鄭玉婷，池曉華，齊永帥，江 英，黃 凱，何 云，王思飛，李貴平

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州510515

甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥（HPT）是一種分泌甲狀旁腺激素（PTH）過(guò)多引起機(jī)體鈣、磷失衡的常見內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病，全身可多個(gè)系統(tǒng)受累［1,2］，其中腺瘤（PA）較常見，約占80.0%～85.0%［3,4］，增生（PH）僅占10%～15%，甲狀旁腺癌僅約2.0%～4.0%［5］。甲狀旁腺切除術(shù)對(duì)治愈HPT患者有較大臨床價(jià)值［6］。而術(shù)前準(zhǔn)確定位HPT病灶是確保手術(shù)治療成功的重要因素之一，同時(shí)降低術(shù)后復(fù)發(fā)率，減少術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生［7］。目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)HPT患者術(shù)前定位以頸部超聲、99mTc-MIBI 雙時(shí)相顯像以及SPECT/CT斷層顯像臨床應(yīng)用最廣泛［8-12］，而且大多數(shù)99mTc-MIBI半定量分析選擇在二維平面顯像基礎(chǔ)上勾畫感興趣區(qū)與非感興趣區(qū)，使得半定量分析的研究準(zhǔn)確性存在爭(zhēng)議。文獻(xiàn)報(bào)道其診斷靈敏度結(jié)論不一，影響顯像結(jié)果的因素較多，如病灶大小、術(shù)前血生化水平、嗜酸性細(xì)胞含量［13,14］、多發(fā)病灶［15,16］等，但病理性甲狀旁腺細(xì)胞對(duì)MIBI顯像劑攝取增加的機(jī)制尚不完全清楚，可能與環(huán)氧合酶（Cox）、抗凋亡蛋白（Bcl-2）異常表達(dá)有關(guān)［17］。本研究將回顧性分析經(jīng)外科手術(shù)治療及病理證實(shí)的104例HPT患者臨床資料，評(píng)估三種顯像方式在HPT患者術(shù)前定位中的診斷效能，采用SPECT/CT融合圖像勾畫感興趣獲得三維影像進(jìn)行半定量分析，根據(jù)臨床病理進(jìn)一步闡明甲狀旁腺細(xì)胞表達(dá)Cox、Bcl-2特點(diǎn)。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象與方法

選取2015年1月～2019年7月于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院行甲狀旁腺手術(shù)切除的HPT患者104例，其中男性44例，女性60例；年齡為20～80歲；原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥（PHPT）與繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥（SHPT）患者分別為20例和84例。所有HPT患者均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)；于術(shù)前1月內(nèi)行99mTc-MIBI雙時(shí)相和SPECT/CT檢查以及頸部B超檢查，且檢查前2個(gè)月內(nèi)未曾服用過(guò)非甾體類抗炎藥物（NSAIDs）。收集患者資料，包括一般情況、診療過(guò)程、血生化指標(biāo)、影像學(xué)及病理等資料。根據(jù)臨床病理特點(diǎn)，手術(shù)切除后隨機(jī)選取20例患者共41枚病灶行免疫組化分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)室檢查

所有患者于顯像前一周內(nèi)采集靜脈血測(cè)定甲狀旁腺激素、血清鈣、血清磷、血清堿性磷酸酶、25-羥基維生素D及肌酐水平，并計(jì)算經(jīng)血清白蛋白校正后的血清鈣及鈣磷乘積水平［18］。各項(xiàng)血生化指標(biāo)的正常值范圍如下：Ca為（2.20～2.65）mmol/L，P為（0.81～1.45）mmol/L，PTH為（15～65）pg/mol，Alb為（40～55）g/L，ALP為（50～135）U/L，校正后的血Ca為（2.15～2.55）mmol/L。

