宋萌萌 黃天然 周興虎 張亞莉 黃明

摘 要：從燒雞中篩選出產(chǎn)芽孢菌，探究高溫巴氏殺菌后燒雞腐敗的主要原因。利用劃線純化法、革蘭氏染色法結合芽孢染色法從燒雞及其鹵湯中篩選出產(chǎn)芽孢菌，然后對菌株進行16S rRNA分析及生理生化鑒定，確定菌株的種屬，并對菌株的生長曲線及耐鹽、耐酸和耐熱性進行研究。結果表明：從燒雞及其鹵湯中共篩選分離出4 株革蘭氏陽性芽孢桿菌，分別為海水芽孢桿菌（Bacillus aquimaris）、黃海芽孢桿菌（Bacillus marisflavi）、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），其中，地衣芽孢桿菌的生長繁殖速度最快，至6 h就基本進入生長穩(wěn)定期;海水芽孢桿菌和黃海芽孢桿菌的耐鹽性最強，在NaCl質量濃度達到12 g/100 mL時仍然有部分存活;甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌的耐酸性最強，在pH值4.5條件下培養(yǎng)6 h后菌落數(shù)能夠達到約8（lg（CFU/mL））;在4 株產(chǎn)芽孢菌中，地衣芽孢桿菌的耐熱性最強，且不受處理溫度和時間的影響。

關鍵詞：燒雞;產(chǎn)芽孢菌;分離鑒定;腐敗;耐受性

Isolation and Identification of Spore-Forming Bacteria from Braised Chicken and Comparison of

Their Environmental Tolerance

SONG Mengmeng1，2， HUANG Tianran1， ZHOU Xinghu1， ZHANG Yali2， HUANG Ming1，2，*

（1.National R&D Center for Poultry Processing， Jiangsu Research Center for Livestock and Poultry Products Processing Engineering Technology， Nanjing Huangjiaoshou Food Science and Technology Co. Ltd.， Nanjing 211225， China;

2.Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control， Ministry of Education， College of Food Science and Technology，

Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract： This study was conducted to select spore-forming strains from braised chicken for the purpose of figuring out the major cause of its spoilage after high-temperature pasteurization. The target strains were isolated from braised chicken and the remaining marinade by the streak plate method as well as through Gram staining and spore staining and were identified as Bacillus by 16S rRNA analysis and physiological and biochemical characterization. Their growth curves and tolerance to salt， acid and heat were investigated. The results indicated that a total of four Gram-positive Bacillus were obtained and they were identified as B. aqimaris， B. marisfavi， B. methyltrophicus and B. licheniformis. Among them， B. licheniformis grew fastest， which entered the stationary phase of growth at 6 h. In the presence of 12 g/100 mL NaCl solution， B. aquimaris and

B. marisflavi survived partially， showing the highest salt tolerance. B. methylotrophicus could grow to ～ 8 （lg （CFU/mL）） after 6 h cultivation at pH 4.5， having the highest acid resistance. B. licheniformis was the most heat resistant among the four strains ， which was not affected by heat treatment temperature and time.

Keywords： braised chicken; spore-forming bacteria; isolation and identification; spoilage; tolerance

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210817-203

中圖分類號：TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2021）10-0018-07

引文格式：

宋萌萌， 黃天然， 周興虎， 等. 燒雞中產(chǎn)芽孢菌的分離鑒定及耐受性比較研究[J]. 肉類研究， 2021， 35（10）： 18-24. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210817-203.? ? http：//www.rlyj.net.cn

SONG Mengmeng， HUANG Tianran， ZHOU Xinghu， et al. Isolation and identification of spore-forming bacteria from braised chicken and comparison of their environmental tolerance[J]. Meat Research， 2021， 35（10）： 18-24. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210817-203.? ? http：//www.rlyj.net.cn

