楊 明，高瀛政，李 萌，曹 霞，黃新偉

1昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，云南 昆明 650032；2昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，云南 昆明650033

視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs）無(wú)法形成新的突觸，逐漸凋亡或壞死，是視力喪失的主要原因［1］。因此，減緩或抑制RGCs的死亡及促進(jìn)其軸突再生是有效治療視神經(jīng)損傷和促進(jìn)視功能恢復(fù)的重要基礎(chǔ)。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，眼內(nèi)炎癥誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的小分子癌調(diào)蛋白（OCM）具有顯著的促神經(jīng)修復(fù)作用［2-4］。與睫狀神經(jīng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子（CNTF）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDGF）和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）相比，OCM是目前最為有效的促進(jìn)RGC軸突生成的營(yíng)養(yǎng)因子［5］。在視神經(jīng)受損的大鼠眼內(nèi)注入含重組OCM及其增敏劑cAMP類似物的緩釋微粒后，可使RGCs的軸突再生長(zhǎng)度增加5～7倍［3］。因此，OCM是轉(zhuǎn)基因治療視神經(jīng)損傷的理想靶標(biāo)。

單純皰疹病毒（HSV）是一種常見的人類病原微生物，在基因治療方面有著很廣泛的研究［6,7］。新型減毒HSV-1載體具備安全型載體的一系列特點(diǎn)：較低的毒力和體內(nèi)復(fù)制能力。減毒型HSV-1 1716 strain由于刪除神經(jīng)毒力相關(guān)基因γ34.5，其體內(nèi)復(fù)制能力大大減弱；安全的中樞神經(jīng)系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究表明，1716 strain感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)后，不引起顯著的神經(jīng)元功能病變，病毒直接進(jìn)入潛伏感染階段，不表達(dá)任何病毒相關(guān)抗原，從而具備較低免疫原性［8］；潛伏相關(guān)啟動(dòng)子（LAP)介導(dǎo)長(zhǎng)期穩(wěn)定的外源基因表達(dá)。且區(qū)別于目前常用的病毒載體，HSV-1基因組非整合特性使得基因治療更為安全。研究顯示，1716-GUSB 重組病毒能介導(dǎo)模型鼠腦部長(zhǎng)期表達(dá)GUSB，從而顯著緩解葡萄糖貯積癥［9,10］。盡管對(duì)于HSV-1皰癥性角膜炎的研究表明病毒可感染進(jìn)入視網(wǎng)膜，目前尚未有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明減毒型HSV-1載體能夠介導(dǎo)視網(wǎng)膜基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。

本研究通過(guò)構(gòu)建可長(zhǎng)期潛伏表達(dá)外源基因OCM的HSV-1基因治療載體1716-OCM，介導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)再生調(diào)控蛋白OCM表達(dá)，并于大鼠視神經(jīng)機(jī)械性損傷模型中評(píng)價(jià)其對(duì)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活及視覺(jué)電生理功能的有效性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究采用的HSV-1 1716減毒株由賓夕法尼亞大學(xué)Dr.Nigel惠贈(zèng)，基于1716毒株遺傳背景的潛伏表達(dá)OCM毒株（1716-OCM）由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。

1.2 病毒株擴(kuò)增、純化及感染性滴度測(cè)定

所有毒株接種于DMEM完全培養(yǎng)基中的Vero細(xì)胞，感染吸附3～4 h后跟換維持培養(yǎng)液（含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液），繼續(xù)培養(yǎng)3～4 d，待細(xì)胞病變圓起后收集細(xì)胞上清，4000 r/min 離心15 min以去除細(xì)胞碎片。病毒液覆蓋于20%蔗糖溶液后進(jìn)行密度梯度離心。26 000 r/min離心3 h后，用PBS重懸病毒沉淀，分裝后于-80 ℃凍存。采用甲基纖維素噬斑法（1.5%甲基纖維素DMEM 培養(yǎng)液），測(cè)定上述濃縮病毒的感染性滴度，使用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液連續(xù)十倍稀釋病毒液至10-8，以每孔100 μL接種于六孔板Vero細(xì)胞，感染吸附3 h后跟換甲基纖維素噬斑培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4～5 d。1%結(jié)晶紫染色后噬斑計(jì)數(shù)，病毒感染滴度（PFU/mL）記為：10×稀釋度×蝕斑數(shù)。

1.3 1716-OCM重組病毒株體外增殖動(dòng)力及外源基因表達(dá)檢測(cè)

