彭舒悅，梁暖意，張延鎮(zhèn)，郭前婉，王 琪，趙 萌, ，Michael G. G?nzle,

（1.發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省食品膠體國(guó)際科技合作基地，湖北省工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北工業(yè)大學(xué)，湖北武漢 430068；2.農(nóng)業(yè)、食品與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)系，阿爾伯塔大學(xué)，加拿大埃德蒙頓 T6G 2P5）

羥基不飽和脂肪酸（Hydroxy unsaturated fatty acids, HUFA）是一類(lèi)具有羥基及不飽和鍵結(jié)構(gòu)的特殊脂肪酸，主要有馬桑酸（13-羥基-9，11-十八碳二烯酸）、蓖麻油酸（12-羥基-9-十八碳烯酸）、10-羥基-12-十八碳烯酸（10-HOE）、13-羥基-9-十八碳烯酸（13-HOE）等。特定結(jié)構(gòu)的HUFA具有真菌抑制[1-2]、細(xì)菌抑制[3]、抗炎[4-5]、抗癌[6-7]等功能特性，其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用潛力巨大，近年來(lái)，其合成方法及功能特性受到關(guān)注。

HUFA的合成途徑主要包括化學(xué)合成、植物提取、生物轉(zhuǎn)化（酶轉(zhuǎn)化或細(xì)胞轉(zhuǎn)化）三種方法。化學(xué)合成法一般缺乏特異性，會(huì)生成目標(biāo)產(chǎn)物HUFA的一系列異構(gòu)化合物，通常需要進(jìn)行較復(fù)雜的下游純化[8-9]。植物提取法可用于從植物本身油脂成分中分離HUFA，該方法較為簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高、特異性強(qiáng)，但該法受限于特定的植物來(lái)源以及HUFA的結(jié)構(gòu)種類(lèi)（如馬桑酸和蓖麻油酸）[10]；或從植物受致病菌侵染時(shí)產(chǎn)生的防御反應(yīng)物質(zhì)中提取，這些防御反應(yīng)物質(zhì)成分一般較為復(fù)雜[11]。生物轉(zhuǎn)化法產(chǎn)物較為簡(jiǎn)單、反應(yīng)特異性強(qiáng)、對(duì)環(huán)境友好，已成為HUFA制備的主流途徑。

加拿大阿爾伯塔大學(xué)G?nzle團(tuán)隊(duì)深入探索了多種HUFA的相關(guān)抑菌特性及應(yīng)用[10,12]，發(fā)現(xiàn)10-HOE及13-HOE在抑制真菌效果上表現(xiàn)優(yōu)異，作為食品中的天然防腐劑具有良好的發(fā)展?jié)撃躘1]。10-HOE、13-HOE是目前研究最多的兩種微生物源HUFA，可利用亞油酸水合酶通過(guò)生物轉(zhuǎn)化法催化亞油酸合成[13-14]。韓國(guó)建國(guó)大學(xué)Oh團(tuán)隊(duì)[14-15]所報(bào)道的高效13-HOE的酶法合成及細(xì)胞合成，可使轉(zhuǎn)化率達(dá)79%。本文首先介紹了10-HOE及13-HOE這兩種典型HUFA的發(fā)展現(xiàn)狀及功能特性，對(duì)其在食品等方面的應(yīng)用做出展望；然后概述了10-HOE及13-HOE生物轉(zhuǎn)化制備過(guò)程中起重要作用的亞油酸水合酶，總結(jié)其底物及結(jié)構(gòu)特性、在HUFA轉(zhuǎn)化中應(yīng)用的相關(guān)研究進(jìn)展等。