1.3 99mTc-MIBI雙時(shí)相及SPECT/CT斷層顯像

1.3.1 顯像方法 顯像儀器：Siemens公司Symbia intevo 16雙探頭SPECT/CT，配置低能高分辨平行孔準(zhǔn)直器。顯像劑：99mTc-MIBI，由廣州市原子高科同位素醫(yī)藥有限公司提供，放化純度大于95%。甲狀旁腺顯像按常規(guī)采用雙時(shí)相法。注射劑量為740 MBq，分別于注射后15 min、2 h在甲狀腺部位采集早期與延遲期影像，并于2 h進(jìn)行頸胸部SPECT/CT斷層顯像。顯像結(jié)果由兩名核醫(yī)學(xué)科有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師獨(dú)立閱片診斷，影像結(jié)果采用視覺分析法判定，同時(shí)將病灶分為4個(gè)象限（左上、左下、右上、右下）。99mTc-MIBI雙時(shí)相顯像“陽(yáng)性”診斷標(biāo)準(zhǔn)：早期相在頸前區(qū)或其他部位見放射性分布濃聚灶，2 h延遲期影像中相應(yīng)部位的放射性攝取高于周圍本底者（圖1A）；此外，2 h延遲期SPECT/CT斷層影像中CT于相應(yīng)位置見軟組織結(jié)節(jié)影并能與周圍甲狀腺組織區(qū)分者也判定為“陽(yáng)性”（圖1B）。

圖1 99mTc-MIBI甲狀腺旁腺顯像Fig.1 99mTc-MIBI imaging of parathyroid gland.A:Abnormal concentration is seen in the inferior pole of the right lobe of the thyroid in99mTc-MIBI DPS.B:A soft tissue nodule is seen in the corresponding parts of the 2-h sectional fusion images on CT;The postoperative pathology was PA.

1.3.2 半定量分析 以術(shù)后病理作為金標(biāo)準(zhǔn)，在斷層融合影像中應(yīng)用計(jì)算機(jī)感興趣區(qū)（ROI）技術(shù)逐層勾畫、計(jì)算得出病灶/同側(cè)三角肌組織相同面積的放射性平均計(jì)數(shù)（T/NT比值）。同時(shí)記錄病灶寬度、長(zhǎng)度和層厚，根據(jù)橢球體積公式估算出病變的大?。翰∽凅w積（mL）=π/6×寬度（cm）×長(zhǎng)度（cm）×層厚（cm）（1 mL=1 g）［8］。

1.4 組織病理學(xué)檢查

1.4.1 HE染色 對(duì)手術(shù)切除病灶行常規(guī)石蠟包埋制片及蘇木精-伊紅（HE）染色，利用NIKON Eclipse-ci光學(xué)顯微鏡及NIKON digital sight DS-FI2成像系統(tǒng)觀察病灶主要增生方式、間質(zhì)脂肪含量、發(fā)生透明樣變、玻璃樣變的情況以及PH病灶實(shí)質(zhì)細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)類型。

1.4.2 免疫組化 用不同比例的二甲苯溶液脫蠟處理石蠟切片，加入pH 6.0 的檸檬酸緩沖液后用PBS（pH=7.4）清洗、修復(fù)抗原?？乖迯?fù)后阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，予酪蛋白封閉。分別加入Cox-2（ab15154，1∶50）及Bcl-2（ab18210，1∶20）抗體孵育。加入二抗（中山金橋pv-6001，即用型）后于室溫中靜止40 min，再次清洗。當(dāng)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色染色適時(shí)停止染色。再次染色、沖洗、脫水，完成封片。

