王婉麗 樊馨 陳雄敏 李婷婷 楊亞彬 李宜航 李光

【摘 要】 甾體總皂苷為倒心盾翅藤抗腎結(jié)石的活性成分，該研究選用菝葜皂苷元為對(duì)照品，以1%茴香醛-硫酸作為顯色劑，建立倒心盾翅藤甾體總皂苷含量測(cè)定方法。分別評(píng)價(jià)了乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)甾體總皂苷得率的影響，并且進(jìn)一步通過(guò)響應(yīng)曲面法優(yōu)選提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、液料比15、提取溫度100 ℃、提取時(shí)間3 h，甾體總皂苷得率為2.37%±0.19%。該提取工藝穩(wěn)定可行，所得甾體總皂苷生物活性明確。

【關(guān)鍵詞】

倒心盾翅藤;甾體總皂苷;比色法;響應(yīng)面設(shè)計(jì)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284.2?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2021）19-0027-05

Optimization of Extraction Technology for Total Saponins in Aspidopterys Obcordata Vines

WANG Wanli1 FAN Xin1 CHEN Xiongmin2 LI Tingting3 YANG Yabin3 LI Yihang4 LI Guang4*

1.Xishuangbanna Vocational and Technical College， Jinghong 666100，China;

2.West Yunnan Universtity of Applied Sciences， Jinghong 666100，China;

3. Peoples hospital of Xishuangbanna Dai autonomous prefecture，Jinghong 666100，China;

4. Yunnan Branch， Institute of Medicinal Plant， Chinese Academy of Medical Sciences， Peking Union Medical College，Jinghong 666100，China

Abstract：

The extracting technology of Total Saponins from Aspidopterys obcordata vines was optimized. Sasaponin was selected as a reference， and 1% anisaldehyde-sulfuric acid was used as a coloring agent to establish a quantitative method for the determination of total saponins of Aspidopterys obcordata vines. The effects of ethanol volume fraction， liquid-to-material ratio， extraction temperature， and extraction time on the yield of total steroidal saponins were respectively evaluated， and the extraction process was further optimized by response surface method as ethanol volume fraction of 50%， liquid-to-material ratio of 15 and extraction temperature of 100 ℃， extraction time 3h， the yield of total steroidal saponin was 2.37%±0.19%. This extraction method can obtain total saponins with clear biological activity， accounting for 2.3% of the quality of medicinal materials， which is stable and feasible.

Key words：

Aspidopterys obcordata vines; Total Steroidal Saponins; Colorimetric Method; Response Surface Design

傣藥倒心盾翅藤為Aspidopterys obcordata HemsL.金虎尾科植物倒心盾翅藤的木質(zhì)藤莖，傣藥名嘿蓋貫，主要分布于越南、緬甸北部、泰國(guó)以及我國(guó)的海南、云南等地，生長(zhǎng)在山地雨林、溝谷雨林及季雨林的林緣、疏林及灌木叢中[1-2]。該藥性澀、涼，有消炎利尿、清熱排石之功效，傣族民間常用于泌尿系炎癥、感染及結(jié)石的治療，也用于產(chǎn)后消瘦，惡露不盡等癥，是傣醫(yī)傳統(tǒng)經(jīng)方“五淋化石膠囊”的主要組方藥材，同時(shí)也是目前傣醫(yī)臨床用量最大的一味藥材[1， 3]。倒心盾翅藤中含有多種類(lèi)型的化學(xué)成分，包括鞣質(zhì)、甾體、酚酸、蒽醌、三萜以及黃酮類(lèi)化合物，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有抗炎、抗腫瘤、抗結(jié)石等多種藥理活性[4-5]。在抗結(jié)石活性的研究中，倒心盾翅藤中甾體總皂苷被逐步證實(shí)是其抗結(jié)石的主要活性成分之一[6-7]。為了更好的滿足防治腎結(jié)石的需求，也是為了充分開(kāi)發(fā)利用倒心盾翅藤植物資源，本研究對(duì)倒心盾翅藤甾體總皂苷的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)提取物活性進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 分析天平（美國(guó)奧豪斯，DV215CD）;小型臺(tái)式組織脫水機(jī)（賽默飛世爾科技，STP 120）;組織包埋機(jī)（賽默飛世爾科技，HISTOSTAR）;全自動(dòng)切片機(jī)（賽默飛世爾科技，HM355S）;染色機(jī)（賽默飛世爾科技，GEMINI AS）;電熱鼓風(fēng)干燥箱（中興，101型）;光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS，BX53）;離心機(jī)（SIGMA，3K15）;電熱恒溫水浴鍋（北京永光明醫(yī)療器械有限公司，DZKW-S-6）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI Labortechnik AG，R-210）;超聲清洗機(jī)（寧波科技園區(qū)新江南儀器有限公司，JN-500DT）;真空泵（萊伯泰科，VP50）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥材與試劑 倒心盾翅藤藥材飲片購(gòu)于西雙版納傣族自治州傣醫(yī)醫(yī)院，保存于樣品室，提取前粉碎過(guò)篩。菝葜皂苷元（中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，批號(hào)：MUST-18081402，純度：99.57%）;茴香醛（阿達(dá)瑪斯，批號(hào)：P1438355，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：99%以上）;無(wú)水乙醇（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）;甲醇（分析純，天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）;硫酸（分析純，重慶川東化工有限公司）;水為自制純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 甾體總皂苷的測(cè)定方法