1 微生物源HUFA概述

HUFA廣泛存在于自然界中，典型的HUFA主要有馬桑酸、蓖麻油酸、10-羥基-12-十八碳烯酸（10-HOE）、13-羥基-9-十八碳烯酸（13-HOE）等，其生產(chǎn)方式如表1所示。馬桑酸及蓖麻油酸合成方法多樣，目前均可進(jìn)行高效制備[2,16-17]。7,10-二羥基-8-十八碳烯酸、7,10,12-三羥基-8-十八碳烯酸相關(guān)功能特性研究較少，且微生物合成步驟較為繁瑣[18]。10-HOE、13-HOE主要經(jīng)腸道乳酸菌[19]、發(fā)酵制品微生物[1]等微生物直接合成，屬于典型的微生物源HUFA。與其它HUFA相比，10-HOE及13-HOE抑真菌性良好，具有抗炎、抗過(guò)敏等功能，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用潛力大。且微生物法合成10-HOE及13-HOE具有產(chǎn)物合成效率高、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)。

表1 不同羥基不飽和脂肪酸的生產(chǎn)方式Table 1 Preparation of different hydroxyl unsaturated fatty acids

1.1 10-HOE及13-HOE的結(jié)構(gòu)及來(lái)源

1.1.1 10-羥基-12-十八碳烯酸（10-HOE） 10-羥基-12-十八碳烯酸（10-OH C18:1，10-HOE），分子式為C18H34O3，分子量為298.450，結(jié)構(gòu)如圖1所示，其結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)12-位碳碳雙鍵和一個(gè)10-位羥基[1]。10-HOE首次發(fā)現(xiàn)于1983年，Takatori等[20]用氯仿/甲醇（2:1，v/v）提取死亡人體中的總脂，在5%鹽酸甲醇溶液中甲酯化，對(duì)收集的脂肪酸甲酯進(jìn)行薄層色譜（TLC）、氣液色譜（GLC）和氣相色譜質(zhì)譜（GCMS）檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)一種未知的脂肪酸甲酯，最終通過(guò)結(jié)構(gòu)分析確定該脂肪酸為10-HOE，并指出亞油酸為10-HOE的合成底物。

圖1 10-HOE的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of 10-HOE

隨后，有研究報(bào)道Streptococcus pyogenes[21]等野生菌具有將亞油酸合成10-HOE的能力。Bergamo等[22]、Miyamoto等[23]發(fā)現(xiàn)腸道菌群也可將膳食亞油酸轉(zhuǎn)化為10-HOE，并對(duì)腸道的免疫功能及穩(wěn)態(tài)起到重要的調(diào)節(jié)作用。10-HOE不僅可由亞油酸作底物合成，與共軛亞油酸也有著密不可分的聯(lián)系。Kishino等[19]在對(duì)乳酸菌的研究中發(fā)現(xiàn)：10-HOE在積累到一定程度后轉(zhuǎn)化為10-氧-順式-12-十八烯酸、10-氧-反式-11-十八烯酸、10-羥基-反式-11-十八烯酸，最后合成共軛亞油酸，其合成途徑如圖2所示。2019年

圖2 10-HOE及共軛亞油酸的合成途徑Fig.2 Synthesis of 10-HOE and conjugated linoleic acid

Gao[24-25]進(jìn)一步研究證實(shí)了雙歧桿菌中10-HOE可通過(guò)多組分酶系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為共軛亞油酸，在亞油酸過(guò)量產(chǎn)生脅迫時(shí)，提供新的合成共軛亞油酸的途徑，同時(shí)10-HOE的含量與亞油酸水合酶的表達(dá)水平呈正相關(guān)。

1.1.2 13-羥基-9 -十八碳烯酸（13-HOE） 13-羥基-9 -十八碳烯酸（13-OH C18:1，13-HOE），分子式為C18H34O3，分子量為298.450，結(jié)構(gòu)如圖3所示，其結(jié)構(gòu)中包含一個(gè)9-位碳碳雙鍵和一個(gè)13-位羥基[1]。

