武乃雯，陳 鵬，朱春燕，劉 凱 , 程 佳，周 曼，韓 博，高 健

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193；2.上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，上海 青浦 201708；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201)

奶牛乳房炎與營養(yǎng)代謝病、肢蹄病并稱奶牛三大疾病，雖不造成大批畜群死亡，但對奶牛養(yǎng)殖業(yè)的影響不可忽視。一方面使用抗生素造成的棄奶、治療產(chǎn)生的費用和隨之而來的淘汰率影響?zhàn)B殖收益，另一方面使奶牛的生產(chǎn)性能降低，原料奶品質(zhì)受損，甚至危害人類健康。

無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae，S.agalactiae)屬于革蘭陽性B群鏈球菌，是導(dǎo)致奶牛乳房炎的主要病原菌，分離率較高[1]。無乳鏈球菌引起的乳房炎通常表現(xiàn)為隱性乳房炎或較為溫和的臨床型乳房炎，通常表現(xiàn)為乳房腫脹，偶有全身發(fā)熱、泌乳停止等現(xiàn)象，故較難診斷而導(dǎo)致慢性感染，危害極大[2]。無乳鏈球菌是造成大罐奶體細胞數(shù)上升(>20萬個/mL)的主要致病菌，甚至在某些奶牛場的大罐奶體細胞數(shù)為10萬個/mL時也能檢測出無乳鏈球菌[3]。無乳鏈球菌性乳房炎在經(jīng)濟上的最大損失為奶牛乳產(chǎn)量下降，感染乳區(qū)的產(chǎn)奶量通常會下降40%，甚至更多。且隨著體細胞數(shù)升高，牛奶干物質(zhì)(如乳糖和酪蛋白等)比例下降，直接導(dǎo)致牛乳品質(zhì)下降[3-4]。無乳鏈球菌性乳房炎通常在擠奶廳中傳播，擠奶機、擠奶工的手、乳頭清潔毛巾或紙巾等均可作為傳播媒介[3]。然而，近年來研究顯示，無乳鏈球菌的來源也可能是環(huán)境，病原體也可能存在于糞便和墊料中，進入奶牛乳房內(nèi)引發(fā)感染[5-6]。

為了探索北方某奶牛場無乳鏈球菌的傳播途徑，本試驗對該奶牛場奶樣、糞便、墊料、口腔、奶牛乳頭末端皮膚、擠奶員手臂等位點采樣，共采集625份樣品，進行無乳鏈球菌的分離培養(yǎng)，并對結(jié)果進行分析、解讀，得出其在奶牛群中的傳播特征，并制定相應(yīng)防控方案。本試驗可為國內(nèi)無乳鏈球菌性乳房炎的針對性防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品類型 2019年7月于北方地區(qū)某大型奶牛場采集乳汁樣品240份、糞便樣品20份、墊料樣品30份、奶牛口腔樣品42份、奶牛乳頭末端樣品156份、奶襯內(nèi)壁樣品104份、擠奶員手臂樣品22份、洗手液和泡杯液樣品各15份。

乳汁樣品具體分為大罐奶樣品、泌乳前期(0～30 d，第1階段)、泌乳中期(60～180 d，第2階段)、泌乳后期(180 d以上，第3階段)、奶牛4個乳區(qū)混合奶樣、干奶前奶牛4個乳區(qū)混合奶樣、治愈隔離牛4個乳區(qū)混合奶樣、治療牛4個乳區(qū)混合奶樣和臨床型乳房炎患病乳區(qū)奶樣。各階段又分為前3把奶和奶樣。使用一次性采樣杯采集，擠奶時直接接取對應(yīng)樣品，左前、右前、左后、右后4個乳區(qū)分別接取5 mL左右奶樣，每份樣品約20 mL，搖勻并做好標記，置于4 ℃冰箱保存。