燒雞是我國典型的傳統(tǒng)醬鹵肉制品，至今已有幾百年的歷史，因其濃郁的香味以及獨特的口感，備受中國消費者的喜愛和關注，有著“天下第一雞”的美稱[1]。燒雞營養(yǎng)豐富，水分活度高，微生物很容易在其表面和內(nèi)部大量繁殖而引起腐敗。鹵煮是燒雞的主要加工步驟，其溫度相對較低，雖然可以導致大部分細菌的死亡，但對于超耐熱的微生物，尤其是一些細菌的芽孢，則難以殺滅[2]。

引起食品腐敗的微生物，除了普通的假單胞菌、大腸桿菌、乳酸菌屬等，還有芽孢桿菌屬[3]。芽孢桿菌屬是革蘭氏陽性桿菌[4]，在空氣、土壤[5]甚至外太空[6]中都有分布，在不利條件下產(chǎn)生的芽孢能夠存活數(shù)年[7]，這種休眠體結構復雜[8]，對熱[9]、紫外線[10]、化學物質[11]、溶菌酶[12]、干燥[13]具有很強的抗逆性，是造成肉制品腐敗[14]

和食源性疾病[15-16]的主要原因，并且很難通過巴氏殺菌方式除去[17]。芽孢在食品中存在的原因有以下幾點：1）巴氏殺菌幾乎殺死了所有具有潛在競爭作用的營養(yǎng)細胞;2）產(chǎn)芽孢菌會附著于不銹鋼表面，形成生物膜，生物膜脫落時釋放的芽孢會導致食品在加工過程中被污染。當外界環(huán)境適宜時，食品中殘留的芽孢便開始萌發(fā)，導致食品腐敗變質，甚至在代謝過程中產(chǎn)生毒素。芽孢主要通過以下2 種方式致病：1）存在于食品中的芽孢在萌發(fā)時產(chǎn)生毒素，消費者食用了被芽孢毒素污染的食品;2）消費者食用了有芽孢殘留的食品，芽孢在人體腸道內(nèi)萌發(fā)，產(chǎn)生毒素，從而誘發(fā)食源性疾病。并且，芽孢可污染多種食品，包括肉類、蔬菜、水果、糧食等，給食品行業(yè)帶來巨大挑戰(zhàn)。研究燒雞中的產(chǎn)芽孢菌有助于了解燒雞腐敗的原因，改善燒雞保鮮方法。

細菌種屬的鑒定方法分為2 種，一種是經(jīng)典法，即通過肉眼及顯微鏡觀察菌落形態(tài)、染色結果，并檢測碳、氮源的利用等;另一種是分子法，其中最常見的是16S rRNA測序。16S rRNA基因存在于所有細菌的基因組中，保守性高，可用來揭示菌種之間的親緣關系。此外，多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）也被用于菌種鑒定，是一種基于核酸序列測定的細菌分型方法，能夠分析菌株的變異，具有較高的分辨能力。16S rRNA測序具有高度的靈敏性和特異性，且速度快，檢測能力強，被廣泛應用于菌種鑒定、菌群結構及數(shù)量測定等[18-19]。

因此，本研究從燒雞及其老鹵湯中分離篩選出其中的產(chǎn)芽孢菌，通過生理生化反應和16S rRNA鑒定確認分離出的產(chǎn)芽孢菌株的種類，然后對其生長曲線和耐酸、耐鹽、耐熱性進行研究，為肉品中產(chǎn)芽孢菌的控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燒雞由某食品科技有限公司提供。

營養(yǎng)瓊脂、革蘭氏染色試劑盒、生理生化鑒定管? ?南京丁貝生物科技有限公司;LB肉湯 南京沃博生物科技有限公司;芽孢染色試劑盒 南京邁博生物科

技有限公司;氯化鈉（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SG403A生物安全柜 美國Baker公司;B1-150A生化培養(yǎng)箱 施都凱儀器設備（上海）有限公司;Multitron Standard振蕩培養(yǎng)箱 伊孚森生物技術（中國）有限公司;Allegra-64R高速冷凍離心機 美國Beckman公司;HH-W恒溫水浴箱 金壇市恒豐儀器制造有限公司;Scope.A1正置熒光顯微鏡 德國Carl Zeiss公司;FP-1100-C全自動生長曲線分析儀 芬蘭Bioscreen公司。

