李 爽，劉 群

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 國(guó)家動(dòng)物寄生原蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室，北京 海淀 100193)

弓形蟲(chóng)(Toxoplasmagondii)是一種重要的人獸共患機(jī)會(huì)性病原，專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生，幾乎感染所有的溫血?jiǎng)游锛叭祟?lèi)，危害嚴(yán)重。弓形蟲(chóng)在中間宿主體內(nèi)主要有2種存在形式，即速殖子和緩殖子，緩殖子外被囊壁，以包囊形式存在[1]。速殖子的入侵、增殖和逸出是弓形蟲(chóng)傳播必不可少的過(guò)程，任何一個(gè)步驟出現(xiàn)異常都不能使其正常寄生。

弓形蟲(chóng)的順利入侵、增殖和逸出主要依賴(lài)于其3種獨(dú)特的分泌細(xì)胞器，即微線體、棒狀體和致密顆粒。蟲(chóng)體入侵時(shí)，首先產(chǎn)生微線體蛋白(Microneme proteins，MICs)和棒狀體頸部蛋白(Rhoptry neck proteins，RONs)將弓形蟲(chóng)錨定在宿主細(xì)胞膜上，隨后穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入宿主細(xì)胞，釋放棒狀體蛋白(Rhoptry proteins，ROPs)和致密顆粒蛋白(Dense granular proteins,GRAs)，形成納蟲(chóng)空泡(Parasitophorous vacuole，PV)。ROPs可調(diào)控宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答促使宿主細(xì)胞提供有利環(huán)境維持自身增殖和生存；部分GRAs被分泌到PV參與形成納米微管-囊泡網(wǎng)絡(luò)，攝入生長(zhǎng)必需養(yǎng)分并調(diào)控自身抗原的暴露，也可以分泌到宿主細(xì)胞，調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)，觸發(fā)宿主免疫反應(yīng)[2]。

這些分泌蛋白是維持蟲(chóng)體正常生命活動(dòng)和傳播的必要分子，其中有些是弓形蟲(chóng)重要的毒力因子，因此闡明弓形蟲(chóng)分泌細(xì)胞器從頭合成的分子機(jī)制和分泌蛋白加工轉(zhuǎn)運(yùn)途徑是近數(shù)十年來(lái)的研究熱點(diǎn)，加上最近開(kāi)發(fā)的眾多分子生物學(xué)研究手段，促進(jìn)了弓形蟲(chóng)作為頂復(fù)門(mén)原蟲(chóng)蛋白質(zhì)運(yùn)輸和細(xì)胞器生物發(fā)生模型的研究。因此，本文將對(duì)分泌蛋白的合成、分類(lèi)和運(yùn)輸?shù)难芯窟M(jìn)展做一綜述。

游客們對(duì)三峽地區(qū)歷史文化的認(rèn)知主要是巴蜀文化和巫文化。原始的巴人部落、舞蹈表演和神秘的巫文化祭祀活動(dòng)構(gòu)成了游客們對(duì)三峽地區(qū)古代文明的體驗(yàn)，幫助游客更好地理解遙遠(yuǎn)的歷史文化。一位廣西的年輕游客描述了印象深刻的巫文化祭祀表演：

1 弓形蟲(chóng)分泌系統(tǒng)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)

弓形蟲(chóng)具有一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum,ER)與核膜相連。高爾基體(Golgi)由3～5個(gè)折疊的腔室堆積而成，向外分泌延伸[3]。分泌蛋白在核糖體合成后有序的從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸?shù)礁郀柣w，再?gòu)母郀柣w流向內(nèi)體樣的腔室，包括早期內(nèi)體(Early endosome,EE)和晚期內(nèi)體(Late endosome,LE)，經(jīng)過(guò)蛋白酶水解修飾，形成棒狀體和微線體的前體蛋白[4]。弓形蟲(chóng)的LE附近還存在一個(gè)充滿大量蛋白酶的植物樣液泡(Plant-like vacuole，PLV)[5],其中組織蛋白酶L(Cathepsin L,CPL)介導(dǎo)了微線前體蛋白的水解成熟。這些現(xiàn)象表明，弓形蟲(chóng)具有獨(dú)特的內(nèi)體系統(tǒng)(Endosomal-like compartments,ELC)，與弓形蟲(chóng)增殖過(guò)程中頂端分泌細(xì)胞器的生物發(fā)生和蛋白功能的發(fā)揮直接相關(guān)。