圖3 13-HOE的分子結(jié)構(gòu)Fig.3 Molecular structure of 13-HOE

1998年Hudson等[26]從哺乳期奶牛的新鮮糞便中分離出兩株Enterococcus faecalis，加入亞油酸進(jìn)行培養(yǎng)后利用高效液相色譜法（HPLC）和GC/MS對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示亞油酸通過(guò)水合作用不僅可產(chǎn)生10-HOE，還首次利用細(xì)菌合成了13-HOE。該團(tuán)隊(duì)繼續(xù)尋找亞油酸水化菌，從牛糞便中分離出Streptococcus bovis和S. bovisJB1，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)菌株可水化亞油酸且只生成13-HOE，其中利用S. bovis合成13-HOE的產(chǎn)率可達(dá)28%。

2003年Kishimoto等[27]對(duì)86株乳酸菌進(jìn)行培養(yǎng)鑒定，發(fā)現(xiàn)有兩株Lactobacillus acidophilus和一株P(guān)ediococcus pentosaceus具有將亞油酸轉(zhuǎn)化合成13-HOE的能力，其中L. acidophilus13951的合成能力最強(qiáng)，并且該研究首次確定了13-HOE的立體結(jié)構(gòu)為S型。2013年Takeuchi等[28]進(jìn)一步篩選了300株乳酸菌，研究其對(duì)13-HOE的合成能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)菌株可合成13-HOE，其中Pediococcussp.AKU 1080最具潛力，可特異性將2 mg/mL亞油酸轉(zhuǎn)化合成0.4 mg/mL的13-HOE。Chen等[13]采用10-亞油酸水合酶（linoleate 10-hydratase, 10-LHT）基因（lah）缺陷突變株Lactiplantibacillus plantarumTMA1.460Δlah，將底物亞油酸轉(zhuǎn)化成13-HOE，并成功提純13-HOE研究其抗真菌特性。13-HOE主要由含有亞油酸水合酶的菌株催化亞油酸轉(zhuǎn)化而來(lái)，且不同的亞油酸水合酶可合成不同的HUFA。

1.2 10-HOE、13-HOE的功能特性

1.2.1 抑真菌性 HUFA具有良好的真菌抑制特性，而在食品腐敗真菌中，HUFA抗真菌性主要針對(duì)的是霉菌而非酵母菌[12]，2013年加拿大阿爾伯塔大學(xué)G?nzle團(tuán)隊(duì)首次在發(fā)酵面團(tuán)中發(fā)現(xiàn)Levilactobacillus hammesii可轉(zhuǎn)化亞油酸生成10-HOE，同時(shí)證實(shí)，與傳統(tǒng)面包相比，用該發(fā)酵面團(tuán)制備的面包貨架期延長(zhǎng)了2～6 d以上，其真菌抑制效果可與商品化真菌抑制劑丙酸（添加量為4%）媲美[1,29]，且對(duì)面包的感官特性無(wú)不良影響。Quattrini等[30]認(rèn)為HUFA在酸面團(tuán)面包中的抗菌作用源于HUFA與醋酸等抗菌物質(zhì)的協(xié)同作用。該團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)性研究了10-HOE、13-HOE、馬桑酸、蓖麻油酸等HUFA的真菌抑制特性。如表2所示，10-HOE、13-HOE、馬桑酸、蓖麻油酸等HUFA對(duì)A. niger和P. roqueforti的抑制最明顯，其MIC值均小于0.5 g/L。與HUFA相比，亞油酸、油酸不含羥基；12-羥基硬脂酸、9,12–二羥基硬脂酸不含不飽和鍵；硬脂酸中羥基及不飽和鍵都不具備，這五種物質(zhì)的MIC均大于20 g/L，真菌抑制效果不明顯[1,13]。研究表明10-HOE、13-HOE的羥基及不飽和鍵是它們抗真菌特性的重要結(jié)構(gòu)特征[1,10,13]；碳鏈中羥基的位置也對(duì)HUFA的抗真菌效果起到關(guān)鍵作用：羥基位于C9～C13位置的碳18HUFA抑制了霉菌P. roqueforti和A. niger生長(zhǎng)，而羥基位于C2及C18位置的HUFA對(duì)霉菌抑制作用較小[12]。此外，其他乳酸菌來(lái)源的3-OH C10-12脂肪酸也被報(bào)道具有抗真菌作用[31]。HUFA所具有的廣泛抑真菌譜使其可作為一種新型天然防腐劑應(yīng)用于食品中，目前部分研究探索了以HUFA為代表的脂肪酸氧化產(chǎn)物在植物抗病、抗致病真菌方面的功能[11,32]，雖未有文獻(xiàn)報(bào)道10-HOE和13-HOE在這方面的功能，但與其結(jié)構(gòu)類(lèi)似的馬桑酸、馬桑酸9-OH同系物及C18:3的HUFA同系物均在植物抗病毒中發(fā)揮了重要的作用。例如，研究[33-34]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因水稻植株（transgenic rice（F78Ri））對(duì)稻瘟病菌Magnaporthe grisea有抗性，其C18:2脂肪酸到C18:3脂肪酸的轉(zhuǎn)化途徑受到抑制，該額外積累的C18:2脂肪酸轉(zhuǎn)化成馬桑酸等系列HUFA、其它脂肪酸氧化物和過(guò)氧化產(chǎn)物，這些積累的脂肪酸代謝產(chǎn)物均能抑制M.grisea的孢子萌發(fā)及生長(zhǎng)。據(jù)報(bào)道，一些HUFA與產(chǎn)生這些HUFA的酶在不同的植物防御代謝途徑中均起到重要的作用，如羥基在脂肪酸碳鏈中部（13-OH及9-OH羥基脂肪酸）、羥基在脂肪酸碳鏈兩端（2-OH及w-OH脂肪酸）的HUFA[35]。這些與細(xì)菌源HOE結(jié)構(gòu)極其類(lèi)似的HUFA在植物抗病中有一定的應(yīng)用前景，由此推測(cè)細(xì)菌源的10-HOE和13-HOE在植物防御方面可能有類(lèi)似的調(diào)控作用，但該方面的研究及應(yīng)用還沒(méi)有報(bào)道。

