李陽(yáng) 蘆迪

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的，是主要通過(guò)呼吸道傳播的慢性傳染性疾病，已受到全球各國(guó)的關(guān)注，也是我國(guó)重點(diǎn)控制的疾病之一[1]。在全球30 個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家中，我國(guó)排名第二，如何進(jìn)一步提高結(jié)核病的診治水平已成為臨床醫(yī)生重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題之一[2]。結(jié)核病防治的原則為早發(fā)現(xiàn)、早治療，但不少肺結(jié)核患者因排菌少，導(dǎo)致痰檢陰性，影響臨床診斷[3]。報(bào)道指出，miR-29 可調(diào)節(jié)T 細(xì)胞分化，在病原體感染和機(jī)體抗感染免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用[4]。而miR-29 與結(jié)核病的發(fā)病及病情進(jìn)展密切相關(guān)，IFN-γ 是其靶基因[5]。因此，本研究通過(guò)探討miR-29 及靶基因IFN-γ 在痰菌陰性肺結(jié)核的表達(dá)水平，分析其對(duì)痰菌陰性肺結(jié)核的診斷價(jià)值，為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2018年3月～2019年3月我院收治的痰菌陰性肺結(jié)核患者200 例（痰菌陰性組），痰菌陽(yáng)性肺結(jié)核患者200 例（痰菌陽(yáng)性組），另選取健康體檢人員200 例作為對(duì)照組。痰菌陰性肺結(jié)核患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①均按結(jié)核分枝桿菌痰涂片陽(yáng)性或培養(yǎng)陽(yáng)性確診；②符合菌陰活動(dòng)性肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；③患者病情穩(wěn)定；④無(wú)意識(shí)障礙。痰菌陽(yáng)性肺結(jié)核患者納入標(biāo)準(zhǔn)：痰標(biāo)本涂片鏡檢結(jié)果均顯示抗酸桿菌陽(yáng)性，其余與痰菌陰性肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)相同。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往結(jié)核病患者；精神疾病患者；研究中途退出者；妊娠期女性。痰菌陰性組，男124例，女76 例，年齡18～69 歲，平均（42.63±7.57）歲；痰菌陽(yáng)性組，男119 例，女81 例，年齡20～70 歲，平均（41.98±7.86）歲；對(duì)照組，男131 例，女69 例，年齡19～71 歲，平均（43.63±8.12）歲。三組一般資料對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 研究方法取患者早晨空腹靜脈血10ml，進(jìn)行EDTA 抗凝，并加入淋巴細(xì)胞分離液5ml，400g 離心30min，然后吸取中層單核細(xì)胞，以磷酸鹽緩沖溶液重懸。以磁性活化細(xì)胞分選法對(duì)CD4+細(xì)胞進(jìn)行篩選，TRIzol 裂解細(xì)胞。以酚氯仿對(duì)總RNA進(jìn)行抽提，然后以分光光度計(jì)對(duì)其RNA 質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，并以瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。反轉(zhuǎn)錄為cDNA。miR-29:①逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，16℃ 30min，42℃40min，85℃ 5min；②熒光定量PCR，95℃預(yù)變性10min，95℃變性10s，60℃退火60s，40 個(gè)循環(huán)。靶基因IFN-γ：①逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，30℃ 10min，42℃30min；②熒光定量PCR，90℃預(yù)變性1min，55℃變性1min，72℃退火1min，30 個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10min。最后以U6RNA 作為內(nèi)參基因，利用2-ΔΔCt法計(jì)算各樣本中miR-29a、miR-29b、miR-29c、靶基因IFN-γ mRNA 的表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 miR-29a、miR-29b 、miR-29c 及靶基因IFN-γ的引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 24.0 對(duì)本研究中的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料用±s表示，采用t檢驗(yàn)或方差分析，P<0.05 時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組miR-29a、miR-29b、miR-29c、IFN-γmRNA水平比較痰菌陽(yáng)性組和痰菌陰性組的miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。痰菌陰性組和痰菌陽(yáng)性組的miR-29a、IFN-γmRNA 水平均較對(duì)照組低，miR-29b、miR-29c 水平均較對(duì)照組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 三組miR-29a、miR-29b、miR-29c、IFN-γmRNA 的水平比較（±s）

表2 三組miR-29a、miR-29b、miR-29c、IFN-γmRNA 的水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

