趙旭庭 徐盼 馬政 仲德 劉林雨 倪黎綱 吳井生

摘要：? 通過(guò)檢測(cè)楓涇豬、梅山豬和沙烏頭豬的長(zhǎng)純合片段（Runs of homozygosity， ROH），鑒定其與3個(gè)豬種經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的候選基因。利用全基因組單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms， SNP）芯片數(shù)據(jù)對(duì)這3個(gè)豬群體進(jìn)行全基因組ROH檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)ROH數(shù)量、長(zhǎng)度及分布，計(jì)算基于ROH的近交系數(shù)（ F?? ROH ），并在高頻ROH區(qū)域鑒定候選功能基因。結(jié)果顯示，從楓涇豬、梅山豬和沙烏頭豬群體中分別檢測(cè)到 1 588 個(gè)、 3 314 個(gè)和 4 419 個(gè)ROH。楓涇豬的ROH平均長(zhǎng)度為12.84 Mb，平均 F?? ROH 為0.084;梅山豬的ROH平均長(zhǎng)度為10.55 Mb，平均 F?? ROH 為0.164;沙烏頭豬的ROH平均長(zhǎng)度為10.52 Mb，平均 F?? ROH 為0.141。在高頻ROH區(qū)域共鑒定到9個(gè)楓涇豬候選功能基因和8個(gè)梅山豬候選功能基因。研究結(jié)果為楓涇豬、梅山豬和沙烏頭豬的資源保護(hù)和分子標(biāo)記輔助選擇奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：? 豬; 長(zhǎng)純合片段; 近交系數(shù); 候選基因

中圖分類(lèi)號(hào)：? S813.1??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A??? 文章編號(hào)：? 1000-4440（2021）05-1234-10

Genome-wide scan for run of homozygosity and identification of corresponding candidate genes in Fengjing pigs， Meishan pigs and Shawutou pigs

ZHAO Xu-ting? 1 ， XU Pan? 1 ， MA Zheng? 1 ， ZHONG De? 1 ， LIU Lin-yu? 1 ， NI Li-gang? 1 ， WU Jing-sheng? 2

（1.Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College， Taizhou 225300， China; 2.Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry， Jurong 212400， China）

Abstract：? By detecting runs of homozygosity （ROH） of Fengjing pig， Meishan pig and Shawutou pig， the candidate genes related to the economic traits of the three pig breeds were identified. The genome-wide single nucleotide polymorphisms （SNP） chip data were used to perform genome-wide ROH scan for the three pig breeds. The number， length and distribution of ROH were counted， and the inbreeding coefficient （ F?? ROH ） was calculated based on ROH. In addition， the functional candidate genes were identified in the high frequency ROH region. The results showed that ?1 588 ， 3 314 and 4 419 ROH were detected in the three pig populations， respectively. The average length of ROH was 12.84 Mb and the average ?F?? ROH ?was 0.084 in Fengjing pigs. The average length of ROH was 10.55 Mb and the average ?F?? ROH ?was 0.164 in Meishan pigs. The average length of ROH was 10.52 Mb and the average ?F?? ROH ?was 0.141 in Shawutou pigs. Nine functional candidate genes of Fengjing pig and eight functional candidate genes of Meishan pig were identified in high frequency ROH region. The results lay a foundation for resource conservation and molecular marker-assisted selection of Fengjing pig， Meishan pig and Shawutou pig.

Key words：? pig; runs of homozygosity （ROH）; inbreeding coefficient; candidate gene