表2 典型脂肪酸的真菌抑制特性的比較Table 2 Comparison of fungal inhibition ability of typical fatty acids

大多數(shù)研究認(rèn)為HUFA的抗真菌機(jī)制是由于其嵌入真菌細(xì)胞脂質(zhì)雙分子層，而破壞了真菌細(xì)胞膜功能[12,31,36]。Sj?gren等[31]證明來(lái)源于L. plantarumMiLAB 14的四種3-羥基脂肪酸（3-羥基-5-十二碳烯酸、3-羥基十二烷酸、3-羥基四癸酸、3-羥基癸酸）可通過(guò)影響真菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增加了膜的通透性，使細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)和蛋白質(zhì)釋放，最終導(dǎo)致真菌細(xì)胞的解體。G?nzle團(tuán)隊(duì)[12]則認(rèn)為HUFA可能針對(duì)真菌細(xì)胞膜的特定區(qū)域或脂筏進(jìn)行作用，而不改變整個(gè)膜的流動(dòng)性；真菌對(duì)HUFA的敏感性可能與甾醇含量有關(guān)，耐HUFA的酵母（其MIC一般大于等于1 g/L）相對(duì)于HUFA敏感的霉菌（其MIC一般小于1 g/L）擁有更高的甾醇含量[10,12]。晏石娟等[37]研究了馬桑酸等脂氧素的抑制真菌機(jī)制，認(rèn)為脂氧素通過(guò)調(diào)控真菌的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）活性而抑制曲霉屬真菌生長(zhǎng)繁殖。10-HOE及13-HOE的真菌抑制機(jī)理目前仍處于探索階段，需要進(jìn)一步研究其具體抑菌過(guò)程。

