劉曉迪， 張寒思， 宋新峰

（1. 德州學(xué)院 醫(yī)藥與護(hù)理學(xué)院，山東 德州 253023；2. 華東師范大學(xué) 研究生院，上海 200062）

四氧化三鐵（Fe3O4）納米顆粒具有優(yōu)良的磁學(xué)性能、量子隧道效應(yīng)、比表面積高、粒徑小、分布均勻、易于滲透和易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬等的特性，能明顯增強(qiáng)的T2造影效應(yīng)；并且，在外加磁場(chǎng)作用下Fe3O4將電磁能轉(zhuǎn)化為熱能，隨磁場(chǎng)變化產(chǎn)生熱效應(yīng)，被用于疾病的熱療。因此，F(xiàn)e3O4已被廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[1]。但是，由于Fe3O4納米顆粒粒徑小、比表面能大，裸露的納米粒子有強(qiáng)烈的聚集傾向，導(dǎo)致粒徑尺寸大、分布寬，影響了在溶液中的分散性和生物相容性，無法滿足生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)[2]。

通常通過對(duì)超順磁性納米粒子進(jìn)行表面修飾，降低表面能，增強(qiáng)粒子抗氧化能力，提高粒子的分散性、溶解性和生物相容性。已有不少Fe3O4納米顆粒的成功修飾方法，如徐光輝等[3]通過超聲處理－化學(xué)鍍法，利用正硅酸乙酯、AgNO3修飾制備Fe3O4@SiO2-Ag核殼納米粒子。因貽貝類動(dòng)物的粘附性蛋白超強(qiáng)粘附性能，美國西北大學(xué)的Messersmith等[4]提出一種利用多巴胺（DOPA）氧化聚合以及聚多巴胺沉積的新型仿生修飾方法，對(duì)聚四氟乙烯或聚乙烯等材料的表面改性。

受此啟發(fā)，本文用一種溫和、簡易、環(huán)保的DOPA仿生修飾Fe3O4方法。

葉酸（FA）是人體必須的維生素，具有分子小、無毒且免疫原性低，滲透快等優(yōu)點(diǎn)，能特異性地結(jié)合于腫瘤細(xì)胞表面過度表達(dá)的葉酸受體（Folate Receptor，F(xiàn)R）。FR在一些惡性腫瘤（如肝癌、卵巢、鼻咽、子宮內(nèi)膜和肺癌等）高度表達(dá)，而正常的細(xì)胞不表達(dá)，使FR在腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)和靶向治療方面發(fā)揮優(yōu)勢(shì)[5]。因此，本文將葉酸與磁性納米粒子結(jié)合可以增加納米材料在腫瘤部位的富集性，并且誘導(dǎo)腫瘤組織內(nèi)的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的內(nèi)吞作用，因此不僅作為靶向造影劑，還可進(jìn)行靶向治療。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O （天津市耀華化工廠），多巴胺亞酸鹽（北京百靈威科技有限公司），葉酸 （上海麥克林生化有限公司），RAW 264.7細(xì)胞（中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心）。

馬爾文粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司），熱重-差示量熱掃描儀（美國梅特勒-托利多公司），振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)（南京南大儀器有限公司），傅立葉變換-紅外光譜儀（美國賽默飛公司），掃描電鏡（德國卡爾蔡司公司），SDD能譜儀（牛津儀器（上海）有限公司）。

1.2 SPIONs@PDA-FA制備

參考崔生等[6]采用共沉淀法制備Fe3O4磁性納米顆粒。

按照Fe2+/2Fe3+＝1∶2摩爾比，精確稱量FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O超聲溶解分散于去離子水中。將上述溶液轉(zhuǎn)入三口瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)，常溫（25℃）條件下，機(jī)械攪拌10 min（800 r/min），混勻。緩慢滴加濃度25% 氨水，使反應(yīng)液pH值在9.85，氮?dú)獗Ｗo(hù)，常溫（25℃）條件下，機(jī)械攪拌10 min（800 r/min）。

在上述反應(yīng)結(jié)束，參考Lee H等[4]向反應(yīng)液中滴加3.6%的鹽酸溶液，調(diào)pH值至8.5，隨后氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入現(xiàn)配的多巴胺鹽酸鹽溶液；在25℃、有氧條件下，機(jī)械攪拌30 min（500 r/min）；反應(yīng)完畢后，利用外加磁場(chǎng)分離、去離子水洗滌3遍，制得SPIONs@PDA。

稱取已經(jīng)制備好的SPIONs-PDA 0.3 g溶解到50 mL的無水吡啶，再加入0.5 g NHS-folate，在室溫、避光條件下，機(jī)械攪拌24 h（200 r/min）；反應(yīng)結(jié)束后，利用外加磁場(chǎng)分離產(chǎn)物，依次用乙醇-正己烷混合液、無水乙醇、去離子水洗滌3 次，然后將產(chǎn)物部分用真空干燥，制得SPIONs@PDA-FA顆粒。

