陳雪萍，劉 航，張陽麗，彭 健，吳 江，張玉洪，府偉靈

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床分子醫(yī)學(xué)檢測(cè)中心,重慶 400042；2.重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院，重慶 400042；3.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，重慶 400038

胰腺癌被稱為癌中之王，放眼全球，胰腺癌都是最致命的癌癥之一[1-2]。 然而大多數(shù)胰腺癌患者在早期并沒有任何特殊的臨床癥狀,因此大多數(shù)胰腺癌患者都錯(cuò)過了最佳的治療時(shí)期。在過去的40年中并沒有發(fā)現(xiàn)可以顯著提升胰腺癌患者生存率的方法。胰腺癌患者的5年生存率為5%～15%，總體生存率約為6%，且僅有20%患者可以進(jìn)行手術(shù)切除[3]。因而早期診斷在胰腺癌防治過程中扮演著重要的角色。

目前胰腺癌的主要篩查診斷方法有超聲檢查、CT以及核磁共振，各自有優(yōu)缺點(diǎn)。超聲檢查很難區(qū)分出惡性組織和非惡性組織；CT 和核磁共振也是診斷胰腺癌的輔助手段，目前也無法滿足胰腺癌早期篩查的臨床需求。除此之外，許多的腫瘤抗原也被用作胰腺癌診斷的相關(guān)指標(biāo)。其中最有效和臨床應(yīng)用最廣的生物標(biāo)志物是CA19-9。然而CA19-9在機(jī)體具有其他炎癥的狀態(tài)下水平也會(huì)升高，特異性較低，這也限制了其作為胰腺癌術(shù)后檢測(cè)指標(biāo)的應(yīng)用發(fā)展[4-5]。目前還沒有有效且準(zhǔn)確的生物標(biāo)志物用于胰腺癌早期篩查和診斷。

miRNA是一類大小約為22 bp的非編碼單鏈RNA分子，它們?cè)诩?xì)胞增殖、蛋白質(zhì)代謝和腫瘤形成等生理、病理過程中扮演著重要的功能。有研究報(bào)道m(xù)iRNA參與實(shí)體瘤的發(fā)生、發(fā)展。在胰腺癌中，miRNA的上調(diào)或下調(diào)均與胰腺癌的進(jìn)展過程密切相關(guān)[6]。

既往有研究表明，miR-21及其下游靶標(biāo)在胰腺癌的細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期中起關(guān)鍵作用，miR-21可能是診斷胰腺癌的有潛力的生物標(biāo)志物[7]。研究表明miR-25對(duì)早期胰腺癌的診斷靈敏度和特異度分別達(dá)到76%和93%[8]。miR-25有助于鑒別慢性胰腺炎與胰腺癌，這也大大增加miRNA在胰腺癌中的應(yīng)用潛力，目前關(guān)于miR-25的臨床診斷效能評(píng)估也還在進(jìn)行中。這些報(bào)告表明，miRNA有作為胰腺癌早期篩查指標(biāo)的應(yīng)用前景。然而，迄今為止，這些基于miRNA的研究均未進(jìn)入臨床實(shí)踐，還需要更多的研究驗(yàn)證。因此，篩選胰腺癌的血漿腫瘤標(biāo)志物，對(duì)進(jìn)一步分析其作用的靶基因與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系具有重要的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 以“胰腺癌、miRNA、血漿”為關(guān)鍵詞檢索文獻(xiàn)，然后在NCBI數(shù)據(jù)庫GEO中進(jìn)行檢索，按包含胰腺癌標(biāo)本、其他腫瘤標(biāo)本、良性胰腺疾病、膽道疾病標(biāo)本及相應(yīng)正常胰腺標(biāo)本的基因芯片為標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過篩選，最終研究團(tuán)隊(duì)使用了編號(hào)為GSE124158和GSE59856的基因芯片數(shù)據(jù)。

