張海超，賈海濤，張婧雯，王 敬，艾連峰*，霍惠玲，李研東

（1.石家莊海關(guān)技術(shù)中心，河北 石家莊 050011；2.河北省獸藥監(jiān)察所，河北 石家莊 050050）

硝基咪唑類藥物是一類廣泛應(yīng)用的人工合成藥物，具有5-硝基咪唑基本結(jié)構(gòu)，對(duì)原蟲以及各種厭氧細(xì)菌具有顯著的抑制作用，能促進(jìn)牛、豬、禽的生長(zhǎng)及改善飼料轉(zhuǎn)化率。用于獸藥的硝基咪唑類藥物主要包括地美硝唑、異丙硝唑、甲硝唑、塞克硝唑、羅硝唑、奧硝唑、卡硝唑和替硝唑等[1]。但是，由于硝基咪唑類藥物具有細(xì)胞誘變性，有潛在的動(dòng)物致畸、致癌性和致突變作用，其殘留對(duì)動(dòng)物源性食品安全構(gòu)成直接威脅。因此，我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號(hào)中將羅硝唑和替硝唑列為食品動(dòng)物禁止使用的藥品[2]。目前，關(guān)于獸藥中非法添加硝基咪唑類藥物的標(biāo)準(zhǔn)有《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第289號(hào)獸藥中非法添加硝基咪唑類藥物檢查方法》，采用液相色譜法測(cè)定羅硝唑、甲硝唑、替硝唑、地美硝唑、奧硝唑和異丙硝唑含量，檢測(cè)限為1 mg/g[3]，但此方法存在靈敏度低、抗干擾能力差等缺點(diǎn)。馬東杰等[4]采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定中獸藥制劑中甲硝唑、地美硝唑、異丙硝唑和羅硝唑的含量，檢出限為10 μg/kg，雖然靈敏度高，但測(cè)定化合物數(shù)量有限，故該方法仍存在一定局限性。其他關(guān)于硝基咪唑藥物檢測(cè)文獻(xiàn)中的測(cè)定方法多為飼料[5-7]和動(dòng)物源性食品[8-10]基質(zhì)，關(guān)于適用獸藥制劑基質(zhì)的測(cè)定方法較少。因此，建立一種可靠的測(cè)定獸藥制劑中非法添加硝基咪唑類藥物方法對(duì)獸藥行業(yè)發(fā)展具有重要意義。文章選取4種獸藥制劑為代表性基質(zhì)樣品，對(duì)提取溶劑、凈化方式及色譜條件進(jìn)行研究，采用SCX柱凈化，建立獸藥制劑中硝基咪唑類藥物的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法。該方法操作簡(jiǎn)單、凈化效果好，可為測(cè)定獸藥制劑中非法添加硝基咪唑類藥物提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

8050 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（SHIMADZU 公司）、KQ-500E 超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）、Sigma 3K-15 型離心機(jī)（Sigma 公司）、PT2100 型均質(zhì)器（KINEMATICA 公司）、渦旋混合器（Scientific Industries）、Milli-Q純水系統(tǒng)（Millipore公司）。

色譜純乙腈、甲醇、丙酮、氨水，購(gòu)自飛世爾試劑公司；分析純氯化鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)所用純水均由美國(guó)Milli-Q純水系統(tǒng)制得。

標(biāo)準(zhǔn)品：地美硝唑、異丙硝唑、甲硝唑、塞克硝唑、羅硝唑、奧硝唑、卡硝唑、替硝唑，純度大于97%?；旌闲完?yáng)離子（SCX）固相萃取柱（150 mg/6 mL，Agela公司）。

1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取8種硝基咪唑類藥物標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg（折合純度后）于10 mL 棕色容量瓶中，使用甲醇溶解，定容，得到濃度為1 g/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液，于4 ℃下避光保存。準(zhǔn)確移取適量硝基咪唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使用甲醇稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，待用。