1.3 三種磁性納米粒子的表征及評(píng)價(jià)

對(duì)制備的SPIONs、SPIONs@PDA、SPIONs@PDA-FA三種納米粒子按照測(cè)試要求進(jìn)行處理，分別用掃描電鏡、馬爾文粒度儀、振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)、差示-熱重分析儀以及傅里葉紅外光譜等對(duì)其形貌、粒徑大小及分布磁學(xué)性能、化學(xué)組成等進(jìn)行了表征，并考察了對(duì)體外巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞效應(yīng)的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 三種磁性納米粒子的形貌分析

SPIONs、SPIONs@PDA、SPIONs@PDA-FA三種磁性納米粒子的掃描電鏡結(jié)果如圖 1所示，SPIONs納米粒子形態(tài)規(guī)則成球形結(jié)構(gòu)，大小分布均勻，粒徑在 20～30 nm之間（圖1 A）；而SPIONs@PDA和SPIONs@PDA-FA兩種納米粒子的粒徑較SPIONs裸粒子有所增加，粒子粒徑約為30～40 nm（圖1 B、圖1 C），推斷是由于DOPA包覆在SPIONs納米粒子表面所致；因?yàn)?FA為小分子，在SPIONs@PDA納米粒子表面鍵合的量有限，所以，其粒徑無沒明顯變化。

圖1 SPIONs（A）、SPIONs@PDA（B）、SPIONs@PDA-FA（C）納米粒子的電鏡圖

2.2 三種磁性納米粒子的粒徑分析

SPIONs、SPIONs@PDA、SPIONs@PDA-FA三種磁性納米粒子的粒徑如圖2所示，均呈單峰分布，分布范圍較窄，其平均粒徑依次為315.1 nm、384.7 nm、398.4 nm，表明三種磁性納米粒子大小均一。另外，SPIONs、SPIONs@PDA、SPIONs@PDA-FA納米粒子的馬爾文粒徑測(cè)量結(jié)果均比掃描電鏡大，分析主要原因可能是Fe3O4在水中發(fā)生了團(tuán)聚，導(dǎo)致SPIONs偏大；而Fe3O4表面被的DOPA、FA修飾后，增強(qiáng)了水合效應(yīng)，從而使SPIONs@PDA、SPIONs@PDA-FA納米粒子的粒徑增大。

圖2 SPIONs（A）、SPIONs@PDA（B）、SPIONs@PDA-FA（C）納米粒子的粒徑分布圖

2.3 三種磁性納米粒子的成分分析

大面積SDD能譜儀檢測(cè)結(jié)果，如圖3 A所示，SPIONs納米粒子中含有Fe、O兩種元素，提示Fe3O4。仿生修飾DOPA后，SPIONs@PDA納米粒子中又出現(xiàn)了C、N兩種元素，表明DOPA成功包覆在SPIONs納米粒子表面。鍵合FA后的SPIONs@PDA-FA納米粒子也出現(xiàn)了C、N兩種元素，且這兩種元素的含量增加，表明FA鍵合在SPIONs@PDA納米粒子表面。

圖3 SPIONs（A）、SPIONs@PDA（B）、SPIONs@PDA-FA（C）納米粒子的大面積SDD能譜元素測(cè)定圖

2.4 三種磁性納米粒子的結(jié)構(gòu)分析

由圖4 A可見，在578 cm-1處的吸收峰對(duì)應(yīng)于 SPIONs中 Fe-O 鍵的振動(dòng)；圖4 B表明，芳香環(huán)官能團(tuán) C=C 伸縮振動(dòng)的吸收峰出現(xiàn)在1457 cm-1和1760 cm-1處，而3253 cm-1處的吸收峰對(duì)應(yīng)芳香環(huán)的 O-H伸縮振動(dòng)，表明聚多巴胺已在SPIONs表面生成；如圖4 C所示，SPIONs@PDA-FA出現(xiàn)了特征性的苯環(huán)峰值3050 cm-1，葉酸中的亞甲基（-CH2）的特征吸收峰出現(xiàn)在2929 cm-1處，于1644 cm-1和1490 cm-1處 出現(xiàn)由葉酸的蝶啶環(huán)和苯甲酰基伸縮震動(dòng)產(chǎn)生的葉酸特征峰，這表明FA已成功鍵合到SPIONs表面，與潘廣伯等[11]的研究結(jié)果一致。