1.3 方法

1.3.1 采樣

老鹵：吸取1 mL燒雞鹵湯于9 mL無菌生理鹽水中，渦旋。

燒雞：拭子蘸取無菌生理鹽水，在燒雞的口腔處選擇合適的取樣框進行涂抹，另取幾只新的拭子，分別在腹腔、腿及表皮處涂抹，取樣完成后將拭子放入10 mL生理鹽水中，渦旋。

1.3.2 分離純化

采用傾注法，吸取1 mL上述均質液于無菌培養(yǎng)皿中，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取可疑單菌落進行劃線分離。觀察并記錄純化單菌落的表面狀況、凸起情況、邊緣狀況、菌落形狀、表面光澤、菌落顏色、透明程度等。再次挑取可疑純化單菌落進行液體培養(yǎng)（37 ℃、180 r/min、24 h）。

1.3.3 染色鏡檢

革蘭氏染色：使用革蘭氏染色試劑盒染色，油鏡觀察。

芽孢染色采用Schaeffer-Fulton法[20]：活化的菌懸液按體積分數(shù)1%接種于LB液體培養(yǎng)基，搖床（37 ℃、220 r/min）培養(yǎng)72 h，吸取1 mL用磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）離心（7 000 r/min、15 min、4 ℃）洗滌4 次，棄上清液，取沉淀重懸于PBS中，適量稀釋。涂片，自然干燥后，吸取適量孔雀綠染色液覆蓋涂片，弱火間斷加熱染色10 min后，沖洗去多余染色液;干燥后用芽孢復染液覆蓋染色2～3 min，用水沖洗，晾干后鏡檢觀察。

1.3.4 生理生化鑒定

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[21]中芽孢菌屬鑒別特征，選擇生理生化指標進行菌種的初步鑒定。

1.3.5 16S rRNA鑒定

純化分離的菌懸液送至上海凌恩生物科技有限公司進行16S rRNA鑒定，使用NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對測序結果進行比對，確定菌種并上傳獲得登錄號。

1.3.6 生長曲線測定

將活化的菌懸液接種于LB肉湯，調節(jié)菌懸液濃度為4（lg（CFU/mL））。吸取400 μL于全自動生長曲線分析儀自帶的孔板中，用全自動生長曲線分析儀測定600 nm波長處光密度（OD600 nm）（儀器參數(shù)：溫度37 ℃、時間24 h）;剩余樣品搖床（37 ℃、220 r/min）培養(yǎng)24 h，每3 h取一次樣，進行適宜梯度稀釋并涂板計數(shù)，繪制生長曲線[22]。

1.3.7 耐鹽性測定

配制NaCl質量濃度分別為1、3、6、9、12 g/100 mL的LB營養(yǎng)肉湯，接入4（lg（CFU/mL））菌懸液，搖床（37 ℃、220 r/min）培養(yǎng)12 h，涂板計數(shù)[23]。

1.3.8 耐酸性測定

將約6（lg（CFU/mL））的菌懸液接種于pH值分別為2.5、3.5、4.5、6.5、7.0的LB營養(yǎng)肉湯中，搖床（37 ℃、220 r/min）培養(yǎng)6 h后，涂板計數(shù)[24]。

1.3.9 耐熱性測定

將活化的菌懸液以4（lg（CFU/mL））接種于LB營養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)12 h。于85、90、95 ℃水浴分別處理0、5、15、25 min，迅速冰浴，平板計數(shù)，并求出D值[25]。D值是一定溫度條件下殺死細菌中90%原有活菌所需要的時間，計算公式如下。

