陳 晉，伏天雨，劉 江，周恒平，孫永霞，陳思琪，艾 麗，朱彥鋒

（成都醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，四川成都 610500）

前列腺癌是中老年男性常見腫瘤之一，中國前列腺癌的發(fā)病率也逐年增加[1-2]。前列腺癌是一類雄激素依賴性腫瘤[3]。早期發(fā)現(xiàn)雄激素剝奪治療（ADT）以降低睪酮水平能有效抑制前列腺癌的生長，但后續(xù)證實，經(jīng)過ADT后，前列腺癌會發(fā)展成為去勢抵抗前列腺癌（CRPC），且患者生存期明顯降低[4-6]。因此，CRPC的防治是現(xiàn)今前列腺癌研究的重點[3,7]?，F(xiàn)階段，臨床上有很多化療藥、激素抑制劑、腫瘤疫苗用于治療CRPC[7-9]。但這些化學合成藥物治療后均帶來副作用。因此，尋找能夠用于治療CRPC的低毒性藥物，對于CRPC的臨床治療具有重要意義。

Aldo-keto還原酶家族1成員C3（AKR1C3）是一種類固醇合成酶，是雄激素（T和DHT）合成最后兩步的關(guān)鍵酶[10-11]。前列腺癌作為一種雄激素依賴性的腫瘤，雄激素的含量變化對其生長具有較大的影響[12]，文獻表明，在CRPC組織中AKR1C3 mRNA和蛋白水平均有上調(diào)，AKR1C3 siRNA能夠抑制AKR1C3 mRNA，進 而 抑 制CRPC的 生 長[13-14]。AKR1C3的異常表達不僅能對惡性腫瘤和內(nèi)分泌疾病產(chǎn)生影響，更與CRPC的惡性程度直接相關(guān)，是前列腺癌進展成為CRPC的適應性反應[6,15-16]。近期研究發(fā)現(xiàn)，AKR1C3抑制劑在癌癥領(lǐng)域中的使用逐漸廣泛，對于抑制AKR1C3表達來降低雄激素合成的方式，可作為抗CRPC的新靶標[17-18]。

染料木黃酮（GEN）作為一種高活性的天然植物雌激素，在大豆中的含量高于其他植物。GEN具有多種分子效應，如抑制炎癥、促進細胞凋亡、調(diào)節(jié)甾體激素受體和代謝途徑[19]。有學者通過研究證實染料木黃酮不僅能影響癌細胞的增殖，也能減輕炎癥和脂肪的生成，預防肥胖和代謝綜合征[20-22]。所以GEN具有的多種分子效應在預防和治療常見的疾病中發(fā)揮著重要的作用。

近年來，GEN被證實具有抑制CRPC細胞增殖的效應[23]，但其作用機制尚未完全闡明。為探究GEN抑制AKR1C3的表達，繼而發(fā)揮抗去勢抵抗前列腺癌生長的作用機制。本研究從雄激素合成途徑出發(fā)，擬通過膳食中最常見的大豆異黃酮活性單體GEN處理CRPC細胞，利用細胞培養(yǎng)、蛋白印記及其他分子生物學技術(shù)方法，從體外探討GEN對去勢抵抗前列腺癌增殖影響及GEN降低AKR1C3蛋白的表達，研究大豆異黃酮類植物激素物質(zhì)抗去勢抵抗前列腺癌的新機制，為預防和治療去勢抵抗前列腺癌豐富理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人去勢抵抗前列腺癌22RV1細胞、人去勢抵抗前列腺癌VCaP細胞、正常前列腺上皮細胞RWPE-1細胞 中國科學院；1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基

中國上海；胎牛血清 美國Gibco；染料木黃酮干粉、AKR1C3抑制劑（ASP-9521） MCE（中國）；AKR1C3 siRNA 吉瑪基因（中國上海）；轉(zhuǎn)染試劑盒

賽默飛（美國）；CCK-8試劑盒、IP細胞裂解液碧云天（中國）；BCA蛋白定量試劑盒 Solarbio（中國上海）；PSA單抗、AKR1C3單抗（Abcam）；BACTIN單抗 中杉金橋。

電泳裝置 Bio-Rad（美國）；冷凍離心機、酶標儀、凝膠成像儀 Thermo（美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 培養(yǎng)22RV1、VCaP和RWPE-1細胞株，22RV1用無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%的活性炭-葡聚糖處理的胎牛血清）培養(yǎng)，VCaP細胞用無酚紅DMEM培養(yǎng)基（含10%的活性炭-葡聚糖處理的胎牛血清）培養(yǎng)，RWPE-1用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%的胎牛血清）培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長的22RV1、VCaP細胞，按每孔2×105個接種至6孔板底部，待密度長至80%時更換培養(yǎng)液加入無酚紅RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基1.5 mL，分別用5 μg的小干擾RNA，AKR1C3-homo-77、AKR1C3-homo-447和 AKR1C3-homo-1008與5 μL轉(zhuǎn)染試劑聯(lián)合處理，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h后在熒光顯微鏡下觀察NC孔，如有熒光且在細胞中分布均勻后，則將每孔用PBS潤洗兩次后換DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。48 h后進行細胞裂解并提取蛋白質(zhì)，進行Western blot檢測[24]。如表1所示為AKR1C3 的siRNA引物序列。

