姜 偉,郭明佳,吳樹康
(龍口市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,山東省龍口市 265701)
貓細(xì)小病毒(feline parvovirus,F(xiàn)PV)又被稱為貓泛白細(xì)胞減少癥病毒(feline panleukopenia virus),是一種可以感染貓科、浣熊科及鼬科等多種動(dòng)物的急性、致死性烈性傳染病病原[1]。該病原主要通過帶毒的糞便、尿液及口腔分泌物傳播,可以導(dǎo)致感染動(dòng)物出現(xiàn)體溫升高、嘔吐、腹瀉及白細(xì)胞數(shù)量嚴(yán)重減少等多種臨床癥狀,且小型貓科動(dòng)物對(duì)其易感性最高[2]。
FPV 屬于細(xì)小病毒科(Paroviridae)細(xì)小病毒屬(Parvovrius),是無囊膜的單股正鏈DNA 病毒,其基因組主要有兩個(gè)開放閱讀框(open reading frame,ORF)組成,其中右側(cè)ORF 編碼重要的病毒結(jié)構(gòu)蛋白——VP1 和VP2[3]。FPV 衣殼主要由VP2 結(jié)構(gòu)蛋白組成,其含量可高達(dá)90%。同時(shí),VP2 結(jié)構(gòu)蛋白也是FPV 的主要抗原蛋白及受體結(jié)合蛋白,可以有效刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)FPV 的中和抗體并影響其致病性、宿主范圍及血凝活性等多種生物學(xué)特性[4-5]。
因此,本研究通過對(duì)龍口市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心分離保存的FPV 毒株(SD-01)VP2基因進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析,了解VP2 蛋白的分子特點(diǎn)及變異規(guī)律,以期為后續(xù)疫苗及診斷試劑盒研發(fā)提供參考及理論依據(jù)。
全基因組DNA 提取試劑盒(D1800)、質(zhì)粒小量提取試劑盒(D1100),購(gòu)自于北京索萊寶科技有限公司;DL 2 000 DNA Marker(3427A)、DH5α 感受態(tài)細(xì)胞(9057)、pMD18-T(6011),購(gòu)自于寶生物工程(大連)有限公司;EasyTaqDNA Polymerase(AP111)酶,購(gòu)自于北京全式金生物技術(shù)有限公司。
FPV 毒株(SD-01)由龍口市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心從2021 年5 月山東省龍口市采集病料中分離鑒定及保存。
1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參照GeneBank 中公布的FPV 全基因組序列(登錄號(hào)MT614366),使用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)1 對(duì)引物用于擴(kuò)增SD-01 毒株的VP2基因及其兩端非編碼區(qū)(上游引物序列:5'-aagtaaaaagagacaatcttgcacca-3';下游引物序列:5'-catacttactatgtttttatg-3'),預(yù)期擴(kuò)增目的片段大小約為1 755 bp。引物序列送至上海生工生物工程有限公司合成。
1.3.2VP2基因克隆及序列分析 參考說明書使用全基因組DNA 提取試劑盒提取SD-01 毒株的全基因組DNA,然后以此為模板使用1.3.1 中設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系:EasyTaqDNA Polymerase 25.0 μL,上、下游引物各2.5 μL,DNA 模板2.0 μL,DEPC 水補(bǔ)足50.0 μL。PCR 反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共35 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。使用1.0%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè),并使用膠回收試劑盒回收PCR 陽(yáng)性產(chǎn)物,將回收產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆?。將回收的擴(kuò)增片段與pMD18-T 載體連接。連接體系:5.0 μL Solution、4.5 μL 膠回收產(chǎn)物、0.5 μL pMD18-T 載體,16 ℃連接30 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞后涂布于含有氨芐青霉素的LB 固體培養(yǎng)基,37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h,挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)并進(jìn)行菌液鑒定。將菌液鑒定陽(yáng)性的樣品送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序,并參考NCBI 上公布的FPVVP2基因序列,以犬細(xì)小病毒(CPV)毒株作為對(duì)照,使用DNAstar 及Mega 5.0[6]軟件進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建發(fā)育進(jìn)化樹。參考序列詳情見表1。
表1 NCBI 上公布的參考毒株VP2 基因序列信息
1.3.3VP2基因生物信息學(xué)分析 使用多種軟件對(duì)FPVVP2基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,具體軟件見表2。
表2 本研究所使用的生物信息學(xué)工具
以1.3.2 中提取的SD-01 株DNA 為模板,1.3.1 中設(shè)計(jì)的序列為引物,成功擴(kuò)增出片段大小為1 755 bp 的PCR 產(chǎn)物,與預(yù)期結(jié)果一致。將PCR 產(chǎn)物回收后連接至pMD18-T 載體上,進(jìn)行菌液鑒定后送至生物公司進(jìn)行測(cè)序,并將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST 比對(duì)。比對(duì)結(jié)果顯示,擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為FPVVP2基因,并成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒,將其命名為pMD18-T-FPV SD-01-VP2。