奶?？谇粯悠贩譃闊o乳鏈球菌性乳房炎治愈后隔離牛群(定義為A群)、無乳鏈球菌性乳房炎治療牛群(定義為B群)和非無乳鏈球菌性乳房炎治療牛群(定義為C群)。奶牛乳頭末端樣品依采集時間分為奶牛進入擠奶廳后乳頭末端樣品(定義為a類)、前藥浴結(jié)束后乳頭末端樣品(定義為b類)和后藥浴開始前乳頭末端樣品(定義為c類)，依奶牛類型分為無乳鏈球菌性乳房炎治愈隔離牛樣品(即A群)、治療牛樣品(即BC群)、泌乳前期奶牛樣品、泌乳中期奶牛樣品和泌乳后期奶牛樣品。奶襯內(nèi)壁環(huán)境樣品依采集時間分為泡杯前樣品(定義為d類)和泡杯后樣品(定義為e類)，依奶牛類型分為治愈隔離牛樣品(即A群)和治療牛樣品(即BC群)。擠奶員手臂樣品(定義為f類)、泡杯液樣品(定義為g類)和洗手液樣品(定義為h類)均分為健康奶牛擠奶廳(即大奶廳)樣品和乳房炎治療牛擠奶廳(即小奶廳)樣品?？谇?、奶牛乳頭末端皮膚、奶襯內(nèi)壁、擠奶員手臂(洗手后)均使用浸泡于滅菌生理鹽水的無菌棉簽進行涂抹，在取樣部位涂抹3～5次，涂抹后的棉簽置于有少量滅菌生理鹽水的離心管中，做好標記，置于4 ℃冰箱保存。洗手液、泡杯液是液態(tài)樣品，均使用一次性采樣杯采集，采集每個擠奶廳使用后的洗手液、泡杯液，每份樣品約50 mL，做好標記，置于4 ℃冰箱保存。

糞便和墊料樣品分別來自臨床乳房炎治愈后隔離牛群(乳房炎治療后在隔離牛群中飼養(yǎng)30 d)和臨床乳房炎治療牛群。糞便樣品使用一次性自封袋采集，到對應(yīng)圈舍采集新鮮糞便，同一圈舍通過5點采樣法盡量選取不同位置樣品，保證樣品均勻性。每份樣品約20 g，做好標記，置于4 ℃冰箱保存。墊料使用一次性自封袋采集，到對應(yīng)圈舍采集墊料，棄去表層較為干燥的墊料，采集深部潮濕墊料，每份樣品濕度均勻，同一圈舍選取不同臥床的墊料。每份樣品約20 g，做好標記，置于4 ℃冰箱保存。墊料樣品使用前，取適量樣品于適量滅菌生理鹽水中搖勻，靜止30 min后取上層液體作為墊料浸出液(液態(tài)樣品)加以使用，做好標記，置于4 ℃冰箱保存。

1.2 主要試劑與儀器 脫纖維綿羊血(TX0030-100 mL)，購自北京索萊寶科技有限公司；BETA-SSA瓊脂培養(yǎng)基(HB0312)、改良愛德華瓊脂培養(yǎng)基(HB8706)，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)，購自天根生化科技(北京)有限公司；無乳鏈球菌特異性引物、溴化乙錠(A600195-0001)，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；2×TransStart FastPfu PCR SuperMix(AS221-01)，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；西班牙瓊脂糖Biowest agrose(111760)，購自上?；鄯f生物科技有限公司。另有滅菌棉簽若干，一次性自封袋若干，一次性采樣杯若干，滅菌生理鹽水，ddH2O。立式壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-50S)，產(chǎn)自上海博訊實業(yè)有限公司；旋渦混合器(HQ-60-II)，產(chǎn)自北京北方同正有限公司；電熱恒溫水槽(HWS12型)，產(chǎn)自上海一恒科技有限公司；梯度基因擴增儀(Vetri 96)，產(chǎn)自美國ABI公司；臺式電子天平(BSA1245-CW)，產(chǎn)自德國 Sartorius 公司；電泳儀(DYY-6D型)、凝膠成像系統(tǒng)(WD-9413B)，均產(chǎn)自北京六一儀器公司；生物安全柜(HR40-IIA2)，產(chǎn)自青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司。

1.3 無乳鏈球菌的分離與純化 初代培養(yǎng)使用5%綿羊血的BETA-SSA瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)。液態(tài)樣品(奶樣、墊料浸出液、泡杯液、洗手液)和糞便樣品用無菌棉簽劃線，各類拭子樣品可用采樣時的涂抹棉簽劃線，置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h。無乳鏈球菌在5%綿羊血BETA-SSA瓊脂培養(yǎng)基上生長為灰白色、不透明、針尖樣小菌落，菌落光滑凸起、濕潤有光澤，呈α溶血或β溶血[7]。純化鑒定培養(yǎng)用5%綿羊血改良愛德華瓊脂培養(yǎng)基進行，從初代培養(yǎng)皿中用接種環(huán)挑取無乳鏈球菌疑似菌落接種于純化鑒定培養(yǎng)基中，置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h。無乳鏈球菌在本培養(yǎng)基上生長為淡紫(藍)色、不透明、針尖狀小菌落，菌落光滑凸起、濕潤有光澤[8]。