表1 AKR1C3 的siRNA引物序列Table 1 siRNA primer sequences of AKR1C3

1.2.3 CCK-8法檢測細胞生長情況 取對數(shù)生長期的22RV1、VCaP和RWPE-1細胞接種于96孔板中培養(yǎng)24 h，37 ℃、體積分數(shù)5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h，次日用無菌PBS潤洗后，加入（0、12.5、25、50、100）μmol/L的GEN工作液處理48 h，每組設5個復孔。加入工作液24、48、72 h 后，分別加入含CCK-8 的培養(yǎng)基100 μL孵育4 h。采用酶標儀測定每孔吸光度（OD），波長設為450 nm[25]，按公式進行計算：細胞活性（%）=（OD加藥-OD空白）/（OD對照-OD空白）×100。

1.2.4 小干擾RNA和AKR1C3抑制劑對AKR1C3表達量的影響 為證實GEN抗去勢抵抗前列腺癌細胞的增殖是通過抑制AKR1C3的表達實現(xiàn)的，用AKR1C3 siRNA和AKR1C3抑制劑（ASP-9521）處理細胞，觀察二者的效果。體外培養(yǎng)22RV1、VCaP細胞，按每孔2×105個接種至六孔板底部，待密度長至80%時更換培養(yǎng)液，加入無酚紅RPMI-1640、DMEM培養(yǎng)基1.5 mL，用最優(yōu)AKR1C3 siRNA 447進行試驗，使用5 μg AKR1C3 siRNA 447和GEN（50 μmol/L）單獨或聯(lián)合處理48 h。使用50 nmol/L AKR1C3抑制劑（ASP-9521）和GEN（50 μmol/L）單獨或聯(lián)合處理48 h，Western blot分析22RV1、VCaP細胞中AKR1C3的表達[26]。

1.2.5 Western blot法檢測 用5個不同濃度（0、12.5、25、50、100）μmol/L GEN處理細胞48 h后，加入200 μL的IP裂解液，放置在冰上裂解30 min，在4 ℃下12500 r/min離心10 min，得到上清液置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。制備SDS-PAGE凝膠，在80 V（濃縮膠）/120 V（分離膠）恒壓條件下分離蛋白質(zhì)，在250 mA恒流轉(zhuǎn)膜90 min。PVDF膜用20 mL封閉液放置于常溫下封閉2 h，取出PVDF膜用1×TBST清洗3次，每次5 min，裁剪所需要條帶并放入相應的一抗中，4 ℃封閉過夜。次日取出條帶，用1×TBST溶液洗膜3次，每次6 min，再用二抗，室溫孵育90 min。用1×TBST溶液洗膜3次，每次6 min，準備化學發(fā)光成像[26]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 GEN對CRPC細胞活力的抑制作用

GEN作為一種植物雌激素，能夠有效抑制去勢抵抗前列腺癌細胞的增殖、抑制轉(zhuǎn)移和誘導凋亡[26-27]。研究結(jié)果顯示，GEN（50、100 μmol/L）處理后，能夠明顯抑制22RV1、VCaP細胞增殖（圖1A）。為進一步研究GEN對CRPC細胞功能的影響，以Western blot測定PSA蛋白的表達。PSA作為前列腺癌治療的分子目標，是因為其不僅活躍在前列腺組織，在前列腺癌信號通路也會產(chǎn)生擴散、入侵、轉(zhuǎn)移、血管生成、細胞凋亡、免疫反應、腫瘤微環(huán)境監(jiān)管等影響，因此血清中PSA水平與疾病進展相關(guān)[28]。本研究結(jié)果顯示，GEN對RWPE-1細胞活力無顯著的抑制作用（P＞0.05），GEN（50、100 μmol/L）對PSA表達具有顯著抑制作用（P＜0.05）（圖1B）。