式中：t為處理時間/min;a為初始菌數(shù)/（CFU/mL）;b為經(jīng)一定時間（t）處理后的菌數(shù)/（CFU/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結果表示為平均值±標準差（n=3）。微生物計數(shù)以菌落形成單位的對數(shù)值（lg（CFU/mL））表示，采用Origin 9.0軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 燒雞及其鹵湯中產(chǎn)芽孢菌的分離

共篩選出4 個可疑菌落，分別編號為T17、T19、T27和T29，對這4 株可疑菌株進一步鑒定。

2.1.1 分離菌株的單菌落形態(tài)觀察及染色結果

觀察記錄4 個菌落的形態(tài)特點，如表1所示。

通過Schaeffer-Fulton法對培養(yǎng)菌液染色，由圖1可知，可疑菌株T17、T19、T27、T29染色后，通過油鏡均能觀察到呈現(xiàn)綠色的芽孢，說明這4 株菌均能生成芽孢。此外，從菌體（紅色）形態(tài)觀察可知，4 株菌的菌體都呈桿狀。

2.1.2 生理生化鑒定結果

依據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏細菌鑒定手冊》，進行生理生化指標測定，結果如表2所示。結合菌落形態(tài)（表1）可初步判斷篩選出的菌株T17、T19、T27、T29均屬于芽孢桿菌屬。

2.1.3 16S rRNA鑒定結果

將分離出的4 株菌進行16S rRNA鑒定，并上傳序列至Genbank以獲得登錄號。由表3可知，4 株菌的相似度均達到99%以上，說明16S rRNA鑒定結果較好。4 株菌分別為海水芽孢桿菌、黃海芽孢桿菌、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。

2.2 燒雞及其鹵湯中芽孢桿菌的生長特性

2.2.1 不同芽孢桿菌的生長曲線

通過繪制生長曲線，了解各芽孢桿菌生長特性，為后續(xù)各菌培養(yǎng)時間提供參考。由圖2可知，各株芽孢桿菌在LB肉湯中的生長特性有所不同，但菌落數(shù)最終都能達到9～10（lg（CFU/mL））。菌株T17（海水芽孢桿菌）在0～12 h處于增長期，12～18 h生長緩慢，18 h后生長較為穩(wěn)定（圖2A）;T19（黃海芽孢桿菌）前6 h生長緩慢，6～12 h為快速生長期，12 h后菌落數(shù)緩慢增加（圖2B）;T27（甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌）在0～6 h為生長遲緩期，6～15 h為生長對數(shù)期，而后生長緩慢（圖2C）;T29（地衣芽孢桿菌）在前6 h呈對數(shù)增長，6 h后生長緩慢（圖2D）。

海水芽孢桿菌、黃海芽孢桿菌和甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌3 株芽孢桿菌在3～12 h期間生長最快，12 h基本穩(wěn)定，符合芽孢桿菌的生長特性[26]。陳秀秀等[27]分離的凝結芽孢桿菌也有類似的生長趨勢，菌株在4 h進入對數(shù)生長期，14 h進入穩(wěn)定期。并且，4 株芽孢桿菌在37 ℃培養(yǎng)結束后菌落數(shù)能達到8～10（lg（CFU/mL）），這與游佳欣等[28]實驗結果相似，枯草芽孢桿菌在35 ℃條件下培養(yǎng)，菌落數(shù)可達8.56（lg（CFU/mL）），其中地衣芽胞桿菌的生長繁殖速度較快，6 h之后緩慢增長，魏強等[29]也得出了類似結果，地衣芽孢桿菌在3 h開始快速增長。