1.2.2 抗炎性 在腸道性炎癥中，腫瘤壞死因子是發(fā)病的關(guān)鍵促炎細(xì)胞因子，腫瘤壞死因子受體的阻斷已被證明能有效抑制小鼠結(jié)腸炎中的炎癥和細(xì)胞凋亡[38]，因此，腫瘤壞死因子受體的阻斷成為一個(gè)抑制腸道炎癥的有利手段。10-HOE是亞油酸的腸道微生物代謝物，Miyamoto等[23]發(fā)現(xiàn)G蛋白偶聯(lián)受體40在腸道屏障中起關(guān)鍵作用，而腸道微生物代謝產(chǎn)物10-HOE可作為一種新型內(nèi)源性G蛋白偶聯(lián)受體40激動(dòng)劑，通過(guò)不飽和雙鍵與受體結(jié)合，下調(diào)腫瘤壞死因子受體2的表達(dá)，改善了腸道屏障的損傷，從而達(dá)到一定的抗炎作用。Bergamo等[22]通過(guò)研究10-HOE對(duì)脂肪酸代謝物在抗原呈遞細(xì)胞成熟及促炎因子釋放過(guò)程的影響，證實(shí)了腸道源L. plantarumAKU 1009a在合成共軛亞油酸過(guò)程中產(chǎn)生的10-HOE與食品、藥品中的功能成分順9，反11-共軛亞油酸類(lèi)似，可通過(guò)增強(qiáng)抗氧化和解毒防御的能力對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)，這可能是由于10-HOE降低了促炎因子的釋放而對(duì)腸道炎癥起到一定的抑制作用。

除了可抑制腸道炎癥，10-HOE對(duì)大腦炎癥有潛在的調(diào)節(jié)和控制作用。阿爾茨海默癥、帕金森綜合征、多發(fā)性硬化癥等神經(jīng)退行性疾病的病理發(fā)生與大腦炎癥密切相關(guān)[39]。Ikeguchi等[40]認(rèn)為抑制小膠質(zhì)細(xì)胞（中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種免疫細(xì)胞）的活性對(duì)神經(jīng)退行性疾病可能是一個(gè)有利的治療方法，其研究發(fā)現(xiàn)酮醇和10-HOE可通過(guò)抑制胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶磷酸化，從而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞一氧化氮合酶的表達(dá)及一氧化氮的產(chǎn)生，對(duì)大腦炎癥有望達(dá)到抑制及治療的作用。

另外，馬桑酸（13-hydroxyoctadecadienoic acid,或稱(chēng)13-HODE和13-OH C18:2）及其異構(gòu)體9-羥基十八碳二烯酸（9-HODE或稱(chēng)9-OH C18:2）是一種與10-HOE及13-HOE結(jié)構(gòu)類(lèi)似的HUFA，其含量變化與很多炎癥都有較強(qiáng)相關(guān)性。有研究表明，這些HUFA在一定程度上參與了炎癥過(guò)程的調(diào)控[4,5,41]。與馬桑酸和9-羥基十八碳二烯酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似，10-HOE和13-HOE有可能具有相應(yīng)的調(diào)控作用，但該方面的研究仍有較多空白有待補(bǔ)充。

1.2.3 抗過(guò)敏性 Kaikiri等[42]通過(guò)對(duì)特異性皮炎模型鼠NC/Nga小鼠喂食含0.01%（W/W）10-HOE的AIN-93G飼料，測(cè)試其靜脈血樣中總IgE（免疫球蛋白E）水平、糞便中的IgA（免疫球蛋白A）和腸道菌群，分析小腸黏膜的皮膚淋巴細(xì)胞、皮膚切片組織，研究10-HOE對(duì)NC/Nga小鼠的抗過(guò)敏作用。結(jié)果顯示10-HOE可通過(guò)降低血清IgE、調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡相關(guān)的細(xì)胞因子，誘導(dǎo)IgA的產(chǎn)生，而IgA可以抑制腸道抗原的免疫激活，從而改善了NC/Nga小鼠的過(guò)敏性皮炎的癥狀，同時(shí)還抑制了皮膚背部的肥大細(xì)胞浸潤(rùn)（肥大細(xì)胞浸潤(rùn)是過(guò)敏性炎癥的主要表現(xiàn)）。該研究表明，10-HOE有望作為一種新型功能性成分，具有預(yù)防過(guò)敏性皮炎等過(guò)敏性疾病的潛力。