圖4 SPIONs（A）、SPIONs@PDA（B）、SPIONs@PDA-FA（C）納米粒子的紅外分析譜圖

2.5 三種磁性納米粒子的組份測(cè)定結(jié)果

由圖5中曲線A可知，從25℃升至150℃，純 SPIONs納米粒子的失重率約為5.03%，是 SPIONs納米粒子表面吸附的水揮發(fā)所致，隨著溫度的升高，SPIONs納米粒子發(fā)生相變而成為 Fe2O3。由圖5中B可知，SPIONs@PDA納米粒子的總失重率約為45.75%，除去表面吸附的水，還有包覆的DOPA。其中，在25～150℃的范圍內(nèi)主要是除去SPIONs@PDA納米粒子表面吸附水，失重率約為10.02%；當(dāng)溫度高于150℃以后，隨著溫度的升高，包覆的DOPA開始緩慢分解并被除去，同時(shí)SPIONs納米粒子發(fā)生相變而成為 Fe2O3。從這些數(shù)據(jù)看，DOPA修飾SPIONs的納米粒子的含量約為35.73%。圖5中C表明，SPIONs@PDA-FA納米粒子的總失重率達(dá)到57.80%，其中從25℃升至150℃，主要是SPIONs@PDA-FA納米粒子表面吸附的水，失重率約為11.53%；當(dāng)溫度高于150℃以后，隨著溫度的升高，包覆的DOPA、FA開始緩慢分解并被除去，同時(shí)SPIONs納米粒子發(fā)生相變而成為 Fe2O3。由此，表明在SPIONs納米粒子表面包覆的DOPA和鍵合的FA總量約為46.27%。再結(jié)合SPIONs@PDA納米粒子的總失重情況，可以推斷FA已經(jīng)成功鍵合到DOPA包覆的SPIONs納米粒子表面。

圖5 SPIONs（A）、SPIONs@PDA（B）、SPIONs@PDA-FA（C）納米粒子的熱重分析圖

2.6 三種磁性納米粒子的磁飽和強(qiáng)度測(cè)定結(jié)果

由圖6中所示A、B、C三條磁滯回線顯示，SPIONs、SPIONs@PDA、SPIONs@PDA-FA三種磁性納米粒子均幾乎沒有剩磁和頑磁，矯頑力接近0，說明本實(shí)驗(yàn)制備的納米粒子具有超順磁性。另外，A、B、C三條磁滯回線也顯示三種磁性納米粒子有較好的磁飽和強(qiáng)度，其中SPIONs磁性納米粒子的平均飽和磁矩值為52.30 emu/g，經(jīng)多巴胺修飾后，SPIONs@PDA納米粒子的飽和磁矩值降為46.60 emu/g，磁化強(qiáng)度下降，主要是多巴胺為無磁性的高分子物質(zhì)，修飾在SPIONs納米粒子表面，對(duì)其磁性造成影響，在多巴胺修飾的SPION納米粒子表面鍵合FA后，SPIONs@PDA-FA納米粒子的飽和磁矩值為39.43 emu/g，下降不明顯，仍具有較好的的磁學(xué)性能，符合MRI成像要求[12]。

圖6 SPIONs（A）、SPIONs@PDA（B）、SPIONs@PDA-FA（C）納米粒子的磁性檢測(cè)

2.7 三種磁性納米粒子的體外巨噬細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將制備好的SPIONs、SPIONs@PDA、SPIONs@PDA-FA三種納米粒子分別與小鼠巨噬細(xì)胞孵育24 h，結(jié)果如圖7所示與A空白細(xì)胞比較，小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)SPIONs、SPIONs@PDA、SPIONs@PDA-FA三種磁性納米粒子均具有吞噬效應(yīng)，而其中SPIONs@PDA-FA納米粒子的吞噬效應(yīng)略微優(yōu)于其他兩種納米粒子。另外，三種納米粒子的濃度梯度實(shí)驗(yàn)也表明隨著納米粒子濃度的增加，會(huì)提高小鼠巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞效果。

圖7 空白細(xì)胞（A），分別吞噬SPIONs（B）、SPIONs@PDA（C）、SPIONs@PDA-FA（D）納米粒子的細(xì)胞圖

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用多巴胺的氧化自聚原理，實(shí)現(xiàn)了SPIONs納米粒子的仿生修飾，并耦合FA賦予納米粒子腫瘤靶向，形成了超順磁性氧化鐵-多巴胺-葉酸（SPIONs@PDA-FA）納米復(fù)合物，建立一種溫和的SPIONs仿生修飾方法，具有一定的創(chuàng)新性。多巴胺分子中羥基、氨基等親水性官能團(tuán)，改善SPIONs的水溶性及其生物相容性，該設(shè)計(jì)思路較為新穎。

利用DOPA作為連接體，將FA分子成功地與SPIONs納米粒子偶聯(lián)，實(shí)現(xiàn)了SPIONs粒子的靶向功能化，該化合物具有腫瘤細(xì)胞的靶向介導(dǎo)功能，且毒性小，擴(kuò)大了在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用，如靶向給藥、核磁共振成像、腫瘤細(xì)胞示蹤等，具有重要的意義。功能化的SPIONs制備成功，一方面，降低SPIONs的高比表面能，改善粒子的聚沉，保持納米顆粒單分散性，獲得有良好水分散性、生物相容性，為其在生物學(xué)的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)；另一方面，提高了在腫瘤部位的富集，實(shí)現(xiàn)SPIONs造影劑腫瘤靶向性。