從GeneBank 中下載已公布的國(guó)內(nèi)FPV 毒株序列及部分國(guó)外代表株序列(表1),使用DNAstar 和Mega 5.0 軟件,對(duì)SD-01 株及其他FPV 毒株的VP2 蛋白進(jìn)行氨基酸同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。氨基酸同源性比對(duì)結(jié)果顯示,SD-01 株VP2 蛋白與其他FPV 株VP2 蛋白相比,氨基酸同源性為99.0%~100%,與CPV 參考序列VP2 蛋白的氨基酸同源性為97.9%~98.1%(圖2)。氨基酸序列進(jìn)化樹結(jié)果顯示,SD-01 株VP2基因與其他FPV 毒株的VP2基因處于同一個(gè)大分支,且與葡萄牙分離株P(guān)T09 的親緣關(guān)系最為相近(圖3)。
圖1 FPV SD-01 株VP2 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果
圖2 SD-01 株VP2 基因氨基酸同源性分析結(jié)果
圖3 SD-01 株VP2 基因氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹
使用在線軟件Prot-Param 對(duì)SD-01 株VP2蛋白的基本理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)[5]。結(jié)果顯示:VP2 蛋白共由584 個(gè)氨基酸組成,其分子式為C2884H4357N785O882S17,共含有8 925 個(gè)原子,理論相對(duì)分子質(zhì)量為64 683.07 u;含有56 個(gè)負(fù)電荷氨基酸殘基,44 個(gè)正電荷氨基酸殘基,理論等電點(diǎn)為5.44;理論的不穩(wěn)定系數(shù)為27.80,屬于穩(wěn)定蛋白。蛋白的親疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果為-0.508,表明VP2 蛋白可能為親水性蛋白。
使用在線軟件SignalP-5.0 和TMHMM Server v.2.0,預(yù)測(cè)SD-01 株VP2 蛋白信號(hào)肽和跨膜區(qū)域,發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽預(yù)測(cè)值為0.002(圖4),表明VP2 蛋白無信號(hào)肽區(qū)域,推測(cè)其可能為非分泌型蛋白。跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果(圖5)顯示,VP2 蛋白可能為非跨膜蛋白,且主要定位于膜外區(qū)域。
圖4 SD-01 株VP2 蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果
圖5 SD-01 株VP2 蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果
應(yīng)用SOPMA 軟件和SWISS-Model 數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)SD-01 株VP2 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果(圖6)顯示,VP2 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有51 個(gè)α 螺旋(藍(lán)色)、143 個(gè)延伸鏈(紅色)、25 個(gè)β 轉(zhuǎn)角(綠色)和365 個(gè)無特定結(jié)構(gòu)的卷曲(橘色),分別占二級(jí)結(jié)構(gòu)的8.7%、24.5%、4.3%和62.5%。SWISS-Model 同源建模結(jié)果(圖7)顯示,VP2 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)中,以無規(guī)則卷曲為主,該結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。
圖6 SD-01 株VP2 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果
圖7 SD-01 株VP2 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果
使用在線軟件TargetP 1.1 和PSORT II Prediction,對(duì)FPV SD-01 株VP2 蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示:VP2 蛋白不含有線粒體導(dǎo)肽(mTP)或分泌通道信號(hào)肽(SP);VP2 蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的概率較高,分別為47.8%和26.1%;定位在線粒體、細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞骨架的可能較低,分別為17.4%、4.3%和4.3%。同時(shí),VP2 蛋白的C 端含有一個(gè)過氧化物酶靶向信號(hào),可能會(huì)被過氧化物酶識(shí)別從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。
采用在線軟件Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0,對(duì)VP2 蛋白的B 細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè),并結(jié)合蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、表面可及性及抗原指數(shù)性等因素,預(yù)測(cè)VP2 蛋白可能存11 個(gè)氨基酸數(shù)目大于7 的抗原表位,分別為4~56、86~99、156~167、213~239、270~279、294~315、322~328、337~445、507~520、551~562 和574~580,抗原趨勢(shì)最高值為0.681,是位于第18位氨基酸殘基精氨酸上(表3、圖8)。
表3 SD-01 株VP2 蛋白B 細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果
圖8 SD-01 株VP2 蛋白的B 細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果
