耿莉娜，趙 敏，張 艷，徐 宸，汪代斌

重慶煙草科學研究所，重慶 400715

煙草屬于收獲葉片的作物，在我國經(jīng)濟中占有比較重要的地位．煙草病害發(fā)生后對煙葉產量與質量影響很大，嚴重時會造成毀滅性的經(jīng)濟損失．目前，煙草赤星病是嚴重制約我國煙葉生產的一類真菌病害，該病具有潛育期短、 爆發(fā)快的特點，在溫濕度適宜的條件下，短時間內即可大面積流行，給煙葉生產造成巨大損失．長期使用化學藥劑防治該病害會引起環(huán)境污染、 農藥殘留、 抗藥性等問題； 生物防治雖無毒無害無污染，但其作用緩慢、 穩(wěn)定性差、 易受外界環(huán)境影響等缺點成為開發(fā)的難點，因此研究煙草的抗病性和選育抗赤星病煙草品種是防治該病最經(jīng)濟有效的途徑[1-2]．

目前，對于煙草自身抗病性機理的研究，主要集中在抗病性誘導[3-5]、 抗病基因定位[6-7]、 分子標記篩選[8-9]及抗性基因的轉化[10]．這些研究都集中在分子水平上，而在蛋白質水平上的研究報道很少．煙草自身的抗病性與蛋白的表達與調控密切相關，因此本研究從蛋白質水平入手，研究不同煙草品種接種赤星病菌后差異表達的蛋白質，旨在探討不同抗性煙草品種在蛋白質組學水平上存在的差異及其對赤星病抗性的影響，為進一步明確煙草的抗赤星病機制提供新內容．

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試煙草品種為“云煙87” “K326”和“Beinhart1000-1”，由中國農業(yè)科學院煙草研究所提供．播種于溫室花盆內，后移栽于溫室，常規(guī)管理，當8～10片真葉完全展開時接種．供試菌株在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d后待用．

1.2 取 樣

在煙草植株10葉期，選擇煙株下部未變黃的葉片接種菌餅，每張葉片上接種2個菌餅，接種3片葉片，接種后25 ℃保濕培養(yǎng)，每天觀察葉片受病菌侵染后情況，感染后第6 d取樣，取接種葉片的上部第一片葉片，以接種前作空白對照，“云煙87”感染前(Y0d)、 “云煙87”感染后第6 d(Y6d)、 “K326”感染前(K0d)、 “K326”感染后第6 d(K6d)、 “Beinhart1000-1”感染前(B0d)和“Beinhart1000-1”感染后第6 d(B6d)共6個樣本．每個樣本稱取2 g葉片，樣品液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.3 雙向電泳

取2 g葉片樣品液氮研磨成細粉狀，加入10 mL預冷的TCA-丙酮(1∶9)，渦旋混勻，置于-20 ℃沉淀過夜，4 ℃離心40 min(6 000 r/min)，棄上清．加入預冷丙酮，洗滌3次．通風櫥中干燥沉淀．分別加入500 μL 2D裂解液(9.5 mol/L尿素，4% CHAPS，60 mmol/L DTT，體積分數(shù)為2%的ampholytes，使用時每500 μL裂解液加入10 μL 50×Protein Inhibitor Cocktail Set I)，震蕩混勻重懸沉淀，冰浴超聲處理(100 W，持續(xù)10 s，間隔8 s，重復8次)，4 ℃離心30 min(12 000 r/min)，取上清，使用Bradford 法進行定量，測蛋白質濃度后，分裝于-80 ℃冰箱保存．取處理好的蛋白樣品20 μL，使用12% 分離膠，5% 濃縮膠進行SDS-PAGE，再經(jīng)考馬斯亮藍R-250染色檢測．

分別取樣品100 μg，進行雙向電泳，13 cm IPG預制膠條(pH值為3～10，非線性膠條)，采用EttanTMIPGphorTM等電聚焦系統(tǒng)(GE Amersham)進行等電聚焦，IPG膠條在水化緩沖液中再水化12 h，IEF分4步進行： 30 V，12 h； 500 V，1 h； 1000 V，1 h； 8000 V，8 h．等電聚焦結束后，使用兩步法進行平衡[11]，然后轉移到12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上之后將條帶進行第二維電泳．使用Hofer SE 600系統(tǒng)(GE Amersham)以15 mA/塊凝膠進行電泳30 min，待樣品完全轉移出IPG膠條，加大電流至30 mA/塊凝膠，直到溴酚藍到達凝膠下沿0.5 cm處，電泳結束．

