香豆素類、萘衍生物類、啡啶吖啶類、熒光素類、羅丹明類等，且均具有優(yōu)良的性能。其中氟硼二吡咯（boron dipyrromethene，BODIPY）類熒光染料的優(yōu)勢較為突出[5]，其基本結(jié)構(gòu)單元具有易于進行化學修飾、熒光量子產(chǎn)率高、摩爾消光系數(shù)高等優(yōu)點[6]，越來越受到人們的關(guān)注。因為熒光探針具有較高的選擇性、高靈敏度、良好的光學穩(wěn)定性等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于生物標記、探針檢測及生物成像。

本文合成出一種新型近紅外BODIPY類熒光探針，通過克腦文蓋爾（Knoevenagel）反應(yīng)延長側(cè)鏈，增強共軛效應(yīng)，使化合物的熒光發(fā)射波長接近700 nm，具有優(yōu)異的光化學性能，有潛力成為一種非常有應(yīng)用前景的BODIPY類熒光探針。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

本實驗所用儀器包括：FL-4500型熒光分光光度計（日本日立公司），UV-3310型紫外可見分光光度計（日本日立公司），BS223S型電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司），德國Bruker 400 MHz型核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）波譜儀（德國Bruker公司），X-4型顯微熔點儀（北京科儀電光儀器公司），溫度計未經(jīng)校正，Waters超高液相色譜高分辨質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-HRMS）儀，層析薄板（天津市江天統(tǒng)一科技有限公司）。

本實驗所用試劑包括：三氟乙酸，三氟化硼乙醚，哌啶，2，4-二甲基吡咯（純度98%，天津希恩思生化科技有限公司），三乙胺（分析純，天津科威化工科技有限公司），溶劑CDCl3-d1，內(nèi)標四甲基硅烷（tetramethylsilane，TMS），1H NMR，13C NMR。

1.2 實驗過程

1.2.1 BODIPY-1的合成

新型BODIPY-1的合成路線如圖1所示。取100 mL三口圓底燒瓶，加入3，5-二溴苯甲醛1 g（3.32 mmol），進行N2置換，避光，加入二氯甲烷（dichloromethane，DCM）和2，4-二甲基吡咯0.75 mL（7.30 mmol），室溫攪拌10 min。隨后加入0.05 mL三氟乙酸。每隔30 min進行薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）分析，待原料消失。除去氮氣保護，加入用10 mL DCM溶解的0.83 g（3.65 mmol）2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌（2，3-dichloro-5，6-dicyano-1，4-benzoquinone，DDQ），繼續(xù)反應(yīng)3 h。在冰浴條件下，加入10.20 mL三乙胺，繼續(xù)攪拌20 min，緩慢滴加12.50 mL三氟化硼乙醚，待反應(yīng)恢復室溫后過夜。水洗，用二氯甲烷萃取，硅膠柱層析（CH2Cl2）得到橙紅色固體0.52 g，收率為51%。

圖1 新型BODIPY-1的合成路線Fig.1 Synthetic route of new BODIPY-1

1.2.2 BODIPY-2的合成

新型BODIPY-2的合成路線如圖2所示。在100 mL單口圓底燒瓶中加入產(chǎn)物1物質(zhì)0.50 g（1.04 mmol）、4-溴苯甲醛0.96 g（5.20 mmol）和對甲苯磺酸0.04 g（0.21 mmol），加入適量哌啶，加熱至120℃，密閉條件下反應(yīng)2 h。水洗，硅膠柱層析（CH2Cl2），得到紫黑色固體0.63 g，收率為74.3%。

圖2 新型BODIPY-2的合成路線Fig.2 Synthetic route of new BODIPY-2

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)條件探索

由于第一步合成BODIPY-1，該反應(yīng)成熟，反應(yīng)條件溫和，收率穩(wěn)定，所以著重針對Knoevenagel反應(yīng)進行研究，分別針對反應(yīng)物的反應(yīng)溫度、物料配比、反應(yīng)時間等條件進行優(yōu)化設(shè)計。首先，反應(yīng)溫度分別設(shè)為90℃、95℃、100℃、110℃、120℃、140℃。哌啶和甲苯高溫易揮發(fā)，為了體系物料保持不變，不影響反應(yīng)進程，因此體系為密閉環(huán)境。在物料配比1∶2∶2的條件下，密閉反應(yīng)2 h，甲苯溶劑中反應(yīng)副產(chǎn)物過多，經(jīng)過優(yōu)化除去甲苯，單獨使用哌啶為溶劑，反應(yīng)收率依次是28.9%、44.3%、57.9%、62.7%、74.3%、65.6%。實驗結(jié)果顯示，該反應(yīng)在120℃時收率最高，則最佳反應(yīng)溫度為120℃。升高溫度收率沒有明顯變化，且副產(chǎn)物增多。