1.3 樣品前處理

固體樣品：稱取2 g樣品（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入20 mL乙腈溶液，混勻，均質(zhì)器10 000 r/min均質(zhì)1 min。

液體樣品：稱取2 g樣品（精確至0.01 g）于50 mL塑料離心管中，加入20 mL 乙腈溶液和4 g 氯化鈉，混勻，均質(zhì)器10 000 r/min均質(zhì)1 min。將各樣品提取液以4 000 r/min離心5 min，取上清液待凈化。

SCX固相萃取柱依次用甲醇、乙腈各取5 mL活化，將5 mL 上清液過柱，依次用5 mL 丙酮、5 mL 甲醇淋洗，壓干。使用6 mL 5%氨水甲醇洗脫，40 ℃下氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入50%甲醇溶液溶解殘?jiān)旌暇鶆颍^0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定。

1.4 分析條件

色譜柱為Waters BEH C18柱（100 mm× 2.1 mm，1.7 μm）；柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量1 μL；流動(dòng)相：A 為0.1%甲酸水，B 為乙腈；流速為0.3 mL/min。梯度洗脫程序：0～0.5 min，5% B；0.5～4.0 min，5%～90% B；4.0～6.0 min，90%B；6.0～6.1 min，90%～5%B；6.1～8.0 min，5%B。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源ESI，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）正離子掃描模式。離子源溫度為300 ℃，毛細(xì)管溫度為250 ℃，加熱模塊溫度為400 ℃，氮?dú)饬魉?.0 L/min，干燥氣流速10.0 L/min，加熱氣流速10.0 L/min，其他參數(shù)見表1。

表1 8種硝基咪唑類藥物的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters of eight nitroimidazole

2 結(jié)果與分析

2.1 獸藥制劑種類的選擇

魚腥草注射液主要成分為魚腥草，主要作用為清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋。硫酸新霉素可溶性粉主要用于治療禽敏感革蘭氏陰性菌所致的胃腸道感染。荊防解毒散主要成分為荊芥、防風(fēng)、羌活、獨(dú)活、柴胡等，主要功能是辛溫解表，疏風(fēng)祛濕。白頭翁口服液主要成分是白頭翁、黃連、秦皮、黃檗，主要功能是清熱解毒、涼血止痢。硝基咪唑類藥物因其類似功能極有可能加入上述獸藥中。因此，本試驗(yàn)選用上述4種獸藥分別作為針劑、粉劑和酊劑的代表性樣品。

2.2 提取條件的選擇

常用于硝基咪唑類藥物分析的提取溶劑主要有乙酸乙酯、乙腈、甲醇等。本研究先后試驗(yàn)了乙腈、乙酸乙酯、甲醇和二氯甲烷，結(jié)果表明，4種提取劑對(duì)硝基咪唑類藥物均有很好的提取效率。但考慮到二氯甲烷比重大，提取離心后上清液中仍會(huì)有樣品殘?jiān)鼞腋。D(zhuǎn)移較為費(fèi)力且毒性較大；甲醇沉淀蛋白不完全離心靜置后仍有白色絮狀物產(chǎn)生，不利于之后的凈化環(huán)節(jié)；乙酸乙酯脂溶性較強(qiáng)，提取脂溶性雜質(zhì)較多，不利于濃縮。結(jié)合試驗(yàn)操作簡(jiǎn)便性與樣品基質(zhì)類型，最終選擇乙腈作為提取劑。

