牛晉國(guó)，申李琰，李惠龍，張希瑤

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030032)

山西“農(nóng)谷”是將山西省太谷縣建設(shè)成為以特色產(chǎn)業(yè)、綠色養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)、設(shè)施農(nóng)業(yè)、生物技術(shù)和農(nóng)村產(chǎn)業(yè)融合發(fā)展的科技創(chuàng)新城[1]。白羽肉雞的養(yǎng)殖是該“農(nóng)谷”綠色養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)之一，2015年以來(lái)該縣的肉雞出欄量居山西省第一，為該省肉雞產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型升級(jí)發(fā)展發(fā)揮著重要的作用[2]。雞大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenicEscherichiacoli,APEC)引起的，是以侵害白羽肉雞氣囊、眼睛、呼吸道、消化道、內(nèi)臟器官等為特征，引起肉雞發(fā)病率和死亡率都非常高的細(xì)菌性疾病[3-5]。雞大腸桿菌病在白羽肉雞的養(yǎng)殖中常與其他疫病混合發(fā)生或在發(fā)生其他疫病后誘發(fā)該病，據(jù)報(bào)道APEC引發(fā)的疾病占白羽肉雞細(xì)菌性疾病的50%～85%[6-7]。本試驗(yàn)采集了單棟飼養(yǎng)量為40 000只的白羽肉雞舍內(nèi)的不同來(lái)源樣品(糞便、飼料、飲水、病雞)，進(jìn)行了大腸桿菌的分離鑒定與同源性分析，通過(guò)藥敏試驗(yàn)與致病性試驗(yàn)，確定了分離菌的致病性與敏感的藥物，為山西“農(nóng)谷”肉雞的大腸桿菌病預(yù)防與治療提供有效的試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、伊紅-美藍(lán)瓊脂，均購(gòu)自青島賓得生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇，枸櫞酸鹽試驗(yàn)、硝酸鹽試驗(yàn)、甲基紅、硫化氫、蛋白胨水)和常用藥敏試紙，均購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；革蘭染色液，購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；菌液PCR和16S rDNA鑒定由北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1日齡商品代雛雞110只，購(gòu)自山西省太原市智龍種雞場(chǎng)。

SW-CJ-1F單人雙面生物潔凈工作臺(tái)、FXB101-2鼓風(fēng)干燥箱、FXB303-3恒溫培養(yǎng)箱，均購(gòu)自上海樹(shù)立儀器儀表有限公司；XSP-8CA三目生物顯微鏡，購(gòu)自上海光學(xué)儀器廠；SHY-2水浴恒溫振蕩器，購(gòu)自江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；YM不銹鋼立式電熱蒸汽消毒器，購(gòu)自上海三申醫(yī)療器械有限公司。

1.2 樣品采集與處理

1.2.1 采樣點(diǎn) 2018年8月6日在山西“農(nóng)谷”某白羽肉雞養(yǎng)殖基地，隨機(jī)選取一棟飼養(yǎng)量為40 000只肉雞的雞舍，按照五點(diǎn)采樣法，雞舍中心和4個(gè)角位置為采樣點(diǎn)，即雞舍內(nèi)2個(gè)邊列的第2組和第41組雞籠，中間列的第22組雞籠，每組雞籠的中間位置為采樣點(diǎn)。

1.2.2 樣品采集 在雞舍內(nèi)采集樣品，氣源樣品采用自然沉降法在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板采集15份，于每層雞籠的上方打開(kāi)暴露20 min；雞糞源和飼料源樣品各5份，撥開(kāi)表層，取內(nèi)部樣；水源樣品在采樣位置的乳頭飲水器，成股流出的中段樣品5份；人糞源樣品在雞舍外露天廁所采集2份；雞源樣品采集病死雞肝臟樣品2份，每份樣品1 g或1 mL左右，冰盒冷藏帶回實(shí)驗(yàn)室，在12 h內(nèi)處理。

1.2.3 細(xì)菌培養(yǎng)與純化 飼料、糞便和肝組織樣品分別稱(chēng)取0.1 g，加200 μL生理鹽水沖洗，采用三點(diǎn)法涂板，水源樣品直接涂板麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，和氣源樣品平板一起放入溫箱37 ℃，培養(yǎng)18～24 h。取出檢查平板內(nèi)菌落數(shù)大于100時(shí)，倍比稀釋樣品，重新涂板培養(yǎng)。選取平板內(nèi)典型的粉紅色菌落，劃線(xiàn)接種到伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)18 h；選取具有金屬光澤的菌落接種至LB肉湯，37 ℃震蕩培養(yǎng)6 h，轉(zhuǎn)入溫箱培養(yǎng)12 h，取純培養(yǎng)菌液染色鏡檢。