2.4 兩組患者術(shù)后排尿情況比較 術(shù)后6個(gè)月研究組患者排尿潴留、排尿困難、尿失禁、尿急及尿頻的發(fā)生率均顯著低于對(duì)照組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.350，P<0.05)。見(jiàn)表5。

2 弓形蟲(chóng)分泌蛋白的生物合成

除了這些分泌蛋白自身的保守基序和結(jié)構(gòu)域在蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中起作用外，還有很多調(diào)控因子發(fā)揮著核心功能。目前，鑒定出部分弓形蟲(chóng)蛋白分泌過(guò)程中囊泡出芽、運(yùn)輸和融合機(jī)制的相關(guān)因子。主要包括以下幾種。

Rab蛋白：Rabs是最大的小G蛋白家族，在囊泡運(yùn)輸中起分子開(kāi)關(guān)作用，是囊泡從供體到受體定向運(yùn)輸所必需的[18]。弓形蟲(chóng)只存在一組基本的Rab蛋白，TgRab5A定位于EE，Rab5A和Rab5C過(guò)表達(dá)導(dǎo)致微線體和棒狀體轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷，ROPs被重新運(yùn)輸?shù)絇V中。此外，過(guò)表達(dá)TgRab11A或TgRab11B都可以導(dǎo)致蟲(chóng)體分裂異常，新合成的內(nèi)膜復(fù)合體(Inner membrane complex,IMC)從高爾基體向子代細(xì)胞的運(yùn)輸和分泌受阻，表明TgRab11A和TgRab11B調(diào)節(jié)組成性分泌[19]。

2.3 致密顆粒蛋白 致密顆粒為球形致密細(xì)胞器，直徑約200 nm，不同感染階段蟲(chóng)體中的致密顆粒數(shù)量不同[16]。

2.2 棒狀體蛋白 棒狀體的位置與微線體幾乎一致[10]，共有8～12個(gè)，其生物合成由高爾基體的囊泡出芽驅(qū)動(dòng)，在TGN和正在分裂的蟲(chóng)體頂端之間形成大的囊泡，不斷發(fā)育成熟[11]，但其成熟途徑和機(jī)制尚不完全清楚。

ROPs的分選機(jī)制與MICs非常相似，可溶性ROPs可攜帶多種不同的靶向信號(hào)[12]。ROP2和ROP4都具有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，基于酪氨酸的分選信號(hào)(YXXΦ基序)有助于將蛋白質(zhì)分類(lèi)到棒狀體[13]。任何一個(gè)基序發(fā)生缺失或突變都會(huì)阻斷蛋白向成熟棒狀體的轉(zhuǎn)運(yùn)，導(dǎo)致它們?cè)陬?lèi)似多泡體(Multivesicular bodies，MVB)的大囊泡中積累[14]。這些數(shù)據(jù)表明，ROPs從TGN到早期內(nèi)體可能以復(fù)合物的形式運(yùn)輸，依賴(lài)于不同蛋白的分類(lèi)信號(hào)。事實(shí)上，后來(lái)鑒定TgSORTLR是ROPs轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵受體，條件性敲除后導(dǎo)致蛋白定位錯(cuò)誤，成熟異常[15]。

本文以理論計(jì)算和數(shù)值模擬相結(jié)合的方法，得出CFG樁復(fù)合地基的公式計(jì)算沉降量和有限元分析結(jié)果相符。首先對(duì)CFG樁復(fù)合地基的承載性狀進(jìn)行了理論研究，再利用MIDAS有限元軟件，分析了褥墊層厚度、置換率對(duì)樁復(fù)合地基的承載特性的影響。主要結(jié)論如下：

吳湞長(zhǎng)時(shí)間在江西省衛(wèi)生系統(tǒng)工作。他曾任江西省衛(wèi)生廳醫(yī)教科技處干部；1989年-2000年，任江西省衛(wèi)生廳藥政管理局副局長(zhǎng)、局長(zhǎng)。

綜上所述，我們?cè)诮M織銜接教學(xué)時(shí)，一定要把握住學(xué)生學(xué)習(xí)過(guò)程中所暴露的問(wèn)題，要針對(duì)性地給出解決方案，這樣才能讓我們的教學(xué)更有效率.