重組病毒株1716-ocm與親本株1716，以及野生型HSV-1（Strain 17+和McKrea）以感染復(fù)數(shù)MOI=0.01接種于六孔Vero細(xì)胞中，病毒吸附3 h后，去除培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞2～3次，跟換新鮮維持液，繼續(xù)培養(yǎng)5 d，每24 h收集上清進(jìn)行噬斑滴定（方法如上）及細(xì)胞形態(tài)觀察。為檢測(cè)病毒即早期基因和晚期基因表達(dá)差異，如上方法接種病毒至Vero細(xì)胞，于感染后6、12、24、48、72 h收集細(xì)胞，trizol 法提取細(xì)胞總RNA 后，一步法qRTPCT 檢測(cè)ICP0（F：ACCACCATGACGACGACTC；R：AGCCCCGTCTCGAACAGT），ICP4（F：ATGGGGTG GCTCCAGAAC；R：CTGCCGGTGATGAAGGAG）及LAT（F：CCAACACAAAAGACCCGCTG；R：CTACA CCAGCCAATCCGTGT）與OCM（F：GGAAGATTG GGGCGGATGAA；R：CTTCGGGGGACTCGGTAA AG）；GAPDH 作為內(nèi)參（F:TCGACAGTCAGCCGC ATCT；R：CCGTTGACTCCGACCTTCA）。為驗(yàn)證重組病毒株1716-ocm外源基因蛋白水平表達(dá)，病毒接種Vero細(xì)胞后進(jìn)行免疫熒光及Western blot檢測(cè)。

1.4 1716-OCM重組病毒株在大鼠眼部基因轉(zhuǎn)導(dǎo)及安全性檢測(cè)

取12周齡大鼠按隨機(jī)數(shù)表法分為3組（對(duì)照組、1716-OCM注射組和野生型病毒角膜感染組）每時(shí)間點(diǎn)3只/組。異氟烷氣體麻醉狀態(tài)下，玻璃體注射重組病毒1716-OCM 105PFU/μL 或?qū)φ誔BS（1 μL）。野生型HSV-1（Strain 17+和Strain McKrea）感染組采用角膜接種方式，5 μL病毒液（102PFU/μL）接種于大鼠眼球表面。病毒接種后（7、14、30 和60 d）分別取眼球，視神經(jīng)，腦組織；冰凍切片后免疫熒光檢測(cè)OCM表達(dá)分布。本研究獲得昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)KMMU2021723。

1.5 大鼠視神經(jīng)損傷模型中驗(yàn)證1716-OCM治療效果

取12周齡SD大鼠，進(jìn)行視網(wǎng)膜鉗夾模型，每治療組設(shè)5只大鼠作為平行重復(fù)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物入組標(biāo)準(zhǔn)為：體質(zhì)量250～300 g、雙眼屈光間質(zhì)清晰、眼底無(wú)病變。異氟烷持續(xù)麻醉狀態(tài)下，進(jìn)行視神經(jīng)夾持損傷模型。選擇傷后無(wú)前房出血、玻璃體出血、視網(wǎng)膜脫落等并發(fā)癥；散瞳檢查眼底無(wú)持續(xù)性缺血（傷后5～10 min血流恢復(fù)）的模型鼠入組。造模大鼠獨(dú)立編號(hào)后，采用隨機(jī)數(shù)表方法分入各組進(jìn)行后續(xù)治療。視神經(jīng)夾持后3 d進(jìn)行玻璃體腔注射重組病毒1716-OCM，2 μL（105PFU/μL）或?qū)φ誔BS。其中1716-OCM-cAMP組需在視神經(jīng)損傷后3、21、42 d于玻璃體腔注射cAMP以增強(qiáng)OCM活性。

功能性評(píng)價(jià)：于治療45 d后進(jìn)行視覺(jué)誘發(fā)電位檢測(cè)（FVEP），從而評(píng)價(jià)視覺(jué)信號(hào)從視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞大腦枕葉皮層的傳導(dǎo)功能。FVEP檢測(cè)方法參照本實(shí)驗(yàn)室前期研究方法［11］。

結(jié)構(gòu)性評(píng)價(jià)：各模型組于治療45 d后；灌注取眼球，制備冰凍切片，采用NeuN抗體標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，采用Immage J軟件定量統(tǒng)計(jì)。取視神經(jīng)全段，制備冰凍切片，采用MBP 抗體標(biāo)記神經(jīng)髓鞘結(jié)構(gòu)，采用Immage J軟件定量統(tǒng)計(jì)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究中數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行。數(shù)據(jù)定量結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析方法，多組樣本間兩兩比較時(shí)采用Tukey's multiple comparisons test。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組病毒1716-OCM體外增殖動(dòng)力及外源基因表達(dá)