長(zhǎng)純合片段（Runs of homozygosity， ROH）是基因組上一定數(shù)量、一定密度的單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide ploymorhphisms， SNPs）表現(xiàn)為純合的一段區(qū)域? [1] 。在人工選擇的過(guò)程中，畜禽群體的基因組被重塑，所選區(qū)域中的ROH頻率會(huì)提高，甚至產(chǎn)生“ROH島”。ROH信息在畜禽親緣關(guān)系鑒定、遺傳多樣性分析、近交衰退評(píng)估、選擇信號(hào)鑒定和功能基因篩選等方面發(fā)揮著重要作用。Keller等? [2] 在比較基于ROH的近交系數(shù)（ F?? ROH ）、基于基因組雜合度的近交系數(shù)（ F?? HOM ）、基于基因組關(guān)系矩陣的近交系數(shù)（ F?? GRM ）和基于系譜信息的近交系數(shù)（ F?? PED ）后發(fā)現(xiàn)， F?? ROH 是最有效的估計(jì)近交的方法。Mastrangelo等? [3] 在Pontremolese、Varzese-Ottonese和Mucca Pisana群體中檢測(cè)到高水平的ROH，針對(duì)這些群體，在實(shí)施配種計(jì)劃中應(yīng)盡量增加種公畜血統(tǒng)，減少其遺傳多樣性的損失，維持或者增加其群體有效含量。Saura等? [4] 分析了近交對(duì)伊比利亞豬繁殖性狀的影響，結(jié)果表明，近交系數(shù)每增加0.1，其仔豬初生后的存活率、仔豬出生后的總數(shù)量有下降趨勢(shì)。Zhong等? [5] 利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序數(shù)據(jù)在金華豬群體的ROH島中鑒別到與繁殖、肉質(zhì)、食欲及抗病性狀相關(guān)的基因。

楓涇豬、梅山豬和沙烏頭豬是江蘇省優(yōu)良的地方豬遺傳資源，以產(chǎn)仔數(shù)高、肉質(zhì)優(yōu)良、耐粗飼和環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng)等特點(diǎn)而聞名。本研究利用中芯一號(hào)育種芯片數(shù)據(jù)對(duì)這3個(gè)豬群體進(jìn)行全基因組ROH檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)ROH數(shù)量、長(zhǎng)度及分布，計(jì)算基于ROH的近交系數(shù)，并在高頻ROH區(qū)域鑒定候選功能基因，以期為楓涇豬、梅山豬和沙烏頭豬的資源保護(hù)和分子標(biāo)記輔助選擇奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)動(dòng)物為來(lái)自鎮(zhèn)江牧苑動(dòng)物科技開(kāi)發(fā)有限公司省級(jí)楓涇豬保種場(chǎng)的107頭楓涇豬（FJ）、江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院國(guó)家級(jí)梅山豬保種場(chǎng)的94頭梅山豬（MS）和江蘇興旺農(nóng)牧科技發(fā)展有限公司國(guó)家級(jí)沙烏頭豬保種場(chǎng)的146頭沙烏頭豬（SWT）。采集豬耳組織樣后保存于 -20 ℃ 冰箱內(nèi)待用。

1.2 SNP芯片分型及質(zhì)量控制

委托北京康普森生物技術(shù)有限公司使用中芯一號(hào)育種芯片對(duì)107頭楓涇豬、94頭梅山豬和146頭沙烏頭豬進(jìn)行基因分型。用plink軟件分別對(duì)3個(gè)豬群體的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)：1）個(gè)體檢出 率≥ 90%;2）SNP檢出 率≥ 90%;3）次等位基因頻率（ MAF ）≥0.01;4）哈迪溫伯格平衡? P ≥? 1× 10? -5 ;5）剔除性染色體。

1.3 全基因組ROH檢測(cè)

ROH檢測(cè)使用Plink軟件，使用滑動(dòng)窗口的方法對(duì)常染色體進(jìn)行檢測(cè)，具體的檢測(cè)參數(shù)：1）ROH長(zhǎng)度大于1 Mb;2）至少連續(xù)50個(gè)SNPs;3）連續(xù)SNP間的距離小于1 Mb;4）最多允許ROH中有5個(gè)缺失和1個(gè)雜合;5）窗口閾值為0.01;6）密度為0.01 ?SNP/kb 。

1.4 基因組近交系數(shù)的計(jì)算

利用ROH計(jì)算近交系數(shù)（ F?? ROH ），公式如下：

F?? ROH? =∑? L?? ROH? /? L?? auto

其中：∑? L?? ROH? 為常染色體上ROH片段的長(zhǎng)度之和， L?? auto 為常染色體的物理總長(zhǎng)度。

根據(jù)上式計(jì)算 F?? ROH 1.0～5.0 Mb 、 F?? ROH 5.1～10.0 Mb 、 F?? ROH>10.0 Mb 和 F?? ROH total ?4種近交系數(shù)之間的Pearson相關(guān)系數(shù)，其中 F?? ROH total 為基于全部長(zhǎng)度的ROH計(jì)算的近交系數(shù)。