1.3 分離菌的生化鑒定 取分離菌培養(yǎng)菌液，接種于葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇，枸櫞酸鹽試驗(yàn)、硝酸鹽試驗(yàn)、甲基紅、硫化氫、蛋白胨水等生化反應(yīng)鑒定管，37 ℃溫箱培養(yǎng)8～18 h，觀察結(jié)果。

1.4 分離菌16S rDNA鑒定與同源性分析 登錄GenBank，根據(jù)大腸桿菌16S rDNA的保守基因片段，合成引物，引物序列為27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR采用25 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃，3 min；變性94 ℃，30 s，退火54 ℃，30 s，延伸72 ℃，90 s，24個(gè)循環(huán)；延伸72 ℃，10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將陽(yáng)性的純化產(chǎn)物測(cè)序。引物合成及測(cè)序由北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司完成。登錄NCBI利用BLAST進(jìn)行分離菌的16S rDNA序列比對(duì)，利用DNASTAR進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 藥物敏感性試驗(yàn) 按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(NCCLS)標(biāo)準(zhǔn)，采用紙片擴(kuò)散法(Kirby-barer氏法)進(jìn)行藥物的敏感性試驗(yàn)(質(zhì)控菌：ATCC25922)，根據(jù)抑菌圈大小判斷敏感性[8]。

1.6 致病性試驗(yàn) 健康1日齡雛雞飼養(yǎng)至7日齡，選擇活潑的雛雞分為13組，每組6只，將按照麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌落數(shù)為3×108CFU/mL的11組分離菌液腹腔注射各組雛雞，每只0.5 mL，觀察7 d內(nèi)死亡情況，前3天每隔3 h觀察1次，3 d后每天觀察3次，取病變器官分離鑒定回收菌種；2個(gè)對(duì)照組：注射無(wú)菌肉湯組和不注射的空白對(duì)照組。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離純化 氣源樣品分離菌2株(命名為A22、A42)，雞源分離菌4株(B11、B21、B15、B25)，雞糞源分離菌1株(F33)，人糞源分離菌1株(M13)，飼料源分離菌2株(S11、S21)，水源分離菌1株(W32)。分離菌在麥康凱瓊脂平板上長(zhǎng)出光滑隆起的粉紅色菌落；在伊紅美蘭培養(yǎng)基上形成具有金屬光澤的圓形菌落(圖1A)；在營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)后均勻渾濁；涂片后革蘭染色呈陰性，鏡檢為兩端鈍圓的中等大小桿菌(圖1B)。

圖1 分離菌菌落形態(tài)和革蘭染色鏡檢結(jié)果

2.2 生化鑒定 分離菌生化管反應(yīng)結(jié)果顯示，可以發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇，MR試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硝酸鹽試驗(yàn)呈陽(yáng)性，枸櫞酸鹽、硫化氫試驗(yàn)呈陰性，符合大腸桿菌的生化鑒定特性。

2.3 16S rDNA基因PCR擴(kuò)增與測(cè)序 PCR擴(kuò)增16S rDNA基因得到了與預(yù)期大小相符的條帶，約為1 450 bp，見(jiàn)圖2。11株分離菌測(cè)序后，登錄NCBI信息中心進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，與GenBank公布的大腸桿菌菌株的16S rDNA基因片段的同源性均達(dá)到99%～100%。

圖2 分離菌16S rDNA 凝膠電泳結(jié)果

2.4 16S rDNA核苷酸序列同源性和進(jìn)化樹(shù)分析 對(duì)不同來(lái)源的11個(gè)菌株的16S rDNA核苷酸序列用DNASTAR軟件中的MegAlign模塊下的Clustal W方法進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，同源性分析見(jiàn)圖3，分離菌的16S rDNA序列同源性在95.5%～99.4%。同源性最高的是菌株B15和B25，最低的是B15和W32、B21和W32。

圖3 16S rDNA 基因核苷酸序列同源性分析

分離菌根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)大致可以分為4支，見(jiàn)圖4。2株雞源菌與1株人糞源菌進(jìn)化樹(shù)分析為同一小分支，與1株氣源菌和另1株雞源菌在同一分支；1株雞源菌與1株雞糞源菌在同一小分支，與1株飼料源菌和1株氣源菌在同一分支；1株飼料源菌和1株水源菌各在一個(gè)分支，這2株 和其他株之間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。進(jìn)化樹(shù)分析表明，來(lái)自同一種樣品的分離菌親緣關(guān)系不一定比不同來(lái)源的菌株高，說(shuō)明大腸桿菌菌型復(fù)雜，分布廣泛。