1.4 無乳鏈球菌的PCR鑒定 挑取純化培養(yǎng)基上的無乳鏈球菌疑似菌株，接種至裝有腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基的離心管中，放至37 ℃恒溫培養(yǎng)搖床上培養(yǎng)24 h，得到細菌懸液。根據(jù)細菌基因組DNA提取試劑盒說明書對無乳鏈球菌疑似菌株懸濁液進行DNA提取，獲取大片段、高純度、穩(wěn)定質(zhì)量的基因組DNA。提取出的無乳鏈球菌疑似菌株DNA進行PCR擴增。PCR反應(yīng)選擇50 μL體系：提取的DNA 5 μL，2×RapidTaqMasterMix 25 μL，ddH2O 15 μL，上游引物V1(5′-TTTGGTGTTTACACTAGACTG-3′)2.5 μL，下游引物V2(5′-TGTGTTAATTACTCTTATGCG-3′)2.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s 為1個循環(huán)，共40個循環(huán)；以上循環(huán)結(jié)束后72 ℃ 延伸10 min[9]。擴增好的無乳鏈球菌疑似菌株DNA通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，相同大小的DNA分子以相同速度向正極方向運動，電泳條帶與標準無乳鏈球菌菌株條帶一致的疑似菌可確認為無乳鏈球菌。

2 結(jié)果

2.1 乳汁樣品中無乳鏈球菌檢出率 乳汁樣品中總檢出率為13.1%，檢出率最高的是大罐奶，11份樣品中7份都檢出了無乳鏈球菌，檢出率為63.6%，存在無乳鏈球菌全群感染。見表1。

表1 乳汁樣品中無乳鏈球菌檢出率

2.2 口腔樣品中無乳鏈球菌檢出率 口腔拭子整體檢出率較高，42份樣品中共檢出無乳鏈球菌11株，總檢出率為26.2%。見表2。

表2 口腔樣品中無乳鏈球菌檢出率

2.3 乳頭末端樣品中無乳鏈球菌檢出率 奶牛乳頭末端只有兩類樣品檢測出無乳鏈球菌，一是無乳鏈球菌治療牛，檢出率為40.0%；二是泌乳中期(60～180 d)奶牛，檢出率為16.7%。其他各類乳頭末端皮膚拭子樣品的無乳鏈球菌檢出率均為0。見表3。

表3 奶牛乳頭末端樣品中無乳鏈球菌檢出率

2.4 奶襯內(nèi)壁樣品中無乳鏈球菌檢出率 奶襯內(nèi)壁在擠奶前無乳鏈球菌檢出率為0，擠奶后無乳鏈球菌檢出率為20.0%(治療牛)和2.1%(泌乳牛)，說明無乳鏈球菌是在擠奶后乳汁掛在奶襯內(nèi)壁上的，且經(jīng)過泡杯液消毒后無乳鏈球菌被殺死。見表4。

2.5 其他樣品中無乳鏈球菌檢出率 其他位點樣品中，糞便樣品總檢出率為25.0%，健康牛奶廳擠奶員手臂上檢出率為16.7%，沼渣墊料、泡杯液、洗手液等位點沒有檢出無乳鏈球菌。見表5。

表5 其他樣品中無乳鏈球菌檢出率

3 討論

本試驗中，大罐奶中無乳鏈球菌檢出率為63.6%，隔離牛無乳鏈球菌檢出率為28.0%，表明該奶牛場存在較為嚴重的全群感染，感染基數(shù)較大。從新產(chǎn)牛階段到干奶前，各階段無乳鏈球菌檢出率逐漸降低，到進入干奶期之前降低至0，說明在泌乳前期無乳鏈球菌的感染率高，而泌乳后期的感染率逐漸下降。這可能與乳腺組織內(nèi)免疫細胞對乳房鏈球菌的清除能力有關(guān)[10]。由于分娩應(yīng)激及產(chǎn)后營養(yǎng)代謝病等影響，奶牛的乳腺免疫力在泌乳早期通常低于泌乳后期[11]。從另一方面來說，奶牛在泌乳早期發(fā)生乳房炎，會帶來更大的經(jīng)濟損失，并導(dǎo)致奶牛的乳腺在以后的泌乳階段更容易被感染[12]。因此，泌乳前期奶牛無乳鏈球菌較高的感染率提示，本牛場中需要更為重視干奶期和分娩前后奶牛的健康管理。