相比于野生型毒株（17+strain，McKrea），疫苗株1716 strain具有較高的減毒特性（圖1A）。體外細(xì)胞增殖培養(yǎng)時(shí)，病毒滴度僅為野生型的千分之一；所感染細(xì)胞在更晚時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)CPE病變效應(yīng)（圖1B）。病毒即早期（ICP0,ICP4）和晚期(LAT)基因轉(zhuǎn)錄分析顯示，感染中后期病毒開始轉(zhuǎn)錄潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(LAT)，從而介導(dǎo)構(gòu)建至LAT啟動(dòng)子下的外源治療基因OCM（圖1C、D）。重組疫苗病毒感染Vero細(xì)胞后免疫熒光及Western blot檢測(cè)顯示，其能夠介導(dǎo)OCM與Vero細(xì)胞中適量表達(dá)（圖1E、F）。

圖1 1716-ocm重組病毒增殖動(dòng)力及外源基因表達(dá)驗(yàn)證Fig.1 Proliferation kinetics of the recombinant virus and validation of exogenous gene expression.A:Titration of progeny virus after infection of Vero cells.B:Cytopathic effect of Vero cells infected with different viruses(Original magnification:×200).C,D:ICP0,ICP4 and LAT (OCM) transcription in Vero cells infected with HSV-1 17+strain (C) or the recombinant 1716-OCM (D).E:Immunofluorescence staining of OCM in Vero cells infected with 1716-OCM (scale bar:100 μm).F:Western blotting of OCM expression in Vero cells infected with 1716-OCM.

2.2 1716-OCM重組病毒株在大鼠眼部基因轉(zhuǎn)導(dǎo)

外源基因OCM免疫熒光染色顯示，HSV重組病毒1716-OCM能夠介導(dǎo)外源基因與大鼠視網(wǎng)膜多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)中表達(dá)，包括神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，視網(wǎng)膜色素上皮層，脈絡(luò)膜層及鞏膜；但不能轉(zhuǎn)導(dǎo)內(nèi)核層（圖2）。相比于AAV2，AAV5等常見眼部基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體，1716-OCM玻璃體注射能夠更高效的介導(dǎo)RGC 層細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)，且HSV LAT介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)不僅在感染早期（7 dpi），而且在感染后期（30 dpi）均穩(wěn)定高效表達(dá)外源基因。值得注意的是，病毒接種60 d后，RGC層OCM基因表達(dá)水平明顯下降，但在視網(wǎng)膜外的脈絡(luò)膜及鞏膜區(qū)域表達(dá)仍較為顯著。

圖2 1716-OCM介導(dǎo)大鼠眼部基因轉(zhuǎn)導(dǎo)Fig.2 OCM expressions in the eyes of rata after intravitreal injection of 1716-OCM detected with immunofluorescence staining(Red)(scale bar:200 μm).

2.3 1716-OCM重組病毒株眼部注射的安全性檢測(cè)

由于HSV-1天然具備神經(jīng)嗜性與神經(jīng)毒力，本研究采用疫苗型HSV-1 1716 strain 和野生型KOS，McKrea strain 對(duì)照比較玻璃體接種后的眼部病理變化。野生型HSV-1接種后，可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)白內(nèi)障狀病變，晶體混濁（圖3A、B）?？笻SV包膜蛋白gB免疫熒光顯示，角膜接種的野生型病毒在眼內(nèi)多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)中大量復(fù)制，典型視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)受到破壞（圖3C、D）。而減毒型疫苗株1716感染后，并未檢測(cè)到病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因的表達(dá)；且視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)并未受到明顯損傷，晶狀體清晰。

考到到HSV-1能夠沿神經(jīng)軸突順行/逆行傳播且可能導(dǎo)致腦炎，研究中采用免疫熒光（anti-HSV gB）檢測(cè)視上丘等腦部結(jié)構(gòu)的病毒復(fù)制。野生型HSV-1眼部接種后，病毒可逆行傳播至上丘腦，并產(chǎn)生病理特征（圖3E）。相比之下，減毒型1716-OCM玻璃體腔注射后，腦各區(qū)域均未檢測(cè)病毒復(fù)制及病理現(xiàn)象。

圖3 1716-OCM重組病毒株眼部注射的安全性檢測(cè)Fig.3 Safety test of ocular injection of the recombinant virus1716-OCM.A,B:Representative photographs of rat eyes infected with 1716-OCM (A) or wide-type HSV-1 strain (B).C,D:Immunofluorescence staining of viral gB in the eyes infected with the wide-type HSV-1 strain McKrea (C) and 17+(D).E:Immunofluorescence staining of viral gB expression in the epithalamus of the rats infected with 1716-OCM or the wide-type strain.The neurons were stained in green and gB was stained in red(×200,scale bar:200 μm).