1.5 高頻ROH區(qū)域的檢測(cè)及候選基因的鑒定

統(tǒng)計(jì)每個(gè)SNP在各自豬群體內(nèi)參與組成ROH的次數(shù)占樣本數(shù)的比例，并將高于45%的SNP區(qū)域作為高頻ROH區(qū)域，利用RCircos包繪制3個(gè)豬群體ROH頻率在染色體上分布的Circos圖。基于高頻ROH區(qū)段的物理位置，在豬基因組注釋文件（ftp：//ftp.ensembl.org/pub/release-100/gtf/sus_scrofa/Sus_scrofa.Sscrofa11.1.100.chr.gtf.gz）中檢索基因。

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)高頻ROH區(qū)域注釋到的基因進(jìn)行GO（Gene ontology，基因本體）功能富集和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因與基因組百科全書(shū)）Pathway富集分析，當(dāng)? P ≤ 0.05時(shí)，則表示顯著富集。將顯著富集到生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路的基因與豬數(shù)量性狀基因座（Quantitative Trait Locus， QTL）數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/SS/index）進(jìn)行比對(duì)，獲得候選功能基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型的質(zhì)量控制

中芯一號(hào)育種芯片含有 51 315 個(gè)SNP位點(diǎn)，經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制后，對(duì)剩余107頭楓涇豬的 19 895 個(gè)SNPs、94頭梅山豬的 24 526 個(gè)SNPs和146頭沙烏頭豬的 32 275 個(gè)SNPs進(jìn)行后續(xù)分析。

2.2 ROH數(shù)量、長(zhǎng)度及分布統(tǒng)計(jì)

由表1、圖1、圖2可以看出，從楓涇豬、梅山豬和沙烏頭豬群體中分別檢測(cè)到 1 588 個(gè)、 3 314 個(gè)和 4 419 個(gè)ROH，其長(zhǎng)度主要集中在40.00 Mb以內(nèi)。楓涇豬ROH的平均長(zhǎng)度為12.84 Mb;ROH的最長(zhǎng)長(zhǎng)度為118.00 Mb，含有 1 328 個(gè)SNPs，位于第15號(hào)染色體上;ROH的最短長(zhǎng)度為2.70 Mb，含有50個(gè)SNPs，位于第13號(hào)染色體上;楓涇豬個(gè)體的平均ROH數(shù)量為14.84個(gè)，以15號(hào)染色體上的ROH最多，18號(hào)染色體上的ROH最少。梅山豬ROH的平均長(zhǎng)度為10.55 Mb;ROH的最長(zhǎng)長(zhǎng)度為98.33 Mb，含有 1 313 個(gè)SNPs，位于第14號(hào)染色體上;ROH的最短長(zhǎng)度為1.95 Mb，含有59個(gè)SNPs，位于第6號(hào)染色體上;梅山豬個(gè)體ROH的平均數(shù)量為35.26個(gè)，14號(hào)染色體上的ROH最多，12號(hào)染色體上的ROH最少。沙烏頭豬ROH的平均長(zhǎng)度為10.52 Mb;ROH的最長(zhǎng)長(zhǎng)度為130.29 Mb，含有 1 727 個(gè)SNPs，位于第1號(hào)染色體上;ROH的最短長(zhǎng)度為1.70 Mb，含有50個(gè)SNPs，位于第6號(hào)染色體上;沙烏頭豬個(gè)體ROH的平均數(shù)量為30.27個(gè)，1號(hào)染色體上的ROH最多，10號(hào)染色體上的ROH最少。

2.3 近交系數(shù)

由表2可以看出，楓涇豬基因組 F?? ROH total 的最大值為0.171，最小值為0.003，平均值為0.084;梅山豬基因組 F?? ROH total 的最大值為0.305，最小值為0.057，平均值為0.164;沙烏頭豬基因組 F?? ROH total 的最大值為0.501，最小值為0.022，平均值為0.141;3個(gè)群體中梅山豬的平均 F?? ROH total 最高。對(duì)比表2中3種豬群體的4種近交系數(shù)發(fā)現(xiàn)，楓涇豬群體中 F?? ROH 5.1～10.0 Mb 與 F?? ROH >10.0 Mb 、 F?? ROH total 分別在0.05、 0.001 水平顯著相關(guān)， F?? ROH >10.0 Mb 與 F?? ROH total 在0.001水平顯著相關(guān);梅山豬群體中 F?? ROH 5.1～10.0 Mb 與 F?? ROH 1.0～5.0 Mb 、 F?? ROH total 及 F?? ROH >10.0 Mb 與 F?? ROH total 均在0.001水平顯著相關(guān);沙烏頭豬群體中 F?? ROH 1.0～5.0 Mb 與 F?? ROH total 在0.01水平顯著相關(guān)， F?? ROH 1.0～5.0 Mb 與 F?? ROH 5.1～10.0 Mb 、 F?? ROH 5.1～10.0 Mb 與 F?? ROH >10.0 Mb 、 F ??ROH 5.1～10.0 Mb 與 F?? ROH total 、 F?? ROH >10.0 Mb 與 F?? ROH total 均在0.001水平顯著相關(guān)（表3）。