1.4.3 結(jié)果判定 目標(biāo)切片的細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)Bcl-2及Cox-2棕黃色染色判定為陽(yáng)性。每張切片由病理學(xué)醫(yī)師隨機(jī)挑選≥3個(gè)視野觀察（×200倍）并拍照。利用Image-pro plus 6.0（Media Cybernetics,Inc.,Rockville,MD,USA）圖片分析軟件得出每張照片的累積光密度值（IOD）以及相應(yīng)組織的像素面積（AREA）。平均光密度值（areal density=IOD/AREA）越大，表明相應(yīng)標(biāo)志物陽(yáng)性表達(dá)水平越高。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 23.0分析。行Kolmogorov-Smirnov正態(tài)檢驗(yàn)及方差齊性Levene 檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。正態(tài)分布且方差齊者采用參數(shù)檢驗(yàn)，否則采用非參數(shù)檢驗(yàn)或行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后分析。兩種顯像方法靈敏度比較采用卡方檢驗(yàn)，多組比較及組間資料比較用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)進(jìn)行。P<0.05定義為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料及手術(shù)結(jié)果

104例患者平均年齡為48.62±11.49歲，男性44例，女性60例。顯像前PTH水平為1819.42±1097.80 pg/mL、校正后的血清鈣水平為2.65±0.43 mmol/L、血清磷為2.15±1.03 mmol/L。手術(shù)切除348枚病灶，PHPT患者中17例為單發(fā)PA，病理類型以單發(fā)（17/20，85.0%）、腺瘤為主（19/24，79.2%）。84例SHPT患者中2例為單發(fā)病灶，1例手術(shù)切除2枚病灶、6例為3枚病灶、73例患者發(fā)現(xiàn)4枚病灶以及2例5枚病灶的患者，病理類型以多發(fā)（82/84，97.6%）、增生病灶為主（321/324，99.1%）。

2.2 3種影像學(xué)檢查結(jié)果

將99mTc-MIBI SPECT/CT、99mTc-MIBI DPS 與US分別分為真陽(yáng)性與假陰性兩組，三者的診斷靈敏度依次為95.19%（99/104）、91.3%（95/104）、81.71%（67/82），具體見表1。99mTc-MIBI SPECT/CT對(duì)HPT的檢出率高于US，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.69，P=0.004），余檢查方式兩兩之間的檢出率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.79、1.225，P=0.052、0.268）。結(jié)合病理，PH組中99mTc-MIBI SPECT/CT、99mTc-MIBI DPS及US的診斷靈敏度分別為70.4%（228/326）、62.6%（204/326）、52.4%（131/250）。99mTc-MIBI SPECT/CT 較99mTc-MIBI DPS、US 的診斷靈敏度高，差異皆具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。PA組中99mTc-MIBI SPECT/CT、99mTc-MIBI DPS 及US 的診斷靈敏度分別為71.0%（247/348）、64.1%（223/348）、53.0%（143/269），上述3種檢查方式對(duì)PA的診斷效能差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表1 患者、病灶層面99mTc-MIBI SPECT/CT、99mTc-MIBI DPS及US的檢出率Tab.1 Detection rate of99mTc-MIBI SPECT/CT,99mTc-MIBI DPS and ultrasound(US)in different patients and different lesions

2.3 半定量分析結(jié)果

利用ROI勾畫了21枚PA、239枚PH，詳見表2。含脂肪組織的PH 病灶T/NT 比值小于無(wú)脂肪組織病灶（1.23±0.78vs2.21±1.06），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.009）。但病灶的不同病理類型（腺瘤vs增生）及PH的具體位置與T/NT比值皆無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。

表2 病灶T/NT比值的可能影響因素Tab.2 Possible factors affecting T/NT ratio in the lesions

2.4 影響99mTc-MIBI SPECT/CT顯像結(jié)果的相關(guān)因素

根據(jù)臨床病理特點(diǎn)，99mTc-MIBI SPECT/CT顯像結(jié)果分為真陽(yáng)性組與假陰性組，兩組患者的年齡、性別分布差異皆無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。99mTc-MIBI SPECT/CT 顯像真陽(yáng)性組病灶體積較假陰性組大，分別為（2.81±4.44）cm3、（0.71±0.70）cm3，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.754，P=0.00）。