電泳結束后取出凝膠，加入固定液(40% 乙醇，10% 冰醋酸)固定過夜，再加入浸泡液(30% 乙醇，6.8% NaAc，0.312% NaS2O3·5H2O)處理30 min，倒掉，用MilliQ水沖洗3次，每次5 min； 將清洗后的膠加入染色液(0.25 % 硝酸銀)中染色20 min，倒掉染色液，用MilliQ水沖洗2次，每次1 min； 放置于顯影液(2.5%無水碳酸鈉，0.04%甲醛)中顯色，直至蛋白質點清晰可見，加入終止液(1.46% EDTA-2Na·2H2O)，終止反應； 加入MilliQ水洗3次，每次5 min，再加入10%冰醋酸保存．

1.4 圖像分析

使用UMax Powerlook 2110XL(UMax)掃描染色的凝膠，并使用ImageMaster 2D Platinum(版本5.0，GE Amersham)完成圖像分析．手動驗證每個配對斑點以確保在3份數(shù)據(jù)中產生的標準化點膠體之間的高度再現(xiàn)性．選擇重疊測量比以發(fā)現(xiàn)蛋白質表達變化，并且具有1.2倍或更大重疊率閾值過濾的蛋白質被認為是差異表達的．確定差異表達的蛋白質點，并從膠上挖取差異點．

1.5 MALDI-TOF/TOF分析及數(shù)據(jù)庫檢索

1.5.1 膠內酶解及Ziptip脫鹽

將目標蛋白點切下，裝入離心管中做好標記，將膠粒切碎后加入50 μL銀染脫色液(銀染脫色液：V30 mmol/L鐵氰化鉀∶V100 mmol/L硫代硫酸鈉=1∶1混合)脫色，清洗脫色至透明，吸棄上清，再加入100 μL 100 mmol/L碳酸氫銨，室溫孵育15 min，吸棄上清凍干，之后加入5 μL 10 mg/L測序級Trypsin(胰蛋白酶，Promega)溶液，37 ℃反應過夜(20 h左右)； 將過夜消化的酶解液吸出，轉移至新的離心管中，在原管加入 100 μL 60% ACN/0.1% TFA，超聲溶解 15 min，合并酶解液凍干； 若有較多鹽分，則用 Ziptip(millipore)進行脫鹽．首先用50% 的ACN濕潤吸嘴，再用60% ACN/0.1% TFA潤洗兩次，然后用吸嘴反復吸打樣品液，以除去鹽類和雜質，最后用60% ACN/0.1% TFA清洗吸嘴兩次，將所有溶液合并凍干．

1.5.2 質譜分析

將凍干后的酶解樣品，取 2 μL 20% 乙腈復溶．取1 μL溶解后的樣品，直接點于樣品靶上，讓溶劑自然干燥后，再取 0.5 μL過飽和 CHCA 基質溶液(溶劑為 50% ACN0.1% TFA)點至對應靶位上并自然干燥．樣品靶經(jīng)氮氣吹凈放入儀器進靶槽并用串聯(lián)飛行時間質譜儀(5800 MALDI-TOF/TOF，AB SCIEX)進行測試分析，激光源為355 nm波長的Nd： YAG激光器，加速電壓為2 kV，采用正離子模式和自動獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù)，一級質譜(MS)掃描范圍為800～4 000 Da，選擇信噪比大于50的母離子進行二級質譜(MS/MS)分析，每個樣品點上選擇8個母離子，二級質譜(MS/MS)累計疊加2 500次，碰撞能量 2 kV，CID關閉．

1.5.3 數(shù)據(jù)庫檢索

質譜測試原始文件用 Mascot 2.2 軟件檢索相應的數(shù)據(jù)庫，最后得到鑒定的蛋白質結果．搜庫參數(shù)設置如下： Database： NCBI； Taxonomy： XXX； Type of search： Combined(MS+ MS/MS)； Enzyme： Trypsin； Fixed modifications： Carbamidomethyl (C) ； Dynamical modifications： Oxidation(M)； Mass values： Monoisotopic； Protein Mass： Unrestricted； Peptide Mass Tolerance： ± 100×10-6； Fragment Mass Tolerance： ± 0.4 Da； Peptide Charge State： 1+； Max Missed Cleavages： 1．