目前無乳鏈球菌的主要傳播途徑是接觸性傳播，即在奶廳內(nèi)通過奶襯、擠奶員的手臂或毛巾等，由患病奶牛傳染至健康奶牛的乳區(qū)[13]。近年來，也有研究證明，無乳鏈球菌可以通過糞便和墊料等途徑侵入乳房[5-6]。在本試驗中，糞便和奶牛口腔中可檢測出無乳鏈球菌，推測可能是飼料和飲水中存在無乳鏈球菌，并經(jīng)采食和飲水進入口腔并生長繁殖，形成糞—口途徑，這與Jorgensen等的研究結(jié)論一致[5]。然而，在本試驗中，沼渣墊料中沒有檢測出無乳鏈球菌，說明沼渣墊料可能不適于無乳鏈球菌在體外的生長繁殖，但也不排除檢測方法存在一定局限性。此外，該奶牛場新產(chǎn)牛墊料成分為沼渣和稻殼粉的混合物，在新產(chǎn)牛階段較高的檢出率可能與稻殼粉的摻入有關(guān)。

在本試驗中，無乳鏈球菌在奶牛乳頭末端皮膚檢出率較低，僅出現(xiàn)在進廳后的乳頭皮膚上，說明牛舍環(huán)境中存在無乳鏈球菌，可能與乳頭末端受到糞便污染有關(guān)。因此我們推測，在該奶牛場中，存在口—糞—乳房的感染途徑。消毒后乳頭末端檢出率為0，表明擠奶前的消毒操作有效且有必要。然而脫杯后藥浴前的乳頭末端未發(fā)現(xiàn)無乳鏈球菌，可能與檢測數(shù)量較少有關(guān)，也可能由于乳頭末端取樣量較少導(dǎo)致。此外，泡杯前的奶襯內(nèi)壁可檢出無乳鏈球菌，可能是乳頭末端皮膚表面的細菌沾到內(nèi)襯上，也有可能是乳腺深部的細菌沾到內(nèi)襯上。乳房炎奶廳中擠奶機奶襯的無乳鏈球菌檢出率為20.0%，有可能在患病牛奶廳中，奶襯是一條重要的傳播途徑；健康牛奶廳奶襯無乳鏈球菌檢出率為2.0%，在健康牛奶廳奶襯可能并非重要傳播途徑。健康牛奶廳擠奶員手臂拭子無乳鏈球菌檢出率為16.7%，這說明消毒洗手液殺菌效力或洗手操作方式可能存在問題。由于擠奶員接觸牛只很多，如果不能保證對手臂進行有效消毒，那么擠奶員的手臂很有可能成為無乳鏈球菌的重要傳播途徑[14]。

通過以上分析，該奶牛場主要存在的無乳鏈球菌傳播途徑有兩條：一是擠奶廳內(nèi)的接觸傳播。擠奶廳是牛群密度最大、牛只工作強度最大且所有牛只都要接觸的場所，也是引起乳房炎發(fā)病的高風(fēng)險場所[15]。該奶牛場擠奶廳無乳鏈球菌檢出率最高的位點是擠奶員手臂，由于擠奶員持續(xù)接觸牛群，如果沒做好洗手消毒很有可能將無乳鏈球菌從感染牛只攜帶至健康牛只，造成更大面積的傳播。其次，通過檢出結(jié)果分析可發(fā)現(xiàn)，藥浴可有效減少乳頭末端無乳鏈球菌檢出率、泡杯可有效減少奶襯內(nèi)壁無乳鏈球菌檢出率，證明藥浴和泡杯操作對切斷傳播途徑起著重要作用。二是口—糞—乳房傳播。牛只通過采食和飲水將飼料、飲水中積存的無乳鏈球菌攝入，給無乳鏈球菌提供口腔這一繁殖環(huán)境，并通過排便將無乳鏈球菌散播到環(huán)境中，最終無乳鏈球菌通過糞便等環(huán)境侵入乳房，造成感染[5]。此外，治愈隔離牛群乳房中仍存在無乳鏈球菌，可能是因為抗生素治療并未達到細菌學(xué)治愈效果，需要進一步評估抗生素治療方案[16]。

根據(jù)本試驗結(jié)果，奶牛場應(yīng)制定一種綜合性管控方案。首先，對牛群進行隱性乳房炎檢測，及時將感染牛只隔離分群，且保證隔離群和非隔離群不共用擠奶廳。其次，鑒于擠奶廳的重要性，提高工作人員的操作意識，如奶杯泡杯操作、乳頭末端藥浴操作和擠奶員自身手臂清潔操作，切斷奶廳中接觸性傳播途徑。最后，加強隔離群奶牛的飼養(yǎng)管理，提高牛舍清潔度，如清糞頻率、臥床維護和墊料消毒，切斷口—糞—乳房傳播途徑。