2.1.1 工作溶液的配制 樣品溶液：倒心盾翅藤粉末加乙醇回流提取，濃縮、干燥，即得樣品。精密稱(chēng)取樣品適量，加甲醇，配制成1 mg·mL-1的供試品溶液。對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)取菝葜皂苷元對(duì)照品加甲醇溶解定容，配制成0.2 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。顯色劑：取8 mL甲醇至10 mL棕色容量瓶中，加入1 mL濃硫酸，冷卻至室溫， 加100 μL茴香醛， 搖勻，即得1%茴香醛-硫酸顯色劑[8-9]。

2.1.2 線性關(guān)系考察 取1 mL對(duì)照品溶液揮干，加入4 mL顯色劑，置100 ℃水浴中保溫20 min，冰水浴10 min，補(bǔ)加顯色劑至10 mL，以甲醇做空白對(duì)照于380～800 nm波長(zhǎng)進(jìn)行掃描[8-10]。菝葜皂苷元在428.5 nm處有最大吸收峰，選擇 428.5 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

分別精密吸取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL揮干，顯色后于428.5 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)，甾體總皂苷濃度為縱坐標(biāo)，計(jì)算得到回歸方程為：y=0.3686x - 0.012，R2=0.9966，線性范圍0.04088～0.4088。

2.2 單因素試驗(yàn)考察及結(jié)果

2.2.1 考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總皂苷得率的影響 選擇液料比為11.5、提取溫度為75 ℃、提取時(shí)間為1.5 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為35%、50%、65%、80%、95%、100%，加熱提取后濃縮回收乙醇，測(cè)定皂苷含量，計(jì)算得率。乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，總皂苷得率最高，為2.15%。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)50%以后，總皂苷得率開(kāi)始下降，故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%最佳，見(jiàn)圖1。

2.2.2 考察液料比對(duì)總皂苷得率的影響 在乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%、75 ℃、提取1.5 h條件下，液料比分別為4.5、8、11.5、15、18.5、22進(jìn)行提取，比較總皂苷得率。隨著液料比增大，總皂苷得率總體呈上升趨勢(shì)，液料比達(dá)到22時(shí)，總皂苷得率2.44%?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)中成本的投入與產(chǎn)率，故選擇液料選擇15最佳，見(jiàn)圖2。

2.2.3 考察提取溫度對(duì)總皂苷得率的影響 使用65%乙醇、液料比為11.5，分別在75 ℃、85 ℃、95 ℃、100 ℃下回流提取1.5 h，比較總皂苷得率。隨著提取溫度的升高，總皂苷得率呈上升趨勢(shì)。100 ℃時(shí)，總皂苷得率達(dá)到最高，為2.21%，見(jiàn)圖3。

2.2.4 考察提取時(shí)間對(duì)總皂苷得率的影響 選擇65%乙醇、液料比為11.5、75 ℃分別提取1、2、3 h，計(jì)算總皂苷得率如圖4所示。隨著提取時(shí)間增加，總皂苷得率不斷增加，達(dá)到3 h時(shí)總皂苷得率為1.77%。在實(shí)際生產(chǎn)中考慮到成本的生產(chǎn)效率，故提取時(shí)間選擇3 h。如圖4所示。