2.2 染料木黃酮對22RV1、VCaP細胞中AKR1C3表達的抑制作用

研究表明，在前列腺癌轉(zhuǎn)化為CRPC的過程中，會產(chǎn)生更多的睪酮，AKR1C3呈異常高表達，將導致更多具有活性的雄激素合成[29]，因此AKR1C3的異常表達可能是前列腺癌由激素依賴性向CRPC轉(zhuǎn)化的生物學標志。結(jié)果顯示（圖2），GEN（25、50、100 μmol/L）處理后條帶灰度減弱，因此GEN（25、50、100 μmol/L）對AKR1C3表達具有明顯抑制效果。結(jié)合圖1結(jié)果，GEN處理后，GEN 50 μmol/L時首次出現(xiàn)能夠明顯抑制22RV1、VCaP細胞增殖及PSA表達的現(xiàn)象，因此選用GEN濃度為50 μmol/L進行后續(xù)實驗。

圖1 GEN對22RV1、VCaP細胞增殖能力的影響Fig.1 Effect of GEN on the proliferation ability of 22RV1 and VCaP cells

2.3 AKR1C3 siRNA447對22RV1、VCaP細 胞 中AKR1C3表達的抑制作用

圖3 結(jié)果顯示，綜合AKR1C3siRNA抑制22RV1、VCaP細胞中AKR1C3表達的結(jié)果，可以看出AKR1C3 siRNA447的條帶灰度減弱最明顯，因此AKR1C3 siRNA447對AKR1C3的抑制效果最為明顯。故選用AKR1C3 siRNA447進行后續(xù)實驗。

圖3 AKR1C3 siRNA抑制22RV1、VCaP細胞中AKR1C3表達的結(jié)果Fig.3 Inhibitory effect of AKR1C3 siRNA on AKR1C3 expression in 22RV1 and VCaP cells

2.4 AKR1C3 siRNA 447和GEN（50 μmol/L）對22RV1、VCaP細胞中AKR1C3表達的抑制作用

如圖所示（圖4），與對照組相比，樣品組條帶灰度明顯低于對照組，且聯(lián)合使用時現(xiàn)象更為明顯。由此推斷，AKR1C3 siRNA447、AKR1C3抑制劑（ASP-9521）和GEN（50 μmol/L）對AKR1C3均有抑制作用，且AKR1C3 siRNA447和AKR1C3抑制劑（ASP-9521）分別與GEN（50 μmol/L）聯(lián)合作用時效果更強（圖5）。由此推測，GEN對AKR1C3的抑制機制與AKR1C3 siRNA、AKR1C3抑制劑（ASP-9521）抑制AKR1C3相似。類似Pippione等[18]發(fā)現(xiàn)AKR1C3抑制劑可拮抗DHEA誘導的DuCaP生長，以非選擇性的方式抑制AKR1C3的表達；以及Batra等[30]發(fā)現(xiàn)染料木素聯(lián)合多糖可抑制前列腺癌細胞內(nèi)雄激素的合成。

圖4 AKR1C3抑制劑（ASP-9521）和GEN（50 μmol/L）聯(lián)合處理對22RV1、VCaP細胞中AKR1C3的表達的影響Fig.4 Effect of combined treatment of AKR1C3 inhibitor(ASP-9521) and GEN (50 μmol/L) on the expression of AKR1C3 in 22RV1 and VCaP cells

3 結(jié)論

實驗通體外培養(yǎng)22RV1、VCaP、RWPE-1細胞，使用不同濃度的GEN處理48 h。利用CCK-8檢測22RV1、VCaP、RWPE-1細胞增殖活力。結(jié)果顯示GEN不抑制RWPE-1細胞的生長，GEN（50、100 μmol/L）能明顯抑制22RV1、VCaP的生長。后續(xù)Western blot檢測得出，GEN（50、100 μmol/L）濃度對前列腺癌標志性抗原PSA蛋白和AKR1C3的表達均有抑制作用。由于AKR1C3是雄激素合成過程中的關(guān)鍵酶，通過使用AKR1C3 siRNA、AKR1C3抑制劑（ASP-9521）分別與GEN單獨/聯(lián)合處理22RV1、VCaP細胞，推測GEN抗去勢抵抗前列腺癌的生長是通過抑制AKR1C3的表達現(xiàn)實的。在前述實驗中，GEN 50 μmol/L為首次出現(xiàn)抑制作用的濃度，所以選擇GEN 50 μmol/L處理后續(xù)實驗。Western blot檢測AKR1C3的蛋白表達量，Western blot結(jié)果顯示，GEN 50 μmol/L能夠抑制細胞中AKR1C3蛋白的表達，且與AKR1C3 siRNA、AKR1C3抑制劑（ASP-9521）聯(lián)合作用時，對AKR1C3的抑制效果更為顯著。AKR1C3的抑制可延緩CRPC的發(fā)生、發(fā)展，增加患者的生存時間，為臨床上使用植物雌激素治療去勢前列腺癌的治療提供的新思路，研究結(jié)果為通過多食用豆制品預防前列腺癌提供了理論依據(jù)。