2.4 1716-OCM重組病毒株基因治療在大鼠視神經(jīng)損傷模型中的效果評(píng)價(jià)

視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞顯著減少，這也是目前所認(rèn)為的創(chuàng)傷性視神經(jīng)損傷導(dǎo)致視力受損的主要因素之一（圖4）。在此模型基礎(chǔ)上，進(jìn)行疫苗型HSV 1716-OCM載體治療，以及聯(lián)合眼內(nèi)cAMP注射治療。NeuN陽(yáng)性RGC細(xì)胞免疫熒光染色及統(tǒng)計(jì)分析顯示，疫苗載體介導(dǎo)的OCM基因轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠一定程度促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活（圖4B、C）。

由于機(jī)械性視神經(jīng)損傷可導(dǎo)致視神經(jīng)局部少突膠質(zhì)細(xì)胞等壞死（即脫髓鞘）；且夾持部位視神經(jīng)軸突破碎壞死，并沿神經(jīng)胞體方向退行。本研究采用髓鞘堿性蛋白（MBP）標(biāo)記視神經(jīng)軸突結(jié)構(gòu)，對(duì)比分析HSV-OCM基因治療對(duì)軸突完整性的影響。相比于正常生理狀態(tài)，夾持后受損部位MBP表達(dá)顯著減少（圖5）。免疫熒光定量分析顯示HSV 1716-OCM基因治療聯(lián)合cAMP 眼內(nèi)注射能夠顯著促進(jìn)軸突再生或免于二次退行損傷（圖4B、C）。

圖4 1716-OCM基因治療促進(jìn)視神經(jīng)夾持后RGC存活Fig.4 Gene therapy with 1716-OCM promotes retinal ganglion cell (RGC) survival in rat models of optic nerve injury.A:Immunofluorescence staining of RGCs and viral gB expression in the rat eyes at 45 days posttreatment.B,C:Quantitative analysis of the average fluorescence intensity and number of RGCs using Image J Software.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001.

圖5 1716-OCM基因治療抑制視神經(jīng)脫髓鞘Fig.5 Gene therapy with 1716-OCM inhibits demyelination of the optic nerve.A:Immunofluorescence staining of MBP in rat optic nerve 45 days posttreatment.B,C:Quantitative analysis of average fluorescence intensity (B) and integrated fluorescence intensity(C)of MBP staining using Image J Software.*P<0.05,***P<0.001,****P<0.0001.

視神經(jīng)夾持后大鼠的閃光視覺(jué)誘發(fā)電位（FVEP）模式圖顯著卻別與正常小鼠，其ΔN1-P1峰振幅顯著下降且無(wú)法識(shí)別出典型的P2及P3峰，表現(xiàn)出視覺(jué)電信號(hào)傳導(dǎo)障礙（圖6）。統(tǒng)計(jì)分析顯示，HSV 1716-OCM基因治療聯(lián)合cAMP激活能夠顯著促進(jìn)大鼠ΔN1-P1峰振幅恢復(fù)及P1波延遲縮短，這提示模型鼠視覺(jué)通路修復(fù)（圖6B～D）。

圖6 FVEP檢測(cè)1716-OCM基因治療后大鼠電生理特征Fig.6 Detection of electrophysiological characteristics of rats after 1716-OCM gene therapy by FVEP.A:Representative images of rat FEVP detection.B-D:Quantitative analysis of ΔN1-P1 amplitude (B) and the incubation periods of N1(C)and P1(D)wave.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001.