2 結果與分析

2.1 蛋白質定量及SDS-PAGE電泳檢測

對提取的樣品使用Bradford法進行蛋白質含量測定，樣品質量濃度見表1，并進行SDS-PAGE電泳檢

圖1 煙葉樣品蛋白SDS-PAGE電泳圖

測(圖1)，根據(jù)結果顯示“云煙87”對照(Y0d)濃度較低，后續(xù)雙向電泳上樣量為100 μg，根據(jù)樣品質量濃度計算雙向電泳上樣體積．

表1 煙葉樣品的蛋白質量濃度

2.2 雙向電泳圖譜及差異點分析

將提取的蛋白進行雙向電泳分析，使用pH值為3～10，13 cm的IPG預制膠條，蛋白上樣量為100 μg，雙向電泳銀染結果見圖2，提取的蛋白在各pH段都有分布，蛋白質點較清晰，分離較好．

將蛋白質凝膠雙向電泳圖譜經(jīng)Image Master軟件分析，通過比較感染前和感染后第6 d的雙向電泳圖譜，檢測差異蛋白點(圖3)．比較B6d和B0d膠圖有41個表達差異明顯的蛋白質點，比較K6d和K0d膠圖有46個表達差異明顯的蛋白質點，比較Y6d和Y0d膠圖有61個表達差異明顯的蛋白質點，共有148個表達差異明顯的蛋白質點．根據(jù)軟件分析結果，結合電泳圖譜，共選取48個表達差異顯著的蛋白質點進行質譜分析，其中上調表達的蛋白33個，下調表達的蛋白15個，具體見表2．

2.3 差異表達蛋白點的質譜鑒定

對選取的48個差異蛋白點進行質譜鑒定，成功鑒定出38個蛋白質點(質譜匹配肽段得分高于60，并且匹配得分可信度大于95%)，結果見表3，其中上調表達蛋白28個，下調表達蛋白10個．根據(jù)這38個蛋白所參與的代謝途徑和生化功能將它們歸納成以下類群： 碳代謝途徑相關的蛋白質有甘油醛-3-磷酸脫氫酶(B308，K328)和羧甲烯丁烯羥酸內酯酶同系物(B559)； 光合作用相關的蛋白質包括鐵氧還蛋白酶還原酶(B412，Y607)，PsbP結構域蛋白6(B619)，類囊體腔15kDa蛋白1(B889)，葉綠素a-b結合蛋白8(K581)，類PsbP蛋白1(K774)，果糖二磷酸醛縮酶1(Y537)，類囊體內腔19 kDa蛋白(Y875)和1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCo)相關蛋白(K820，Y440，Y462，Y1172)； 能量代謝相關的蛋白質包括類DNA甲基化因子4(B728)，磷酸甘油酸激酶(K270)，蘋果酸脫氫酶(K342，Y579)，PNSL5(K742)，ATP 合成酶CF1ε亞基(K789)，磷酸甘油酸激酶(Y449)和碳酸酐酶(Y769)； 防御相關的蛋白質包括過氧化物酶N1(K421)，谷胱甘肽S-轉移酶(K607)，PR-5(K633)，GGAT(Y331)，PP2-B11(Y1039)和銅/鋅超氧化物歧化酶(Y1088)； 蛋白合成相關的蛋白質包括2-亞甲基-3-呋喃酮還原酶(B330，Y535，Y538)和FKBP19(Y958)； 同時還有5個未知蛋白(B319，B531，K409，K427，Y637)．

圖2 煙葉樣品蛋白雙向電泳圖(13 cm，pH=3～10，12.5% SDS-PAGE)

圖3 雙向電泳圖譜差異點分析

表2 差異點選取

續(xù)表2

表3 差異表達蛋白的MALDI-TOF/TOF質譜結果

3 討 論

甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)是糖酵解反應中一種非常關鍵的酶，常用作研究其他基因和蛋白表達的內參．隨著研究的深入，越來越多的試驗證實GAPDH蛋白功能的多樣性，如GAPDH在植物中與各種環(huán)境的壓力表現(xiàn)出抗逆性有關[12]．有研究人員在分子水平上檢測到馬鈴薯的GAPDH基因受病原物侵染誘導表達[13]，并且在致病疫霉侵染馬鈴薯最初的24 h內就有反應[14]，本研究鑒定到的兩個甘油醛-3-磷酸脫氫酶(B308，K328)在受到病原菌侵染后均上調表達，也進一步在蛋白水平上驗證了GAPDH蛋白在病原菌侵染過程中發(fā)揮作用，另外，根據(jù)結果也可以得出在研究病菌侵染過程中GAPDH基因不適合作為基因表達的內參．