圖4 16S rDNA 基因核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

2.5 藥敏試驗(yàn) 11株分離菌對(duì)20種藥物的敏感程度見(jiàn)表1。由表1可知，分離菌對(duì)新霉素和氧氟沙星不耐藥，對(duì)其他18種藥物有不同程度的耐藥性，對(duì)林可霉素、青霉素、卡那霉素、磺胺異噁唑耐藥率較高。分離菌對(duì)新霉素、妥布霉素和阿米卡星敏感性較高，敏感率大于50%的還有頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢唑啉、慶大霉素、環(huán)丙沙星，對(duì)林可霉素和青霉素的敏感率為0。

表1 11株分離菌對(duì)20種藥物的耐藥性分析

2.6 致病性試驗(yàn) 雛雞在接種后出現(xiàn)精神萎頓，畏寒，采食量、飲水量減少，拉綠色糞便，并在1～3 d內(nèi)陸續(xù)出現(xiàn)死亡，致病情況見(jiàn)表2，死亡的雛雞剖檢可見(jiàn)氣囊炎、肝周炎、心包炎等符合大腸桿菌病特征的病變。3 d后沒(méi)有出現(xiàn)死亡，至育雛結(jié)束余下的試驗(yàn)雛雞均健康生長(zhǎng)。根據(jù)接種后雛雞的發(fā)病時(shí)間、死亡情況以及癥狀與剖檢變化等，可見(jiàn)菌株A22、F33、W32致病力較強(qiáng)，菌株A42、B25、S11、S21致病力中等，菌株B11、B15、M13致病力較弱，菌株B21致病力最弱。經(jīng)鑒定每組試驗(yàn)雛雞中分離到的菌株與原接種菌株一致。

表2 注射分離菌菌液后雛雞致病力情況分析

3 討論

雞大腸桿菌病具有地域流行性，不易控制，是嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的重要的細(xì)菌性傳染病之一，且APEC的耐藥基因可以通過(guò)禽肉、禽蛋等畜產(chǎn)品轉(zhuǎn)移到人身上，構(gòu)成公共衛(wèi)生問(wèn)題[9-10]。本試驗(yàn)在規(guī)?；怆u雞舍內(nèi)采集的34份不同源的樣品中分離到了11株致病性大腸桿菌。16S rDNA同源性分析顯示，雞源菌與雞糞源菌同源性最高，達(dá)到了97.8%～99.2%，由高到低依次是人糞源菌、氣源菌、飼料源菌、水源菌，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析也表明，雞源菌與糞源菌、氣源菌親緣關(guān)系較近，與水源菌、飼料源菌較遠(yuǎn)。表明雞群通過(guò)糞便傳播和感染APEC的機(jī)會(huì)比空氣、飼料和飲水的機(jī)會(huì)大。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，11株APEC對(duì)18種藥物存在不同程度的多重耐藥，與2019年李蘊(yùn)玉等[11]報(bào)道的唐山和秦皇島地區(qū)分離的22株肉雞源APEC的耐藥率和2018年李明舉等[12]報(bào)道的膠東地區(qū)分離的169株肉雞大腸桿菌的耐藥率相比，四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、β內(nèi)酰胺類(lèi)等藥物的耐藥性有不同程度的降低，卡那霉素升高，表明“農(nóng)谷”雞源大腸桿菌的耐藥性比周邊地區(qū)要低，耐藥性有地區(qū)差異性。本試驗(yàn)結(jié)果與2015年寧官保等[13]報(bào)道的在山西省部分地區(qū)分離的20株大腸桿菌的耐藥性和2018年尹嬌嬌等[14]從山西省晉中地區(qū)分離的8株雞源APEC的耐藥性相比，耐藥性均有明顯的降低，表明隨著“農(nóng)谷”養(yǎng)殖環(huán)境的不斷改善與養(yǎng)殖水平的不斷提高，APEC的耐藥性在逐漸降低。

致病性試驗(yàn)結(jié)果表明，11株不同來(lái)源的APEC均有不同程度的致病性。雞源APEC致病力不是很強(qiáng)，但其中B25株耐20種藥物的耐藥率高達(dá)55%，敏感率與B21株并列最低為15%。根據(jù)分離菌對(duì)藥物的耐藥率和敏感率，那么致病力較強(qiáng)的A22和F33可能成為下一個(gè)流行株，APEC的致病機(jī)制與耐藥機(jī)制有待深入研究。因此，雞場(chǎng)要加強(qiáng)環(huán)境消毒，消滅有害微生物，防患于未然。

4 結(jié)論

山西“農(nóng)谷”肉雞舍內(nèi)APEC存在于糞便、空氣、飲水、飼料、雞體中，糞源株與雞源株同源性較高，為97.8%～99.2%。分離菌對(duì)新霉素、妥布霉素和阿米卡星等藥物高敏，對(duì)林可霉素、青霉素、卡那霉素、磺胺異噁唑等耐藥，存在多重耐藥性。分離菌致病性高低不等，耐藥率高的細(xì)菌危害更大。