1.2方法

1.2.1顯著差異miRNA的篩選 首先，采用GEO數(shù)據(jù)庫所提供的基于R語言的在線分析軟件GEO2R，將編號(hào)為GSE59856的基因芯片數(shù)據(jù)分為胰腺癌與健康對(duì)照組、胰腺癌與良性疾病對(duì)照組、胰腺癌與其他癌癥對(duì)照組3個(gè)對(duì)照組進(jìn)行初步篩選。然后，篩選標(biāo)準(zhǔn)|log2FC|≥1,經(jīng)過初步的分析篩選，分別得出3個(gè)對(duì)照組胰腺癌組織差異表達(dá)的miRNA。接著，通過同樣的處理步驟將編號(hào)為GSE124158中的數(shù)據(jù)也分為同樣的3個(gè)對(duì)照組進(jìn)行處理，設(shè)置相同的參數(shù)進(jìn)行篩選，分別得到相應(yīng)的胰腺癌組織差異表達(dá)的miRNA。進(jìn)一步使用Venn diagram webtool分析，分別得到每個(gè)對(duì)照組中初步分析所得到的差異表達(dá)的miRNA的重疊部分，取每個(gè)重疊部分的交集，最后得到的重疊部分為顯著差異表達(dá)的miRNA。

1.2.2靶基因預(yù)測(cè) 將上一步分析所得到的顯著差異miRNA運(yùn)用在線分析軟件DIANA tools進(jìn)行靶基因的預(yù)測(cè)[9]。

1.2.3關(guān)鍵基因的GO功能及KEGG通路富集分析 采用DAVID和KOBAS3.0對(duì)預(yù)測(cè)獲得的靶基因開展GO/KEGG通路富集分析，以進(jìn)一步分析靶基因?qū)σ认侔┗颊叩淖饔貌课患巴緩健?/p>

1.2.4靶基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過STRING數(shù)據(jù)庫對(duì)上述預(yù)測(cè)得到的靶基因進(jìn)行關(guān)鍵蛋白之間的相互作用關(guān)系分析，得到PPI相互作用圖，然后通過查詢相關(guān)的文獻(xiàn)，最后篩選出關(guān)鍵基因[10]。

1.2.5關(guān)鍵基因的TCGA驗(yàn)證分析 將上述篩選分析得出的關(guān)鍵基因?qū)朐诰€分析網(wǎng)站GEPIA、cBioPortal進(jìn)行TCGA表達(dá)譜的分析，再通過查找相關(guān)的文獻(xiàn)驗(yàn)證所篩選的關(guān)鍵基因與胰腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性，進(jìn)一步分析其在胰腺癌發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后中的作用。

2 結(jié) 果

2.1差異表達(dá)miRNA篩選 本次研究篩選了兩個(gè)基因芯片(GSE59856、GSE124158)(表1)進(jìn)行差異分析。在GSE59856中，得到胰腺癌與健康對(duì)照組內(nèi)差異表達(dá)miRNA 21個(gè)，胰腺癌與其他癌癥對(duì)照組內(nèi)差異表達(dá)miRNA 91個(gè)，胰腺癌與良性疾病對(duì)照組內(nèi)差異表達(dá)miRNA 60個(gè)。在GSE124158中，胰腺癌與健康對(duì)照組中差異表達(dá)miRNA 1 877個(gè)，胰腺癌與其他癌癥對(duì)照組中差異表達(dá)miRNA 43個(gè)，胰腺癌與良性疾病對(duì)照組中差異表達(dá)miRNA 47個(gè)。再用GSE124158 的數(shù)據(jù)分別對(duì)GSE59856每個(gè)對(duì)照組的數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，作VEEN圖，每個(gè)對(duì)照組分別得到13、9、6個(gè)差異表達(dá)miRNA(圖 1)，最后取3個(gè)對(duì)照組數(shù)據(jù)的交集，最終得到miR-122-5p為顯著差異表達(dá)的miRNA。

表1 GEO數(shù)據(jù)庫胰腺癌基因芯片樣本(n)