3 弓形蟲(chóng)蛋白分泌轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵因子

2.1 微線體蛋白 微線體位于弓形蟲(chóng)頂部100～150 μm的位置，表達(dá)多種MICs，在分泌途徑早期組裝成復(fù)合體，不同蛋白之間的相互作用是它們從反式高爾基體網(wǎng)(Trans-golgi network,TGN)靶向到微線體的必要手段[6]。

GRAs與形成宿主細(xì)胞器隔離管狀結(jié)構(gòu)(Host organelle sequestering tubular structures H.O.S.T.)和膜狀納米管腔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)(Membranous nanotubular intravacuolar network，IVN)有關(guān)，前者調(diào)節(jié)宿主內(nèi)體和溶酶體向PV的傳遞，后者連接PV內(nèi)的蟲(chóng)體和PV膜[17]。與高等生物的真核細(xì)胞不同，弓形蟲(chóng)中從未觀察到未成熟的致密顆粒。目前發(fā)現(xiàn)引起GRAs轉(zhuǎn)運(yùn)異常的蛋白還很少，并且新合成的GRAs從TGN轉(zhuǎn)運(yùn)到致密顆粒的分子機(jī)制目前尚不清楚，需要更多的研究來(lái)闡明其分泌途徑。

TgMIC6是一種跨膜蛋白，也是TgMIC4和TgMIC1的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這種聯(lián)系通過(guò)MIC6的特征性生長(zhǎng)表皮因子(Epidermal growth factor,EGF)樣結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)[7]，與TgMIC1的類(lèi)半乳糖凝集素結(jié)構(gòu)域(Galactose-like agglutinin domain)相互作用，其中SYHYY和EIEYE兩個(gè)酪氨酸的基序可以對(duì)該復(fù)合物進(jìn)行正確的分類(lèi)[8]。TgMIC2與TgM2AP在弓形蟲(chóng)表面以復(fù)合物的形式分泌，有助于滑移運(yùn)動(dòng)和對(duì)宿主細(xì)胞附著。M2AP前肽發(fā)揮分類(lèi)作用，決定了分泌蛋白的靶向性[9]。復(fù)合物的每個(gè)組成部分都具有不同的分類(lèi)信號(hào)，它們分泌方式和功能的差異直接與分泌細(xì)胞器生物合成過(guò)程中的不同轉(zhuǎn)運(yùn)途徑有關(guān)，但這些不同的MICs是否依賴(lài)于不同的分類(lèi)機(jī)制仍有待確定。

可溶性N-乙基馬來(lái)酰亞胺敏感因子附著蛋白受體蛋白(SNAREs)：定位于內(nèi)體系統(tǒng)(ELC)和高爾基體(Golgi)之間，促進(jìn)囊泡融合傳遞貨物蛋白。3種突觸蛋白synaptobrevin/VAMP、syntaxin和SNAP-25形成復(fù)合物共同構(gòu)成突觸小泡與質(zhì)膜融合機(jī)制的核心[20]。弓形蟲(chóng)存在23種SNARE樣蛋白，其中Stx6定位于TGN、Golgi和ELC之間以及蟲(chóng)體表面。過(guò)表達(dá)后蟲(chóng)體發(fā)育畸形，ELC擴(kuò)張，Golgi破碎，IMC成熟異常，并破壞蛋白從ELC到高爾基體的運(yùn)輸[21]。

網(wǎng)格蛋白銜接復(fù)合物(Clathrin adaptor complexes)：在真核細(xì)胞中有6種AP復(fù)合物，功能不同[22]。AP-1在TGN到內(nèi)體的順行和逆行中起作用，破壞TgAP1 μ1亞基導(dǎo)致MICs在TGN水平上的分類(lèi)錯(cuò)誤，使可溶性MIC3重新進(jìn)入PV，而跨膜MIC8主要保留在TGN中。此外，TgAP1可以通過(guò)激活TGN中的ROPs轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)調(diào)節(jié)棒狀體的生物發(fā)生，缺失TgAPμ1導(dǎo)致成熟的棒狀體破碎，未成熟的ROPs被重新運(yùn)輸?shù)絇V或殘?bào)w中[23]。因此，TgAP1可能在pro-ROP從TGN中運(yùn)出的過(guò)程和未成熟棒狀體向成熟棒狀體的轉(zhuǎn)變過(guò)程中發(fā)揮作用[24]。