2.3 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)選提取工藝及結(jié)果 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行4因素3水平設(shè)計(jì)，采用Design Expert 10軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。選取甾體總皂苷得率作為響應(yīng)值，乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、提取溫度（C）、提取時(shí)間（D）自變量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。

對(duì)表1和表2中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合分析，得到倒心盾翅藤中甾體總皂苷提取工藝參數(shù)回歸方程為： Y=1.43-0.50A+0.079B+0.21C+0.034D+0.37AB-0.21AC+0.018AD+0.37BC+0.095BD+0.084CD?；貧w模型的P值=0.0008（P<0.01），差異顯著，且失擬項(xiàng)P值=0.7412（P>0.05），差異不顯著，決定系數(shù)R2=0.7575，表明無(wú)失擬因素存在，方程與試驗(yàn)擬合度較好，可用于倒心盾翅藤中總甾體總皂苷提取。見(jiàn)表2。

回歸方程各項(xiàng)方差分析表明4個(gè)影響因素對(duì)倒心盾翅藤中甾體總皂苷含量影響的大小順序依次為：乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取溫度>液料比>提取時(shí)間，方程一次項(xiàng)（A、C）和交互項(xiàng)（AB、BC）影響都是顯著的（P<0.05），方程一次項(xiàng)（B、D）和交互項(xiàng)（AC、AD、BD、CD）影響不顯著（P>0.05）。

各因素兩兩交互作用對(duì)總皂苷含量的影響的3D響應(yīng)曲面圖如圖5所示，乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度、液料比和提取溫度響應(yīng)曲面圖等高線呈橢圓形，表明兩因素之間交互作用顯著;而提取溫度和提取時(shí)間、液料比和提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間兩因素之間的交互作用不顯著。該結(jié)果與回歸方程方差分析結(jié)果一致。

根據(jù)回歸模型最優(yōu)組合分析，最優(yōu)提取工藝參數(shù)為： 乙醇體積分?jǐn)?shù)50.28%、液料比15、提取溫度99.99℃、提取時(shí)間3h，其倒心盾翅藤中甾體總皂苷得率預(yù)測(cè)值為2.43%。根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整最優(yōu)提取工藝參數(shù)為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、液料比15、提取溫度100 ℃、提取時(shí)間3 h進(jìn)行倒心盾翅藤中甾體總皂苷提取驗(yàn)證試驗(yàn)，3次平行試驗(yàn)實(shí)際測(cè)得的甾體總皂苷平均得率為2.37%±0.19%，與模型理論預(yù)測(cè)值之間的相對(duì)誤差為1.65%，表明所得結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.4 倒心盾翅藤總皂苷生物活性驗(yàn) 人腎小管上皮細(xì)胞HK-2復(fù)蘇后，完全MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃，5% CO2濃度的培養(yǎng)箱內(nèi)，每3天換液一次。細(xì)胞生長(zhǎng)至85%以上密度時(shí)胰酶消化傳代，接種到96孔板中，每孔4000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。吸出培養(yǎng)基，加入含有一水草酸鈣結(jié)晶和倒心盾翅藤總皂苷的無(wú)血清MEM培養(yǎng)基100 μL，每孔一水草酸鈣含量為28 μg·cm-2，給藥組倒心盾翅藤總皂苷含量分別為1.56，3.12，6.25，12.5，25.0μg·mL-1，每個(gè)劑量設(shè)置3個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照孔加入等體積無(wú)血清MEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，小心移除培養(yǎng)基，每孔加入CCK-8試劑10 μL，繼續(xù)孵育4 h后，酶標(biāo)儀中450 nm處測(cè)定OD值。計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率：各組OD值/空白組OD值×100%。結(jié)果采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示，各組間的比較采用單因素方差分析法，以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，倒心盾翅藤總皂苷在1.56～25.0μg·mL-1范圍內(nèi)可以明顯減輕由草酸鈣結(jié)晶引起的HK-2細(xì)胞的損傷，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。這表明，上述工藝獲得的總皂苷可通過(guò)減少腎小管上皮細(xì)胞損傷抑制結(jié)石成分的黏附，具有防治腎結(jié)石的生物活性。