本研究采用多種蛋白翻譯后修飾預(yù)測(cè)軟件(NetPhos 3.1、NetOGlyc 4.0、NetNGlyc 1.0),對(duì)FPV VP2 蛋白進(jìn)行修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示:VP2 蛋白可能存在49 個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn),其中絲氨酸(S)12個(gè)、酪氨酸(T)9個(gè)、蘇氨酸28個(gè)(圖9);6 個(gè)N-糖基化修飾位點(diǎn),分別為第25、47、64、180、443、505 位(圖10);21 個(gè)O-糖基化修飾位點(diǎn),分別為第2、21、23、27、41、221、223、225、226、228、230、348、349、355、388、389、390、391、394、399、433 位。這些修飾位點(diǎn)在FPV VP2 蛋白內(nèi)高度保守,因此推測(cè)這些位點(diǎn)可能影響了VP2 蛋白的構(gòu)象或生物學(xué)功能。
圖9 SD-01 株VP2 蛋白的磷酸化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果
圖10 SD-01 株VP2 蛋白的N-糖基化修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果
無囊膜病毒主要由衣殼蛋白及遺傳物質(zhì)組成。其中衣殼蛋白在無囊膜病毒感染細(xì)胞及其復(fù)制過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,影響著病毒的宿主嗜性、細(xì)胞敏感性、致病性以及對(duì)宿主天然免疫的拮抗能力。同時(shí),衣殼蛋白也是無囊膜病毒的重要抗原蛋白,具有良好的免疫原性,可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的細(xì)胞免疫和體液免疫。FPV 衣殼蛋白主要由結(jié)構(gòu)蛋白VP1 和VP2 組成。VP1 雖占衣殼蛋白的總量不高,不足15%,但其是產(chǎn)生具有感染性病毒粒子的必要組分[7]。VP2 蛋白是衣殼蛋白的主要成分,其含量占衣殼蛋白的80%以上,同時(shí)也是FPV 主要的抗原蛋白,可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的中和抗體[8]。同時(shí),VP2 蛋白也是面對(duì)宿主壓力重要的變異蛋白,因此對(duì)細(xì)小病毒的遺傳進(jìn)化分析主要是針對(duì)VP2 蛋白。
本研究克隆了FPV SD-01 株的VP2基因,測(cè)序得知VP2基因全長(zhǎng)為1755 bp,共編碼584 個(gè)氨基酸。根據(jù)VP2 蛋白氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可知,分離毒株SD-01 雖為國(guó)內(nèi)分離株,但在親緣關(guān)系上與葡萄牙分離株P(guān)T09 更為接近,而PT09 株分離時(shí)間較早,因此推測(cè)SD-01 株可能是從國(guó)外傳播到國(guó)內(nèi)的。目前CPV 雖有多種亞型的報(bào)道,且新亞型有取代傳統(tǒng)亞型成為主要流行毒株的趨勢(shì),但是關(guān)于FPV 亞型的分類還未見到相關(guān)報(bào)道[9-11]。本研究構(gòu)建的FPV VP2 蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示,所有FPV 毒株位于一個(gè)大分支上,但除了少數(shù)毒株外,大部分FPV 毒株又可被分為3 個(gè)小分支。由此推測(cè)在宿主和免疫的雙重壓力下,F(xiàn)PV有進(jìn)一步進(jìn)化從而產(chǎn)生亞型分化的趨勢(shì),所以臨床上要加強(qiáng)對(duì)FPV 的流行病學(xué)監(jiān)測(cè),以便在新變異亞型出現(xiàn)時(shí)可以快速應(yīng)對(duì)。
通過對(duì)SD-01 株VP2 蛋白的理化性質(zhì)及高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析可知,VP2 蛋白為親水性非分泌性蛋白,沒有跨膜區(qū),因此推測(cè)大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒、真核細(xì)胞等多種表達(dá)系統(tǒng)都可被用于高效表達(dá)VP2 蛋白。VP2 蛋白上有兩個(gè)主要的抗原決定簇A 和B,其中決定簇A 由第93、222、224、426 位氨基酸殘基組成,B 由第299、300、302 位氨基酸殘基組成[12]。通過對(duì)SD-01 株VP2 蛋白的B 細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)可知,這兩個(gè)抗原決定簇都位于SD-01 株VP2 蛋白的B 細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位內(nèi),且SD-01 株VP2 蛋白的兩個(gè)抗原決定簇與疫苗株一致,因此推測(cè)疫苗株可以給動(dòng)物提供針對(duì)SD-01 株的有效保護(hù)。
FPV、CPV、豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus,PPV)及小鼠細(xì)小病毒(mouse parvovirus,MPV)等均屬于細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬。根據(jù)遺傳進(jìn)化分析可知,F(xiàn)PV 與CPV 親緣關(guān)系最為接近,與PPV 親緣關(guān)系次之,而與其他細(xì)小病毒親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。通過比較FPV 及其他細(xì)小病毒VP2 的生物信息學(xué)差異發(fā)現(xiàn),不同動(dòng)物源細(xì)小病毒的VP2 蛋白氨基酸序列存在差異,但生理生化性質(zhì)較為相似,均為親水性無跨膜區(qū)的穩(wěn)定蛋白。蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn),不同種細(xì)小病毒VP2 蛋白均主要由無規(guī)則卷曲組成,α 螺旋及β 折疊所占比重較小,且三級(jí)結(jié)構(gòu)高度一致。除氨基酸序列本身,蛋白翻譯后修飾同樣對(duì)抗原的免疫原性有著重要作用,通過比對(duì)不同細(xì)小病毒 VP2 蛋白的重要抗原表位及潛在翻譯后修飾位點(diǎn),可見不同細(xì)小病毒的VP2 蛋白存在部分一致的蛋白翻譯后修飾位點(diǎn),但抗原表位仍具有明顯差異。比較不同細(xì)小病毒VP2 蛋白的生物信息學(xué)差異,有利于更好地研究VP2 蛋白在不同細(xì)小病毒進(jìn)化過程中所發(fā)揮的作用,為廣譜的抗細(xì)小病毒藥物及分子制劑篩選及研發(fā)奠定基礎(chǔ)。