針對反應(yīng)的投配比進行優(yōu)化，反應(yīng)條件篩選如表1所示。投料比對反應(yīng)收率的影響較大，當物料摩爾比為n（1）∶n（醛）=1∶2時，反應(yīng)不完全，原料剩余。當物料摩爾比為n（1）∶n（醛）=1∶2.2時，反應(yīng)收率提高，副產(chǎn)物較少。當物料摩爾比為n（1）∶n（醛）=1∶2.5時，反應(yīng)收率降低，副產(chǎn)物逐漸增多。從經(jīng)濟的角度確定最佳摩爾比為n（1）∶n（醛）=1∶2.2。

另外，考察了時間對反應(yīng)收率的影響，反應(yīng)加熱2 h為最佳反應(yīng)時間，收率達到74.3%，延長反應(yīng)時間收率無明顯提高。因此，最終確定合成BODIPY-2的最佳反應(yīng)條件為：哌啶作為溶劑，BODIPY-1與醛的當量比為n（1）∶n（醛）=1∶2.2，120℃反應(yīng)2 h，如表1所示。

2.2 結(jié)構(gòu)分析

由表2產(chǎn)物1，2的表征數(shù)據(jù)可知，以CDCl3作為氘代溶劑，化合物BODIPY-1，2經(jīng)1H NMR進行了表征。通過化合物BODIPY-1和BODIPY-2兩組氫譜的對比可知，在Knoevenagel反應(yīng)后，化合物BODIPY-1在化學位移2.56上對應(yīng)兩個甲基的單峰消失，并且在芳香區(qū)出現(xiàn)兩組氫，應(yīng)為碳碳雙鍵上的氫。由此可知，共軛結(jié)構(gòu)已形成，從而確認化合物BODIPY-2的結(jié)構(gòu)。

表2 產(chǎn)物1，2的表征數(shù)據(jù)Tab.2 Characterization data of products 1，2

2.3 BODIPY-1，2的紫外和熒光光譜的測定

將BODIPY-1，2溶解于氯仿中，配成濃度為50μM的氯仿溶液，進行紫外-可見吸收光譜和熒光光譜的測定，圖3為BODIPY-1，2在氯仿中的紫外-可見吸收光譜圖，圖4為BODIPY-1，2在氯仿中的熒光光譜圖。

圖3 BODIPY-1，2在氯仿中的紫外-可見吸收光譜圖Fig.3 UV-Vis absorption spectra of BOPDIPY-1，2 in chloroform

圖4 BODIPY-1，2在氯仿中的熒光光譜圖Fig.4 Fluorescence spectra of BOPDIPY-1，2 in chloroform

由圖3可知，BODIPY-1在氯仿中的最大吸收波長λmax為487 nm，而BODIPY-2在氯仿中的最大吸收波長λmax為596 nm，出現(xiàn)明顯的紅移現(xiàn)象。從對實驗現(xiàn)象的觀察可知，固體外觀的顏色從橙色紅變成藍紫色。

將BODIPY-1，2配制成濃度為50μM的氯仿溶液，進行熒光性質(zhì)測試。由圖4可知，BODIPY-1的發(fā)射波長為λEm=552 nm，BODIPY-2的發(fā)射波長為λEm=711 nm，光譜紅移，接近紅外區(qū)域。

3 結(jié)論

本文通過Knoevenagel反應(yīng)對BODIPY類化合物進行修飾，延長側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，合成了一種新型近紅外的BODIPY類熒光探針，并進行了結(jié)構(gòu)驗證。利用紫外熒光測試，探究了探針的光譜性能，發(fā)現(xiàn)共軛效應(yīng)增強，光譜紅移。