2 亞油酸水合酶的研究進(jìn)展

2.1 亞油酸水合酶概述

水合酶（EC 4.2.1.x）指催化雙鍵可逆水化反應(yīng)的一類(lèi)酶，常見(jiàn)的水合酶主要有乙炔水合酶（EC 4.2.1.112）、基輔酮水合酶（EC 4.2.1.95）、延胡索酸水合酶（EC 4.2.1.2）[43]等。水合酶在常用重組宿主中表達(dá)良好，通常對(duì)底物具有良好的活性，但目前大多水合酶具有輔酶因子依賴(lài)性[43]。

亞油酸水合酶（linoleate hydratase, LHT）最初稱(chēng)為肌球蛋白交叉反應(yīng)抗原（myosin-cross-reactive antigens，MCRA），是對(duì)亞油酸雙鍵位置具有特異性且不會(huì)發(fā)生反異構(gòu)化反應(yīng)的特異性水合酶，分子量約為67 kDa[44]，其特征在于它們可將脂肪酸雙鍵羥基化，其中氧原子來(lái)自水而不是分子氧[45]。亞油酸水合酶廣泛存在于革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌中，1994年Kil等[21]首次在Streptococcus pyogenes中發(fā)現(xiàn)MCRA由一類(lèi)廣泛存在于細(xì)菌中的蛋白質(zhì)組成。研究證實(shí)MCRA具有脂肪酸水合酶的活性，并與Limosilactobacillus reuteriPYR8中的亞油酸異構(gòu)酶具有高度的同源性[46]。亞油酸水合酶可歸類(lèi)為依賴(lài)黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的雙鍵水合酶，屬于碳氧裂解酶，其中FAD不參與催化反應(yīng)，但對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性起作用[45]。

根據(jù)羥基位置的不同，亞油酸水合酶主要分為10-亞油酸水合酶（10-LHT）和13-亞油酸水合酶（13-LHT），其中10-LHT除對(duì)亞油酸具備活性外，也有催化油酸生成10-羥基硬脂酸的能力，也可稱(chēng)為油酸水合酶（EC 4.2.1.53）[47]。2011年Kishino等[48]發(fā)現(xiàn)L.plantarumAKU 1009a含有10-LHT，且主要存在于細(xì)胞膜上。2013年Yang等[49]探索了四種分別來(lái)自L(fǎng)acticaseibacillus rhamnosus、L. plantarum、L.acidophilus和B. animalissubsp.lactis的MCRA，發(fā)現(xiàn)它們均具備10-LHT的活性。2015年，Kim等[15]首次深入研究了10-LHT及13-LHT，結(jié)果顯示10-LHT對(duì)順-9雙鍵表現(xiàn)出較好的區(qū)域選擇性，對(duì)亞油酸及油酸都具有活性，可合成10-HOE和10-羥基硬脂酸；13-LHT則具有順-12雙鍵的特異性，可經(jīng)過(guò)酶轉(zhuǎn)化合成13-HOE，且13-LHT蛋白是亞油酸特異性水合酶，不會(huì)發(fā)生反異構(gòu)化反應(yīng)。

2.2 亞油酸水合酶的底物特性和結(jié)構(gòu)特性

亞油酸水合酶對(duì)不同的底物顯示不同的活性，均可特異性轉(zhuǎn)化為不同的羥基脂肪酸，但對(duì)亞油酸的活性最強(qiáng)。Kim等[15]研究了重組10-LHT和13-LHT酶促動(dòng)力學(xué)，比較它們對(duì)不同底物的活性，通過(guò)動(dòng)力學(xué)參數(shù)表明10-LHT對(duì)亞油酸及油酸均有一定的活性，10-LHT對(duì)亞油酸的催化效率（kcat/km）為5（1/mmol/L/min），高于對(duì)油酸的催化效率3.2（1/mmol/L/min）；13-LHT則對(duì)亞油酸表現(xiàn)出更高的催化效率，約為82（1/mmol/L/min），同時(shí)13-LHT對(duì)α-亞麻酸的及γ-亞麻酸的催化效率僅分別為9和13（1/mmol/L/min），由于對(duì)其他底物的活性低，其余動(dòng)力學(xué)參數(shù)未被確定。