2.5 免疫組化

根據(jù)臨床病理特點(diǎn)，選取20例患者共41枚病灶行HE染色，99mTc-MIBI SPECT/CT真陽(yáng)性組與假陰性分別為18枚、23枚，兩組病灶的優(yōu)勢(shì)細(xì)胞類型及透明樣變發(fā)生率的差異皆沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.87、0.16）。此外，兩組含脂肪組織的病灶分別為8、18枚，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)明顯差異（P=0.07）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)增生腺體中含有脂肪組織的真陽(yáng)性病灶5 枚（45.5%），假陰性占76.2%（16/21），脂肪組織在假陰性組PH病灶中占比明顯高于真陽(yáng)性組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.13，P=0.15）。

PA 病灶中真陽(yáng)性組的Bcl-2 表達(dá)高于假陰性組（0.11±0.03vs0.03±0.02，P=0.046），見圖2，而Cox-2的IOD在上述兩組病灶中分別為0.03±0.03、0.01±0.01，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.338）。PH真陽(yáng)性及假陰性組病灶的Bcl-2 及Cox-2 表達(dá)差異皆無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表3）。利用斯皮爾曼相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)Bcl-2、Cox-2的表達(dá)與病灶T/NT比值亦無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。

圖2 PA病灶Bcl-2的表達(dá)Fig.2 Expression of Bcl-2 in parathyroid adenoma.A:Positive expression in a true positive lesion (Original magnification:×200).B:Positive expression in a false negative lesion(×200).

表3 真陽(yáng)性與假陰性組病灶Bcl-2、Cox-2結(jié)果Tab.3 Bcl-2 and Cox-2 expressions in true positive and false negative PA and PH lesions

3 討論

隨著醫(yī)學(xué)診斷方法的快速發(fā)展，HPT在臨床上的檢出率越來(lái)越高。目前臨床比較常用的影像學(xué)術(shù)前定位手段包括US和放射性核素顯像（包括SPECT/CT及PET/CT等）。超聲檢查安全便捷，但其準(zhǔn)確性高度依賴于操作醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)和業(yè)務(wù)能力［12］，同時(shí)受自身體征（肥胖、頸部粗短等）影響。部分甲狀腺結(jié)節(jié)、淋巴結(jié)等良性結(jié)構(gòu)在超聲檢查中難以鑒別，當(dāng)病灶位于靜止區(qū)（如縱隔和食道后區(qū)或咽后部位）時(shí)，骨骼和空氣阻止了更深層次的結(jié)構(gòu)的可視化，亦可導(dǎo)致超聲的敏感度受限［19］。本文研究結(jié)果表明99mTc-MIBI SPECT/CT診斷靈敏度高于US（χ2=8.688，P=0.004）。尤其在PH腺體中，99mTc-MIBI SPECT/CT對(duì)PH的檢出率明顯高于99mTc-MIBI DPS及US（χ2=3.952、19.001，P=0.047、0.00）。99mTc-MIBI DPS顯像主要依賴延遲相甲狀旁腺病變與甲狀腺實(shí)質(zhì)中顯影劑的不同洗脫率［20］。99mTc-MIBI DPS的空間分辨率低，易受頸部其他組織影響（如周圍組織攝取MIBI增高、排泌延緩等）呈假陰性或假陽(yáng)性。而99mTc-MIBI SPECT/CT一方面能靈敏反映組織器官生理、生化和功能變化，另一方面提供了相應(yīng)腺體的解剖信息，結(jié)合功能與形態(tài)信息，從而降低顯像的誤診率［21,22］。而本文研究結(jié)果表明，99mTc-MIBI SPECT/CT顯像能為PH提供更精確的定位信息。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，患者是否合并甲狀腺疾?。?3］、病灶大小［13,14,24］、嗜酸性細(xì)胞含量［13,14］、病灶血流量［25］、多發(fā)病灶［15,16］及NSAIDs治療史［17］等皆可能影響病灶攝取、洗脫MIBI顯像劑。本研究發(fā)現(xiàn)99mTc-MIBI SPECT/CT顯像真陽(yáng)性的患者術(shù)前PTH 水平高于假陰性患者（P=0.001），前者的病灶體積亦明顯較后者大（P<0.05），與既往研究結(jié)果一致［9,26］。病灶體積越大，99mTc-MIBI顯像攝取增多，99mTc-MIBI SPECT/CT更易檢出。該顯像劑傾向于在富含線粒體的細(xì)胞中積累，而嗜酸性細(xì)胞線粒體含量較主細(xì)胞高［27］，嗜酸性細(xì)胞較少時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致線粒體含量減少、MIBI攝取降低并迅速洗脫［14］。而目前99mTc-MIBI SPECT/CT顯像結(jié)果與嗜酸性細(xì)胞含量的關(guān)系仍存在爭(zhēng)議［13,14］。研究結(jié)果表明病灶的優(yōu)勢(shì)細(xì)胞類型與99mTc-MIBI SPECT/CT顯像結(jié)果無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。但本研究未對(duì)嗜酸性細(xì)胞行定量分析，當(dāng)病灶的各細(xì)胞類型含量差異較小時(shí)可能不足以影響99mTc-MIBI SPECT/CT顯像結(jié)果，此外，可能與選取標(biāo)本數(shù)量偏少有關(guān)。