本試驗(yàn)通過對(duì)陰性樣品添加分析物，比較了一次性加入20 mL 乙腈均質(zhì)提取與分兩次每次各10 mL 加入乙腈均質(zhì)提取之間的提取效率差異，結(jié)果表明，兩種方式的回收率基本持平。樣品再次加入20 mL 乙腈，回收率不變。因此，在保證結(jié)果準(zhǔn)確的前提下，為提高檢測(cè)效率，標(biāo)準(zhǔn)選擇一次性加入20 mL 乙腈即可提取完全?？紤]到水和提取溶劑間極性的差異，粉劑樣品中含水量的不同很可能影響硝基咪唑類藥物的提取效率。以荊防解毒散樣品為例，向樣品中加適量蒸餾水浸泡，采用20 mL 乙腈進(jìn)行提取。結(jié)果表明，樣品中含水量上升會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)提取較多，引起硝基咪唑類藥物提取效果的降低。因此，試驗(yàn)對(duì)于粉劑樣品采用乙腈直接提取，針劑和酊劑樣品含有一定水分，采用均質(zhì)提取前需要加入5 g 氯化鈉和乙腈進(jìn)行鹽析提取。

2.3 凈化方式的選擇（見圖1、圖2）

由于很多獸藥中含有中藥成分，在生產(chǎn)過程中需經(jīng)過煎煮、蒸餾、添加輔料等制作工藝，基質(zhì)較為復(fù)雜，所以選擇固相萃取柱進(jìn)行凈化。在500 μg/kg 添加水平時(shí)，采用不同類型的固相萃取柱，包括C18柱（反相萃取柱）、氧化鋁柱（正相萃取柱）和SCX 柱（硅膠基質(zhì)強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱）。以荊防解毒散為例，各化合物的凈化效果見圖1。

由圖1 可知，用C18柱凈化效果較差，基質(zhì)影響比較嚴(yán)重；用硅膠柱和氧化鋁柱處理，8種藥物的絕對(duì)回收率均小于60%；用SCX 柱不僅可以消除干擾，同時(shí)8 種硝基咪唑類藥物回收率均在70%～90%以上。強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱上的磺酸基能有效地吸附質(zhì)子化的硝基咪唑類藥物，即使是極性強(qiáng)的有機(jī)溶劑亦不能洗脫。用丙酮、甲醇可以淋洗掉大部分干擾成分，然后用5%氨水-甲醇置換洗脫目標(biāo)分析物。本試驗(yàn)選用6 mL 500 mg 的SCX 強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱，5 mL丙酮和5 mL甲醇淋洗雜質(zhì)，最后用氨水-甲醇（5+95）洗脫并收集。

圖1 8種硝基咪唑類藥物凈化效果比較Fig.1 Comparison of purification effects of eight nitroimidazoles

由圖2 可知，為達(dá)到更好的凈化效果和更高的洗脫比例，試驗(yàn)對(duì)洗脫體積采用分段收集的方式進(jìn)行考察，當(dāng)洗脫體積為5 mL時(shí)凈化柱的洗脫比例均小于5%，第6 mL時(shí)已無任何目標(biāo)物流出。同時(shí)，硝基咪唑類藥物熱穩(wěn)定性差，氮吹步驟應(yīng)注意不能將其完全吹干，若完全吹干就會(huì)降低方法的回收率，尤其是卡硝唑吹干后會(huì)損失80%。

圖2 8種硝基咪唑類藥物的梯度洗脫曲線（n=3）Fig.2 Gradient elution curves of eight nitroimidazoles(n=3)

2.4 儀器條件的優(yōu)化（見圖3）

采用不接分析柱的方式向質(zhì)譜系統(tǒng)注入1 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣量為1 μL。確定各化合物的最佳質(zhì)譜分析條件，包括離子源溫度、毛細(xì)管溫度、加熱模塊溫度、加熱氣流速、干燥氣流速、氮?dú)饬魉?、選擇特征離子對(duì)、Q1 和Q3電壓、碰撞能量等。各化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液和HPLC的流動(dòng)相溶液混合進(jìn)入ESI 電離源，在正負(fù)離子同時(shí)掃描方式下進(jìn)行一級(jí)全掃描質(zhì)譜分析，其分子離子峰[M+H]+峰響應(yīng)值最高。在正離子模式下對(duì)[M+H]+峰進(jìn)行子離子掃描得到主要的子離子，并選擇響應(yīng)值高的子離子進(jìn)行碰撞能量的優(yōu)化，最終確定多反應(yīng)監(jiān)測(cè)的離子對(duì)及碰撞能量，8種硝基咪唑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖見圖3。