3 討論

皂苷是糖的衍生物，非糖的部分稱(chēng)為苷元。甾體皂苷的苷元部分是螺甾烷的衍生物，主要分布薯蕷科、百合科等植物中，具有抗腫瘤、降血脂、降血糖、抗炎、抗血栓、增強(qiáng)免疫、抗菌等多種功效[11]。倒心盾翅藤中的甾體皂苷成分也是其治療腎結(jié)石有效成分之一。甾體皂苷的檢測(cè)方法通常有分光光度法和高效液相法。為了優(yōu)化提取工藝，本研究首先建立了倒心盾翅藤甾體皂苷成分的檢測(cè)方法。因倒心盾翅藤甾體皂苷成分在液相色譜儀的紫外檢測(cè)器和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器中均無(wú)吸收峰，因此采用了分光光度法。分別測(cè)試了濃硫酸-甲醇、茴香醛-硫酸、香草醛冰乙酸三種顯色試劑，確定經(jīng)過(guò)1%茴香醛-硫酸顯色結(jié)果較好[9， 12-13]。顯色后，菝葜皂苷元和受試樣品在428.5 nm處有吸收，據(jù)此建立了較為可靠的倒心盾翅藤甾體皂苷比色定量方法。

甾體皂苷提取工藝包括冷浸提取、加熱提取、超聲輔助提取、微波輔助提取、酶法輔助提取等多種形式。本研究中應(yīng)用的是加熱提取法，符合工廠生產(chǎn)的常規(guī)工藝，并優(yōu)選了乙醇和水作為提取溶劑，避免了有機(jī)試劑的殘留。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)選倒心盾翅藤甾體皂苷的提取方法，作為響應(yīng)曲面試驗(yàn)的因素水平，通過(guò) Box- Behnken 響應(yīng)曲面法考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)皂苷得率的影響，確定了最佳的提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、液料比15、提取溫度100 ℃、提取時(shí)間3 h，該條件下甾體總皂苷得率為2.37%±0.19%，與模型預(yù)測(cè)值相符。所獲得的皂苷經(jīng)過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，具有抗腎結(jié)石的生物活性。本研究提出的倒心盾翅藤甾體皂苷提取工藝穩(wěn)定可行，所獲得產(chǎn)物藥理活性較為明確，為倒心盾翅藤的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了參考。

參考文獻(xiàn)

[1]李海濤，彭朝忠，管燕紅，等. 傣藥倒心盾翅藤資源調(diào)查[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22（12）：2999-3000.

[2]張祎，韓玉，郝謎謎，等. 傣藥倒心盾翅藤的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2020，385（20）：68-72.

[3]李曉花，牛迎鳳，元超，等. 傣藥倒心盾翅藤化學(xué)成分預(yù)實(shí)驗(yàn)[J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，20（5）：17-21.

[4]HU M G，LI Y H，? SUN Z C， et al. New polyoxypregnane glycosides from Aspidopterys obcordata vines with antitumor activity[J]. Fitoterapia，2018（129）：203-209.

[5]張婭，項(xiàng)朋志，高敏，等. 傣藥嘿蓋貫不同提取物對(duì)小鼠耳廓腫脹抑制作用的研究[J]. 云南中醫(yī)中藥雜志，2019，40（7）：69-70.

[6]宋美芳，李宜航，李學(xué)蘭，等. 倒心盾翅藤對(duì)腎小管上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016，35（3）：249-252.

[7]LI Y， MA G， Lü Y， et al. Efficacy of Obcordata A from Aspidopterys obcordata on Kidney Stones by Inhibiting NOX4 Expression[J]. Molecules，2019，24（10）：1957.

[8]趙建華，宋擎，汪素芳，等. 蘆筍總皂苷含量測(cè)定的比色法研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20（8）：1962-1964.

[9]祁雅雯，王榮，趙秋琳，等. 黑刺菝葜中6-酮型甾體皂苷含量測(cè)定方法[J]. 北方園藝，2017（1）：107-113.

[10]白云杰，劉鳳，張春圓，等. 甾體皂苷分離純化和含量測(cè)定方法研究進(jìn)展[J]. 飲料工業(yè)，2017，20（4）：51-54.

[11]左月明，王亞芳，張忠立，等. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化回流提取延齡草甾體皂苷工藝研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2020，31（1）：55-57.

[12]張小鴻，吳楊崢，徐先祥. 不同顯色劑對(duì)牛膝總皂苷含量測(cè)定的影響[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（21）：113-116.

[13]鄧雅婷，劉莉，劉美佑，等. 不同顯色劑對(duì)續(xù)斷皂苷含量測(cè)定的影響[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22（11）：2586-2587.

（收稿日期：2021-02-05 編輯：劉斌）