2.2.2 不同芽孢桿菌的耐鹽性實驗結果

將初始菌落數(shù)約為4（lg（CFU/mL））的菌液接種于含不同質量濃度NaCl的LB營養(yǎng)肉湯中，搖床培養(yǎng)12 h后計數(shù)。由圖3可知，在低質量濃度NaCl（≤3 g/100 mL）培養(yǎng)肉湯中，對4 株芽孢桿菌的生長幾乎無影響，其菌落數(shù)可達到8～10（lg（CFU/mL））。當NaCl質量濃度達到6 g/100 mL時，4 株芽孢桿菌的生長均受到不同程度的抑制作用，其中菌株T19（黃海芽孢桿菌）和T27（甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌）受到的抑制作用較小，而T29（地衣芽孢桿菌）的菌落數(shù)小于初始菌落數(shù)。NaCl質量濃度為9 g/100 mL時，除了T19，其余芽孢桿菌的菌落數(shù)均低于初始值。而T17（海水芽孢桿菌）和T19（黃海芽孢桿菌）在NaCl質量濃度達到12 g/100 mL時依然有約3（lg（CFU/mL））的菌存活。

含低質量濃度NaCl（≤3 g/100 mL）的LB營養(yǎng)肉湯對本研究中芽孢桿菌的生長沒有影響，高質量濃度NaCl（>6 g/100 mL）不利于芽孢桿菌的生長，這與駱琦[30]從燒雞老湯中篩選出的枯草芽孢桿菌的耐鹽性一致，NaCl質量濃度高于5 g/100 mL時，枯草芽孢桿菌的生長受到抑制，當NaCl質量濃度達到12 g/100 mL時，有些芽孢桿菌則不生長。陳蒙恩等[31]分離的一株產(chǎn)香芽孢桿菌在NaCl質量濃度小于10 g/100 mL時有生長，NaCl質量濃度大于10 g/100 mL時則無生長，與本研究結果類似。菌株T17（海水芽孢桿菌）和T19（黃海芽孢桿菌）表現(xiàn)出高耐鹽性，其耐鹽機制可能是通過調節(jié)自身耐鹽基因的表達來實現(xiàn)[32]。

2.2.3 不同芽孢桿菌的耐酸性實驗結果

將初始菌落數(shù)約為6（lg（CFU/mL））的菌液在不同pH值條件下培養(yǎng)6 h。由圖4可知，當培養(yǎng)基pH值為6.5時，4 株芽孢桿菌的生長基本不受影響。當pH<4.5時，所有芽孢桿菌的菌落數(shù)均小于初始菌落數(shù)。在分離出的4 株芽孢桿菌中，菌株T27（甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌）耐酸能力最強，當pH值為4.5時，仍能生長良好且菌落數(shù)最終達到約8（lg（CFU/mL））。菌株T17（海水芽孢桿菌）和T19（黃海芽孢桿菌）耐酸能力較弱，當培養(yǎng)基pH值為5.5時，培養(yǎng)6 h后，其菌落數(shù)低于初始菌落數(shù)。而T29（地衣芽孢桿菌）在pH≥5.5時，生長繁殖不受影響，說明地衣芽孢桿菌耐酸能力較好。4 株菌在pH值為2.5時菌落數(shù)很少，李新等[33]分離的沙福芽孢桿菌的耐酸性實驗也有類似的結果，在pH值為2左右時，菌株的生長很微弱。

2.2.4 不同芽孢桿菌的耐熱性實驗結果

由圖5可知，4 株芽孢桿菌經(jīng)過85、90、95 ℃水浴處理5 min后，菌落數(shù)下降4～8（lg（CFU/mL））。且隨著處理溫度的升高，芽孢桿菌的存活率下降。85 ℃和95 ℃熱處理菌株T17時，15 min前菌落數(shù)呈下降趨勢，但是當處理時間大于15 min后，殘存菌落數(shù)不降反升;而在90 ℃條件下，T17菌落數(shù)隨著處理時間的延長而減少，當處理時間達到25 min時，T17營養(yǎng)體細胞被全部殺滅。菌株T19在3 個不同溫度條件下，菌落數(shù)均隨著處理時間的延長而減少，但處理5 min后，菌落數(shù)減少緩慢。相對于其他3 株菌，T27處理5 min能得到最大致死數(shù)，菌落數(shù)下降約8（lg（CFU/mL）），但繼續(xù)持續(xù)加熱時，T27的菌落數(shù)基本不變。在不同溫度熱處理5 min時，T29的菌落數(shù)減少值（4（lg（CFU/mL）））遠遠低于T27的減少值（8（lg（CFU/mL）））;且隨著處理時間延長，T17和T19的殘存菌落數(shù)都呈現(xiàn)不同程度的下降，而處理5 min之后，T29的菌落數(shù)隨著處理溫度的升高及處理時間的延長減少較小。