通過(guò)克隆表達(dá)來(lái)源于L. acidophilusNCFM的亞油酸水合酶，Volkov等[50]研究證明亞油酸水合酶是由591個(gè)殘基組成的蛋白質(zhì)，晶體結(jié)構(gòu)如圖4所示。亞油酸水合酶是同型二聚體，每個(gè)單體含4個(gè)結(jié)構(gòu)域；白色通道和黃色通道分別是底物和FAD結(jié)合通道；與其它FAD依賴(lài)性酶相比，多了第4個(gè)黃色結(jié)構(gòu)域；亞油酸水合酶的第4個(gè)域位于C端，由三個(gè)螺旋組成，它覆蓋從蛋白質(zhì)表面通向活性位點(diǎn)的疏水底物通道的入口。在亞油酸存在的情況下，一個(gè)原基的第四個(gè)域發(fā)生構(gòu)象變化，打開(kāi)了同型二聚體的另一個(gè)原基的底物結(jié)合通道的入口。亞油酸分子結(jié)合在底物通道的入口，表明底物識(shí)別觸發(fā)了蓋子域的運(yùn)動(dòng)。亞油酸水合酶合成10-HOE及13-HOE原理如圖5所示，通過(guò)亞油酸水合酶，可將亞油酸特異性轉(zhuǎn)化為10-HOE和13-HOE，其中羥基來(lái)自于一個(gè)水分子[44]。亞油酸水合酶具有底物專(zhuān)一性，且因其種類(lèi)不同對(duì)亞油酸不飽和鍵區(qū)域選擇性不同，其晶體結(jié)構(gòu)決定了該水合酶的FAD依賴(lài)性。據(jù)現(xiàn)有關(guān)于亞油酸水合酶動(dòng)力學(xué)研究表明，野生菌中獲得的13-LHT的活性均普遍高于10-LHT，高效10-LHT的篩選仍有較大的空白，有待繼續(xù)探索。

圖5 亞油酸水合酶催化合成10-HOE（A）和13-HOE（B）的反應(yīng)式Fig.5 Synthesis of 10-HOE (A) and 13-HOE (B)by linoleic acid hydratase

2.3 亞油酸水合酶合成HUFA

10-HOE及13-HOE主要通過(guò)含有亞油酸水合酶的野生菌轉(zhuǎn)化亞油酸獲得，但野生菌篩選過(guò)程繁瑣，產(chǎn)物復(fù)雜，直接使用亞油酸水合酶可高效專(zhuān)一地合成10-HOE及13-HOE，酶法是合成10-HOE及13-HOE的常用方法之一。Oh等[51]克隆了L. acidophilusNBRC 13951中的雙鍵水合酶，這些酶對(duì)亞油酸的C-9或C-12雙鍵的水合作用非常專(zhuān)一，因此可以選擇性地從亞油酸中生成10-HOE或13-HOE。Chen等[13]研究L. plantarum、L. reuteri、L. hammesii和L. spicheri中亞油酸水合酶的特性，在Escherichia coli中克隆、表達(dá)和純化了10-LHT，建立了10-LHT的酶活測(cè)定方法：4.5 mg亞油酸，25 μg純化的10-LHT，在1 mL含50 mmol/L NaCl、2%乙醇和10%甘油的50 mmol/L MES緩沖液（pH=6.1）中，25 ℃轉(zhuǎn)化3 h。Kim等[15]在E. coli中克隆、表達(dá)和純化了10-LHT和13-LHT，研究了兩種酶的底物特異性和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，系統(tǒng)測(cè)定了酶轉(zhuǎn)化過(guò)程中底物和產(chǎn)物濃度的變化，在10-LHT的酶底比是13-LHT的酶底比6倍的條件下，10-HOE、13-HOE的最終摩爾轉(zhuǎn)化率分別是40%、81%。故目前看來(lái)13-LHT的酶轉(zhuǎn)化效率要高于10-LHT，但酶轉(zhuǎn)化相關(guān)研究報(bào)道較少，需要進(jìn)行更多酶學(xué)特性研究和產(chǎn)物合成研究。