囊泡分選蛋白(Vacuole protein sorting,VPS)：酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，內(nèi)溶酶體系統(tǒng)包含2個(gè)同源的系留復(fù)合體：內(nèi)體Class C core vacuole/endosome tethering(CORVET)和Homotypic fusion and vacuole protein sorting(vacuolar HOPS)，這些復(fù)合物對(duì)于內(nèi)體從早期到晚期的轉(zhuǎn)變、溶酶體生物發(fā)生和內(nèi)溶酶體運(yùn)輸途徑至關(guān)重要[25]。TgSORTLR也稱(chēng)VPS10，定位于高爾基體-內(nèi)體相關(guān)區(qū)室內(nèi)，具有2個(gè)關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域。N末端TgSORTLR內(nèi)腔結(jié)構(gòu)域與ROPs和MICs特異性相互作用，異位表達(dá)導(dǎo)致自身蛋白以及棒狀體和微線體蛋白均定位錯(cuò)誤；而胞質(zhì)尾部結(jié)構(gòu)域則參與蛋白質(zhì)的順行和逆行運(yùn)輸。因此，TgSORTLR是弓形蟲(chóng)分泌細(xì)胞器生物發(fā)生和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵。TgVps11是 HOPS和CORVET裝配的支架蛋白，與囊泡和未成熟分泌細(xì)胞器有關(guān)[15]。隨后，研究人員在弓形蟲(chóng)中又發(fā)現(xiàn)了多個(gè)VPS蛋白，包括VPS4、VPS18、VPS39和VPS9等，它們均參與調(diào)節(jié)分泌細(xì)胞器的生物發(fā)生[26]。

動(dòng)力蛋白相關(guān)蛋白B(Dynamin-related protein，DrpB)：動(dòng)力蛋白是一種大的GTPase，通過(guò)充當(dāng)機(jī)械酶來(lái)切斷囊泡之間的聯(lián)系，參與細(xì)胞器分裂或囊泡運(yùn)輸[27]。弓形蟲(chóng)中存在3個(gè)動(dòng)力相關(guān)蛋白，分別是DrpA、DrpB和DrpC，其中TgDrpB定位在Golgi附近，通過(guò)調(diào)節(jié)分泌途徑中的囊泡運(yùn)輸促進(jìn)分泌細(xì)胞器的形成，條件性敲除DrpB導(dǎo)致成熟的子代蟲(chóng)體微線體和棒狀體丟失[28]。

4 展望

弓形蟲(chóng)利用其內(nèi)體系統(tǒng)發(fā)揮分泌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，使MICs和ROPs高效有序的沿著TGN到ELC的路線通向頂端分泌細(xì)胞器，其中多種蛋白因子參與調(diào)控，從而確保蛋白精確無(wú)誤的靶向運(yùn)輸。HOPS復(fù)合體參與了分泌蛋白從TGN到未成熟細(xì)胞器的順行運(yùn)輸和融合，Vps10與AP-1、AP-2、網(wǎng)格蛋白、Vps9和逆轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物結(jié)合，是貨物蛋白順行和逆行轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵受體(圖1)。然而，現(xiàn)在還需要更多的研究來(lái)證明弓形蟲(chóng)早期內(nèi)體向晚期內(nèi)體的轉(zhuǎn)化機(jī)制，分泌囊泡的分類(lèi)途徑，以及參與分泌蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)成熟的相關(guān)蛋白及其作用機(jī)制。此外，GRA蛋白對(duì)弓形蟲(chóng)的毒力和生存至關(guān)重要，調(diào)節(jié)致密顆粒生物發(fā)生和蛋白分泌的機(jī)制仍然是弓形蟲(chóng)分泌蛋白研究的重點(diǎn)難點(diǎn)，還未有探索。因此，對(duì)于揭示弓形蟲(chóng)分泌蛋白的運(yùn)輸成熟仍需大量研究。

圖1 弓形蟲(chóng)分泌蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)模式