圖1 VEEN分析

2.2差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測(cè) 為了闡明差異表達(dá)miRNA的生物學(xué)功能及其具體的作用機(jī)制及通路，將上一步分析所得到的差異表達(dá)miRNA運(yùn)用在線數(shù)據(jù)庫DIANA tools和ENCORI預(yù)測(cè)miR-122-5p的靶基因，最終得到517個(gè)預(yù)測(cè)靶基因。

2.3差異表達(dá)miRNA的靶基因的GO富集和KEGG途徑分析 使用DAVID在線數(shù)據(jù)庫對(duì)517個(gè)靶基因的功能和通路進(jìn)行富集分析。GO功能富集分析結(jié)果表明，靶基因在生物過程中主要參與膠原蛋白分解代謝、GTP酶活性的調(diào)節(jié)、細(xì)胞間黏附、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控。細(xì)胞成分主要是聚集在細(xì)胞薄膜、細(xì)胞內(nèi)區(qū)、細(xì)胞間黏附連接、細(xì)胞頂端質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞表面。而分子功能主要與RNA聚合酶Ⅱ核心啟動(dòng)子近端區(qū)序列特異性DNA結(jié)合、泛素連接酶E3結(jié)合域、金屬肽酶活性、鋅離子結(jié)合、金屬內(nèi)肽酶活性、GTP酶活性有關(guān)。見表2。

表2 GO功能富集分析

KEGG的結(jié)果(圖 2)顯示，靶基因富集于抗原處理和呈遞、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)中的相互作用、黏蛋白型O-聚糖生物合成、甲狀腺激素合成、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、移植物抗宿主病、多巴胺能突觸、胰島素分泌、膽堿能突觸、糖基磷脂酰肌醇(GPI)-錨定物、心肌細(xì)胞腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)、幽門螺桿菌的上皮細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、1型糖尿病的介導(dǎo)、AMPK信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、黏著連接、心肌收縮、HIF-1信號(hào)通路、內(nèi)吞作用等。

續(xù)表2 GO功能富集分析

圖2 KEGG通路富集分析

2.4從PPI網(wǎng)絡(luò)中篩選關(guān)鍵基因 通過將所預(yù)測(cè)的靶基因利用在線數(shù)據(jù)庫STRING進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘及繪制，得到了蛋白質(zhì)之間的互相作用關(guān)系圖。進(jìn)一步通過相關(guān)文獻(xiàn)的查詢與篩查，篩選得出UBA52、ADAM10、CBL、VAMP3 這4個(gè)關(guān)鍵基因。然后將得到的結(jié)果導(dǎo)入到Cytoscape中，作出4個(gè)關(guān)鍵基因的互作圖 (圖3)。

圖3 關(guān)鍵基因互作圖

2.5TCGA驗(yàn)證分析 將篩選所得的4個(gè)關(guān)鍵基因使用在線分析網(wǎng)站GEPIA、cBioPortal分析發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照相比，胰腺癌患者體內(nèi)UBA52、CBL、VAMP3、ADAM10的表達(dá)均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于健康人。然后在GEPIA、cBioPortal網(wǎng)站中分析得出胰腺癌患者的生存曲線(圖 4)，發(fā)現(xiàn)與高表達(dá)VAMP3和ADAM10的胰腺癌患者相比，這2個(gè)基因低表達(dá)的患者總生存率更高(P<0.05)。UBA52和CBL的調(diào)節(jié)對(duì)胰腺癌患者的生存沒有影響(P>0.05)。

注:A和B分別為UBA52和CBL基因，兩基因與胰腺癌患者的總生存率無相關(guān)性；C和D分別為 VAMP3和ADAM10基因，兩基因與胰腺癌患者總生存率有關(guān)。