本研究共鑒定到12個與光合作用有關的蛋白質，其中有8個上調表達的蛋白： 鐵氧還蛋白酶還原酶(B412，Y607)，PsbP結構域蛋白6(B619)，果糖二磷酸醛縮酶1(Y537)，類囊體內腔19 kDa蛋白(Y875)，1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCo)相關蛋白(Y440，Y462，Y1172)； 4個下調表達的蛋白： 類囊體腔15kDa蛋白1(B889)，葉綠素a-b結合蛋白8(K581)，類PsbP蛋白1(K774)和1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亞基(K820)．其中1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCo)是光合作用中的一個關鍵酶，本研究發(fā)現(xiàn)4個RuBisCo相關蛋白，其中在“K326”中鑒定到的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亞基在被赤星病菌侵染后下調表達，“云煙87”中有2個二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶2和1個二磷酸核酮糖羧化酶小鏈在被赤星病菌侵染后上調表達．光合作用是植物中最重要的代謝過程，赤星病侵染顯著影響光合作用的速率，RuBisCo作為光合作用中的一個關鍵酶，其表達量增加會增強光合作用以供給更多能量從而抵抗病毒侵染，而酶的減少表明植株在受到病菌侵染后光合作用下降，同時部分蛋白開始降解，植株開始逐漸衰弱，進一步降低了對病原菌的抵抗能力，從而加速了植株的發(fā)病，這也表明了“云煙87”和“K326”對赤星病侵染的抗性不同．

本研究共鑒定到能量代謝相關的蛋白質8個，其中有6個上調表達的蛋白： 類DNA甲基化因子4(B728)，磷酸甘油酸激酶(K270)，蘋果酸脫氫酶(Y579)，PNSL5(K742)，磷酸甘油酸激酶(Y449)，碳酸酐酶(Y769)； 2個下調表達的蛋白蘋果酸脫氫酶(K342)和ATP 合成酶CF1ε亞基(K789)．ATP合成酶是參與能量代謝的關鍵酶，有研究提出病原菌的侵染初期，作為細胞內能量轉換核心酶的ATPase下調表達，表明煙草在被侵染初期電子傳遞和能量傳遞能力減弱，即在病原物侵染初期某些生理途徑被病原菌破壞，或被病原菌產生的降解酶和毒素抑制從而降低植株呼吸作用強度，觸發(fā)植物的主動抗病機制，是植株主動防御機制起作用的必要過程[15]．

本研究共鑒定到防御相關的蛋白質6個，其中有4個上調表達的蛋白： 過氧化物酶N1(K421)，谷胱甘肽S-轉移酶(K607)，PR-5(K633)和GGAT(Y331)； 2個下調表達的蛋白PP2-B11(Y1039)和銅/鋅超氧化物歧化酶(Y1088)．研究表明，在植物受到外界脅迫時，植株體內的GST活性會顯著升高，以保護生物體免受逆境的損害[16]．本研究也鑒定到了谷胱甘肽S-轉移酶(K607)在感染赤星病后上調表達，與前期研究一致．本研究還鑒定到一個感染赤星病后上調表達的osmotin-like protein(K633)類滲調蛋白(OLP)，它屬于PR-5蛋白．PR-5蛋白包含了具有多種抗逆功能的滲調蛋白(osmotin)和類滲調蛋白(OLP)．有研究表明，馬鈴薯被致病疫霉(P.infestans)感染后能檢測到OLP蛋白的增加[17]．PR-5蛋白具有抗真菌、 抗凍和抗?jié)B透壓力等多種生物學活性，參與植物系統(tǒng)獲得性反應(SAR)和超敏反應(HR)，在植物抵御生物和非生物脅迫中具有重要作用[18]．當受到病原侵害時植物可以產生系統(tǒng)獲得性抗性，發(fā)生系統(tǒng)獲得性抗性過程時植物的細胞內會發(fā)生一系列的生理生化反應，其中就包括PR蛋白表達．

綜上所述，在本研究中，接種病菌后煙草葉片中參與各個代謝過程的相關蛋白并不是呈現(xiàn)單一的變化趨勢，煙草的抗性機制是十分復雜的，涉及大量基因的誘導表達與調控，這些基因的表達結果往往導致蛋白質的變化．本研究得到了煙草對赤星病菌應答網(wǎng)絡中表達量發(fā)生顯著變化的差異蛋白，但所得到的差異蛋白在應答機制中的具體作用有待進一步的深入研究．總之，煙草對赤星病抗性機制復雜，其中涉及眾多的信號物質和抗性相關蛋白，隨著蛋白質組學等技術的發(fā)展和應用，將會有更多的抗性相關基因和蛋白被挖掘，進而大大提高人們對煙草與赤星菌互作機理的認識．