鑒于99mTc-MIBI雙時(shí)相平面顯像，病灶與正常甲狀腺鑒別困難、多發(fā)腺體定位困難等因素，本研究進(jìn)一步以斷層融合圖像為基礎(chǔ)逐層勾畫ROI，分析表明病灶T/NT比值與體積呈正相關(guān)（r=0.404，P=0.013），而與患者血生化水平無(wú)明顯相關(guān)性。31枚PH病灶中，含脂肪的增生腺體T/NT 比值小于無(wú)脂肪腺體［（1.23±0.78）vs（2.21±1.06），P=0.009］，即脂肪組織的存在影響增生腺體的T/NT比值。此外，PA與PH的T/NT比值差異不顯著（P=0.140），這與Listewnik等［28］在平面圖像中半定量分析的結(jié)果一致，即病灶的T/NT比值在術(shù)前鑒別HPT病灶的病理類型中無(wú)明顯價(jià)值。

文獻(xiàn)報(bào)道99mTc-MIBI SPECT/CT 顯像結(jié)果受NASIDs影響［17］。本研究免疫組化分析表明PA真陽(yáng)性組病灶Bcl-2的表達(dá)高于假陰性病灶（P=0.046），而PA病灶Cox-2的表達(dá)與顯像不相關(guān)（P>0.05）。99mTc-MIBI的攝取是通過(guò)線粒體膜的電梯度差完成的，病變腺體的電位差較正常細(xì)胞增大［29］。細(xì)胞凋亡時(shí)，線粒體膜電位發(fā)生改變，攝取的99mTc-MIBI減少，同時(shí)細(xì)胞破裂使顯像劑從細(xì)胞中流出，導(dǎo)致線粒體中MIBI滯留減少。而抗凋亡蛋白Bcl-2作為線粒體外膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的完整蛋白，能在前列腺素的調(diào)控下，維持線粒體膜電位穩(wěn)定，阻止觸發(fā)細(xì)胞色素C的釋放［30］。當(dāng)病灶表達(dá)Bcl-2增多，能一定程度上減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生從而影響顯像結(jié)果。然而，PH病灶中Bcl-2及Cox-2的表達(dá)皆無(wú)差異。

我們的研究作為一項(xiàng)單中心的回顧性分析，樣本量偏小，在納入患者的選取、部分受技術(shù)限制患者的T/NT比值勾畫方面皆可能對(duì)結(jié)果造成一定影響，故后續(xù)需進(jìn)一步探討、分析。