圖3 8種硝基咪唑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖Fig.3 Quantiativeion chromatogramsof eightmixedstandardsolution of nitroimidazole

2.5 基質(zhì)效應(yīng)（見圖4）

圖4 8種硝基咪唑基質(zhì)效應(yīng)Fig.4 Matrix effects of eight nitroimidazoles

基質(zhì)效應(yīng)（ME）是指色譜分離時(shí)共洗脫的物質(zhì)無法更改待測(cè)成分的離子化效應(yīng)，所引起的信號(hào)的抑制或提高?；|(zhì)效應(yīng)影響大時(shí)會(huì)降低方法的靈敏度，影響方法的準(zhǔn)確性，給測(cè)定帶來誤差。因此，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法開發(fā)和確證過程中需要對(duì)ME（ME=（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）×100%）做出評(píng)價(jià)。一般認(rèn)為，基質(zhì)效應(yīng)在85%～115%之間不明顯?？紤]到獸藥基質(zhì)復(fù)雜，容易對(duì)目標(biāo)物產(chǎn)生干擾，文章通過配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和基質(zhì)匹配校正曲線，以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作圖，以基質(zhì)匹配校正曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值來考察化合物的基質(zhì)效應(yīng)。由圖4可知，經(jīng)此方法凈化所得的樣液不存在明顯的基質(zhì)效應(yīng)。因此，本方法可采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

2.6 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.6.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限（見表2）。

表2 8種硝基咪唑類藥物的線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)Tab.2 Linear equations,correlation coefficients of eight nitroimidazole

上述方法所確定的試驗(yàn)條件下，分別配制濃度為10、20、50、100、200、500 μg/L 6 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行測(cè)定，以定量離子的響應(yīng)峰面積（y軸）對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度（x軸，μg/L）作圖。由表2 可知，8 種硝基咪唑在10～500 μg/L 范圍內(nèi)時(shí)，定量離子的響應(yīng)峰面積和樣品濃度之間有良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)均大于0.999。參考GB/T 27417—2017《合格評(píng)定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》中目視評(píng)價(jià)法評(píng)估LOD，從可信性考慮確定LOQ的方法，試驗(yàn)以空白添加法，并根據(jù)前處理過程提取凈化的稀釋倍數(shù)以及進(jìn)行測(cè)定時(shí)所受的干擾情況，確定方法的檢出限為0.02 mg/kg，定量限為0.05 mg/kg。

2.6.2 回收率和精密度（見表3）

表3 8種硝基咪唑類藥物的平均加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Tab.3 Average spiked recoveries(A.R.)and relative standard deviations(RSDs)of eight nitroimidazole(n=6)

選取不含8 種硝基咪唑的4 種代表性基質(zhì)樣品，即魚腥草注射液、硫酸新霉素可溶性粉、荊防解毒散和白頭翁口服液為空白樣品基質(zhì)，在1、2、10倍定量限的添加水平上進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)做6次，測(cè)得本試驗(yàn)方法的回收率范圍為84.1%～101.6%，精密度范圍為2.74%～11.60%。

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

為評(píng)價(jià)該方法的有效性，隨機(jī)對(duì)送檢的止瘧散、清瘟敗毒散等20份獸藥制劑樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果有1份樣品清瘟敗毒散檢出甲硝唑，樣液經(jīng)稀釋進(jìn)樣，含量最終確定為220 mg/kg。

3 結(jié)論

試驗(yàn)應(yīng)用SCX 固相萃取凈化技術(shù)，以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法建立了獸藥制劑中8種硝基咪唑類藥物的檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高，可為打擊獸藥制劑中非法添加硝基咪唑類藥物的制假行為提供有力的技術(shù)支持。