3 討論

本研究表明基于減毒型HSV-1 1716株的新型載體在大鼠眼部基因治療應(yīng)用中具有較高安全性及有效性。早期研究顯示，核糖核苷酸還原酶缺陷的減毒型HSV-1（hrR3 strain）載體能夠有效介導(dǎo)嚙齒類及靈長(zhǎng)目動(dòng)物眼部基因轉(zhuǎn)導(dǎo)［12,13］。然而，該減毒株在介導(dǎo)眼部基因轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)呈現(xiàn)出較高的復(fù)制能力，病毒可由角膜感染至眼內(nèi)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，虹膜及視網(wǎng)膜色素上皮層［12,13］。這提示hrR3株仍可能表達(dá)關(guān)鍵的神經(jīng)毒力基因γ34.5并擴(kuò)散感染至其他非靶向組織，安全性較低。相較而言，本研究使用的減毒型1716株由于γ34.5-/-突變，在非癌細(xì)胞中缺乏復(fù)制能力，而初次感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)即進(jìn)入潛伏狀態(tài)。此外，減毒型HSV-1 1716-OCM介導(dǎo)的眼部基因治療相比于重組OCM眼內(nèi)注射方式具有理論優(yōu)勢(shì)，其可顯著減少治療所需注射次數(shù)。大鼠模型顯示，單次接種即可維持外源基因表達(dá)持續(xù)至少60 d；相比之下，重組神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子OCM半衰期極短，很難在實(shí)際治療中實(shí)現(xiàn)多次的創(chuàng)傷性眼內(nèi)注射。

對(duì)HSV-1 LAT 突變株的研究表明，敲除野生型HSV-1 LAT能夠顯著抑制病毒重激活能力［14,15］。本研究中我們將治療基因構(gòu)建至病毒潛伏相關(guān)LAP啟動(dòng)子下游，既確保了外源基因在潛伏狀態(tài)下的持續(xù)表達(dá)，同時(shí)也阻斷了病毒LAT轉(zhuǎn)錄本下游區(qū)域的轉(zhuǎn)錄，這進(jìn)一步抑制了病毒重激活的能力。因此，本研究中改造1716-OCM重組病毒比其親本株1716具備更高安全性。我們近期的研究也表明，外源表達(dá)框插入至1716株LAP啟動(dòng)子下游時(shí)，能夠介導(dǎo)外源基因在小鼠海馬區(qū)的長(zhǎng)期安全高效表達(dá)［16］。總之，選擇1716 strain減毒載體構(gòu)建具有長(zhǎng)期表達(dá)外源基因的新型治療載體具有較為廣闊的應(yīng)用前景。

近年來(lái)，HSV-1基因治療載體相關(guān)研究多聚焦于完全復(fù)制缺陷型載體。例如，復(fù)制缺陷性HSV-1可以高效地將外源基因轉(zhuǎn)染至脊髓背根神經(jīng)節(jié)（DRG）或腦內(nèi)并獲得表達(dá)，因此被應(yīng)用于癲癇、慢性疼痛、多發(fā)性硬化癥和缺血性腦損傷等［17-20］。其中復(fù)制缺陷型HSV-1表達(dá)腦啡肽以減輕癌性疼痛的研究已進(jìn)入臨床I期研究［21］。盡管敲除病毒所有即早期基因（ICP0，ICP4，ICP22，ICP27和ICP47）能夠使其完全失去復(fù)制能力，并且不表達(dá)任何病毒相關(guān)基因；但這也導(dǎo)致病毒失去其天然嗜神經(jīng)特性，表現(xiàn)出“泛嗜性”［22-25］。同時(shí)，完全復(fù)制缺陷型載體的構(gòu)建也較為復(fù)雜低效，其僅能夠在相應(yīng)的互補(bǔ)細(xì)胞系中復(fù)制。由于病毒基因具有細(xì)胞毒性（如ICP0），穩(wěn)定表達(dá)這些即早期基因的細(xì)胞系較難構(gòu)建［26］。

然而，本研究尚未明確減毒型1716-OCM載體玻璃體注射后病毒基因組潛伏區(qū)域。對(duì)皰癥性角膜炎潛伏感染的機(jī)制研究顯示，野生型HSV-1角膜感染后可沿視神經(jīng)軸突逆行傳播至面部三叉神經(jīng)節(jié)部位［27,28］。病毒雖感染裂殖部分神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，但隨后進(jìn)入潛伏感染階段［29,30］。本研究中使用HSV-1 1716-OCM疫苗載體進(jìn)行玻璃體腔接種，雖在視網(wǎng)膜RGC，RPE層檢測(cè)到目的基因的長(zhǎng)期表達(dá)，但尚不能確認(rèn)OCM基因產(chǎn)物是三叉神經(jīng)節(jié)潛伏表達(dá)并順行傳導(dǎo)至視網(wǎng)膜區(qū)域，還是視網(wǎng)膜部位的潛伏表達(dá)。后續(xù)研究中，我們將進(jìn)一步明確疫苗型1716-OCM基因載體眼部接種后的病毒感染分子機(jī)制，確認(rèn)其潛伏部位，潛伏時(shí)間，表達(dá)產(chǎn)物順行/逆行軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)現(xiàn)象等。