3 討 論

胰腺癌的臨床表現(xiàn)隱蔽，大多數(shù)胰腺癌患者在確診時(shí)已經(jīng)處于晚期，因?yàn)榘┘?xì)胞已經(jīng)擴(kuò)散并無法通過手術(shù)切除治療，晚期胰腺癌患者5年生存率低于5%，因此胰腺癌是惡性腫瘤中病死率最高的腫瘤之一。然而胰腺癌的早期診斷仍面臨巨大的挑戰(zhàn)。在本次研究中，筆者團(tuán)隊(duì)通過NCBI的在線分析軟件GEO2R及VEEN對(duì)GSE59856的數(shù)據(jù)按照胰腺癌與健康對(duì)照組、胰腺癌與其他癌癥對(duì)照組、胰腺癌與良性疾病對(duì)照組進(jìn)行在線分析，然后再用GSE124158的數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，最后得出miR-122-5p這一明顯差異表達(dá)的miRNA，miR-122-5p在胰腺癌患者體內(nèi)表達(dá)下降。此前有研究將健康人群、慢性胰腺炎患者與胰腺癌患者相比較，發(fā)現(xiàn)miR-122-5p在胰腺癌患者體內(nèi)表達(dá)下降。這與既往的研究結(jié)果相符[11]。另外miR-122-5p可作為評(píng)估胰腺癌預(yù)后的標(biāo)志物，即miR-122-5p血漿水平升高與胰腺癌患者預(yù)后較差之間具有一定的關(guān)聯(lián)性[12]。另有研究報(bào)道m(xù)iR-122-5p通過直接靶向細(xì)胞周期蛋白1抑制了胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。因此，miR-122-5p可能是胰腺導(dǎo)管腺癌的治療靶標(biāo)。

為繼續(xù)探索miR-122-5p在調(diào)節(jié)人胰腺癌進(jìn)展過程中的作用機(jī)制，使用DIANA tools對(duì)miR-122-5p進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，得到517個(gè)靶基因。對(duì)關(guān)鍵基因的功能富集分析顯示，它們主要參與膠原蛋白分解代謝、GTP酶活性的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄的調(diào)控等過程。以往有研究和證據(jù)表明，本文篩選出的靶基因的GO、KEGG富集通路在胰腺癌的進(jìn)展過程中可能具有重要的功能。再運(yùn)用結(jié)合 DAVID、STRING等生物信息數(shù)據(jù)庫以及查詢文獻(xiàn)進(jìn)行篩選，最后得到UBA52、ADAM10、CBL、VAMP3這4個(gè)關(guān)鍵基因。這些關(guān)鍵基因在癌組織中的表達(dá)水平與正常胰腺組織相比顯著上調(diào)或下降。

對(duì)篩選到的這4個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行TCGA驗(yàn)證分析，胰腺癌患者體內(nèi)UBA52、ADAM10、CBL、VAMP3的表達(dá)均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于健康人。再驗(yàn)證4個(gè)基因的預(yù)后價(jià)值，與高表達(dá)VAMP3、ADAM10的胰腺癌患者相比，這2個(gè)基因低表達(dá)的患者總體生存率更高(P<0.05)。而UBA52、CBL上調(diào)對(duì)胰腺癌患者生存無明顯影響(P>0.05)。有研究表明，VAMP3在胰腺癌細(xì)胞的外泌體分泌中發(fā)揮積極作用，其中VAMP3對(duì)于PVT1介導(dǎo)的外泌體分泌至關(guān)重要[14]。而胰腺癌組織中ADAM10表達(dá)比正常組織中更高。ADAM10沉默會(huì)顯著降低癌細(xì)胞的遷徙與轉(zhuǎn)移能力，但對(duì)正常細(xì)胞卻沒有影響[15]。然而目前這些關(guān)鍵基因在胰腺癌患者中的具體作用機(jī)制還不清楚，還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究是基于生物信息學(xué)方法對(duì)胰腺癌患者血漿差異miRNA進(jìn)行分析，由此篩選出miR-122-5p，并發(fā)現(xiàn)其具有作為胰腺癌診斷標(biāo)志物的潛力。通過數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證，miR-122-5p作用的關(guān)鍵靶基因VAMP3、ADAM10在胰腺癌組織中差異表達(dá)，可能與胰腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移相關(guān)。但上述miRNA及其靶基因與胰腺癌的相關(guān)性還需要進(jìn)一步的大量臨床樣本和隨訪數(shù)據(jù)驗(yàn)證。