2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成

細(xì)胞轉(zhuǎn)化主要是通過(guò)含有LHT的野生菌或基因工程菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化合成。與酶法合成相比，細(xì)胞轉(zhuǎn)化法簡(jiǎn)化了酶的提取純化步驟，合成過(guò)程較簡(jiǎn)便。目前，多組研究發(fā)現(xiàn)L. plantarum[13]、L. acidophilus[14]、Nocardia cholesterolicum[52]等野生菌細(xì)胞具備合成HUFA的能力。其中以2 g/L亞油酸為底物，pH為6.5，在30 ℃轉(zhuǎn)化7 d，L. acidophilus13951可合成65%的13-HOE，而Lacticaseibacillus paracaseisubsp.paracaseiJCM 1111對(duì)10-HOE的合成轉(zhuǎn)化率達(dá)到91%，是目前野生菌合成10-HOE及13-HOE產(chǎn)量最高的報(bào)道[27]。

與野生菌相比，基因工程菌可專(zhuān)一性大量表達(dá)目標(biāo)酶，細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率高、產(chǎn)物雜質(zhì)少，因而基因工程菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化是產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)10-HOE和13-HOE的有效途徑[13-14]。楊波[53]通過(guò)基因工程將L. plantarumZS2058中的10-LHT表達(dá)至大腸桿菌中，0.5 mg/mL濕菌體重懸于KPB緩沖液（pH6.0），37 ℃、200 r/min下進(jìn)行簡(jiǎn)單的細(xì)胞轉(zhuǎn)化6 h，重組大腸桿菌在輔酶因子FAD及NADH的催化下反應(yīng)累積得到產(chǎn)物10-HOE。2015年P(guān)ark等[14]在大腸桿菌中表達(dá)了L. acidophilus中的13-LHT，優(yōu)化的表達(dá)條件為：50 mmol/L檸檬酸/磷酸鹽緩沖液（pH6.0）中，加入0.25%（v/v）Tween 40、25 g/L菌泥和100 g/L亞油酸，40 ℃反應(yīng)3 h，最終獲得79%的13-HOE合成產(chǎn)率。與13-HOE相比，還未有文獻(xiàn)報(bào)道工程菌在高底物濃度條件下高效率合成10-HOE。

3 展望

HUFA具有多種功能特性，特別是10-HOE和13-HOE可作為一類(lèi)新型天然抗真菌防腐劑應(yīng)用于食品防腐[30,54-55]。目前關(guān)于10-HOE及13-HOE的性質(zhì)及應(yīng)用研究剛起步，亞油酸水合酶的底物特性研究不完整，尤其關(guān)于10-LHT的高效轉(zhuǎn)化未有具體報(bào)道，HUFA的抗真菌機(jī)制尚未深入解釋?zhuān)?0-HOE及13-HOE更多的食用藥用價(jià)值有待挖掘。此外，HUFA的酶法合成及細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成僅局限于酶學(xué)特性研究或?qū)嶒?yàn)室轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化，轉(zhuǎn)化效率較低，無(wú)法應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，后續(xù)研究可通過(guò)酶和細(xì)胞的有效荷載、納米乳液、皮克林乳液等膠體界面化學(xué)理論，來(lái)定向提高HUFA生物合成體系的轉(zhuǎn)化效率。