5 min的熱處理可以有效殺滅大部分芽孢桿菌營養(yǎng)體，但5 min后，不同的芽孢桿菌對溫度呈現(xiàn)出不同程度的抗性。這可能是由于隨著溫度和處理時間的變化，菌株細胞膜中的長鏈飽和脂肪酸比例升高，增加其耐熱性[34]。

85 ℃處理下芽孢桿菌的存活率高于90 ℃和95 ℃，這與謝曉佩等[35]從西藏牦牛的新鮮糞便中分離出的枯草芽孢桿菌的耐熱性相似。另外，由于T29（地衣芽孢桿菌）在不同溫度條件下處理5 min時的存活率整體較高，且處理5 min后其菌落數(shù)基本不受處理溫度和時間的影響，說明地衣芽孢桿菌在4 株菌中的耐熱性最強。在90 ℃條件下處理5 min后，T29（地衣芽孢桿菌）的耐熱性在每個時間點均高于其余菌株，這與羅鵬[36]的結果類似，即地衣芽孢桿菌在90 ℃的耐熱性較好。

2.2.5 地衣芽孢桿菌的D值

T29（地衣芽孢桿菌）的耐熱性優(yōu)于其他3 株菌，因此，制作T29的耐熱性曲線。由圖6可知，不同溫度熱處理條件下T29的D值分別為：D85 ℃=24.36 min（R2=0.978 69）、D90 ℃=17.19 min（R2=0.780 78）、D95 ℃=78.93 min（R2=0.891 72）。在95 ℃時，D值不降反升，而羅鵬[36]所分離的地衣芽孢桿菌在90 ℃條件下的D值大于100 ℃條件下;吳霜[37]發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌的D值隨著溫度的升高而降低，這與本研究結果不符，可能是由于在95 ℃處理時，部分營養(yǎng)體裂解生成芽孢，芽孢的抗熱性是營養(yǎng)細胞的104 倍，主要是由于芽孢核內(nèi)2，6-吡啶二羧酸的存在，此種成分的積累使芽孢核內(nèi)水分排出，導致芽孢核水分含量極低，從而增加了抗熱性[38-39]。

3 結 論

經(jīng)純化篩選，燒雞及其鹵湯中共分離得到4 株芽孢桿菌，通過生理生化鑒定以及16S rRNA鑒定確認為海水芽孢桿菌、黃海芽孢桿菌、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。測定4 株菌的生長曲線，并分別進行耐受性實驗。結果表明：地衣芽孢桿菌最快進入生長對數(shù)期，到6 h基本穩(wěn)定;4 株菌都呈現(xiàn)出不同程度的耐酸和耐鹽能力，而地衣芽孢桿菌耐熱性在4 株菌中最強，這為燒雞中芽孢的防控及貨架期的延長提供了很好的理論依據(jù)。

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收稿日期：2021-08-17

基金項目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉雞）產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項（CARS-41-Z06）;

南京市科技計劃項目（國際聯(lián)合研發(fā)項目）（202002040）

第一作者簡介：宋萌萌（1998—）（ORCID： 0000-0002-4993-132X），女，碩士研究生，研究方向為畜產(chǎn)品加工和質量控制。

E-mail： 2020108022@stu.njau.edu.cn

*通信作者簡介：黃明（1970—）（ORCID： 0000-0001-9026-1850），男，教授，博士，研究方向為畜產(chǎn)品加工和質量控制。

E-mail： mhuang@njau.edu.cn