組別 miR-29a miR-29b miR-29c IFN-γmRNA對(duì)照組（n=200） 0.86±0.23 0.93±0.25 0.83±0.21 1.00±0.02痰菌陽(yáng)性組（n=200） 0.51±0.12* 2.61±0.87* 2.68±0.92* 0.16±0.07*痰菌陰性組（n=200） 0.49±0.10* 2.52±0.81* 2.59±0.88* 0.16±0.05*

2.2 miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA對(duì)痰菌陰性肺結(jié)核診斷價(jià)值的比較ROC 曲線分析結(jié)果顯示，miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 診斷痰菌陰性肺結(jié)核的AUC 分別為0.872、0.859、0.864、0.896，靈敏度分別為84.0%、81.5%、83.0%、89.5%，特異度分別為93.0%、90.5%、92.0%、91.5%。見(jiàn)表3和圖1。

表3 miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 對(duì)痰菌陰性肺結(jié)核診斷價(jià)值的比較

圖1 miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 對(duì)痰菌陰性肺結(jié)核診斷價(jià)值的ROC 曲線

3 討論

近年來(lái)的流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，我國(guó)結(jié)核病發(fā)病率總體呈逐年下降趨勢(shì),但下降趨勢(shì)緩慢[7，8]。而大多數(shù)結(jié)核潛伏感染人群早期并無(wú)活動(dòng)性結(jié)核的明顯臨床癥狀，存在進(jìn)展為活動(dòng)性結(jié)核的可能[9]。目前，結(jié)核病的常用診斷手段為影像學(xué)檢查及病原學(xué)檢查，但均存在一定的假陰性結(jié)果，這不利于結(jié)核病的防治[10，11]。因此，探討新的診斷方法對(duì)提高結(jié)核病的診斷水平具有重要意義。因此，本研究通過(guò)探討miR-29 及靶基因IFN-γ 在痰菌陰性肺結(jié)核的表達(dá)水平，為痰菌陰性肺結(jié)核的診斷提供參考依據(jù)。

miRNA 是一種單鏈小分子RNA，miR-29a、miR-29b 和miR-29c 均是其家族成員[12]。報(bào)道顯示miR-29 家族在機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用，其靶基因相關(guān)蛋白通過(guò)抑制多個(gè)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)而發(fā)揮調(diào)控作用[13]。且miR-29 是T 細(xì)胞因子或淋巴樣增強(qiáng)因子的負(fù)調(diào)控分子，通過(guò)降解靶基因IFN-γ 的表達(dá)能有效降低機(jī)體對(duì)胞內(nèi)病原體的免疫應(yīng)答水平[14]。

而在本研究中，痰菌陽(yáng)性組和痰菌陰性組的miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但痰菌陰性組和痰菌陽(yáng)性組的miR-29a、IFN-γmRNA 水平均較對(duì)照組低，miR-29b、miR-29c 水平均較對(duì)照組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。一方面，由于IFN-γ 與抗結(jié)核感染免疫反應(yīng)存在密切聯(lián)系，而無(wú)論是痰菌陽(yáng)性和痰菌陰性的活動(dòng)性肺結(jié)核患者，體內(nèi)結(jié)核菌均呈活動(dòng)狀態(tài)，所以其外周血特異抗原的效應(yīng)T 細(xì)胞數(shù)量及免疫應(yīng)答水平均可能類(lèi)似[15，16]。而本研究結(jié)果中痰菌陽(yáng)性和痰菌陰性肺結(jié)核患者IFN-γmRNA 水平差異并不明顯，也驗(yàn)證了這一結(jié)論。另一方面也說(shuō)明痰菌陽(yáng)性和痰菌陰性肺結(jié)核患者與健康人群的miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 水平均存在明顯差異，miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 與肺結(jié)核的發(fā)生及發(fā)展可能存在密切的聯(lián)系[17]。經(jīng)ROC 曲線分析結(jié)果顯示，miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 診斷痰菌陰性肺結(jié)核的AUC 分別為0.872、0.859、0.864、0.896，這提示miR-29a、miR-29b、miR-29c 和IFN-γmRNA 在痰菌陰性肺結(jié)核的診斷中均有重要的價(jià)值，也為結(jié)核病的診斷提供了重要的靶標(biāo)和參考依據(jù)。

綜上，miR-29 及靶基因IFN-γ 與結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展均存在密切聯(lián)系，測(cè)定miR-29a、miR-29b、miR-29c 及靶基因IFN-γmRNA 的表達(dá)水平對(duì)痰菌陰性肺結(jié)核的診斷具有重要價(jià)值。