2.4 高頻ROH區(qū)域及候選基因的鑒定

本研究選取45%作為高頻ROH區(qū)域的閾值，在楓涇豬、梅山豬和沙烏頭豬群體中分別檢測(cè)到7個(gè)、20個(gè)和9個(gè)高頻ROH區(qū)域，分別注釋到414個(gè)、547個(gè)和151個(gè)基因（表4）。楓涇豬、梅山豬和沙烏頭豬沒(méi)有共同的高頻ROH區(qū)域，楓涇豬和梅山豬在第14號(hào)染色體上有共同高頻ROH區(qū)域，梅山豬、沙烏頭豬在第8號(hào)、11號(hào)染色體上有共同高頻ROH區(qū)域（圖3）。

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)分別對(duì)楓涇豬、梅山豬和沙烏頭豬群體中注釋到的414個(gè)、547個(gè)和151個(gè)基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG Pathway富集分析，結(jié)果分別見(jiàn)表5、表6和表7。分析得出，楓涇豬群體的414個(gè)基因中的136個(gè)基因顯著富集于谷胱甘肽代謝過(guò)程、肝臟發(fā)育、炎癥反應(yīng)的負(fù)調(diào)控等22個(gè)GO條目和朊病毒病等4個(gè)信號(hào)通路;梅山豬群體的547個(gè)基因中的134個(gè)基因顯著富集于半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性的負(fù)調(diào)節(jié)、谷胱甘肽代謝過(guò)程、類(lèi)黃酮葡萄糖醛酸化等22個(gè)GO條目和11個(gè)信號(hào)通路;沙烏頭豬群體的151個(gè)基因中的24個(gè)基因顯著富集于類(lèi)黃酮葡萄糖醛酸化、類(lèi)黃酮生物合成過(guò)程、生物礦物組織發(fā)育等11個(gè)GO條目和抗壞血酸和醛糖酸鹽代謝等9個(gè)信號(hào)通路。分別將楓涇豬群體的136個(gè)基因、梅山豬群體的134個(gè)基因和沙烏頭豬群體的24個(gè)基因與豬QTL數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到楓涇豬候選功能基因? HNF1A、CDH17、LIF、DECR1、ARL15、ACTN2、FABP5、FABP4和EWSR1? （表5），梅山豬候選功能基因? CTSH、MSTN、GC、VEGFA、ZDHHC2、MTMR7、CDC5L和LIF? （表6）。

3 討 論

ROH可以指示親緣的遠(yuǎn)近和近交的歷史，ROH片段越長(zhǎng)，家系內(nèi)存在近世代近交的可能性越高? [2， 6] 。在0～5.0 Mb長(zhǎng)度的ROH中，楓涇豬所占比例最低，沙烏頭豬所占比例最高;在大于5.0 Mb長(zhǎng)度的ROH中，楓涇豬所占比例最高，沙烏頭豬所占比例最低。該結(jié)果與ROH平均長(zhǎng)度的結(jié)果一致（楓涇豬ROH的平均長(zhǎng)度最長(zhǎng)，沙烏頭豬ROH的平均長(zhǎng)度最短）。3個(gè)豬群中長(zhǎng)度大于5.0 Mb的ROH所占比例都較高，表明3個(gè)豬群經(jīng)歷了較高程度的近交，可能與3個(gè)豬群的群體規(guī)模有關(guān)。在過(guò)去幾十年里，歐洲現(xiàn)代品種豬（主要是大白豬、長(zhǎng)白豬和杜洛克豬）因瘦肉率高、生長(zhǎng)速度快、飼料轉(zhuǎn)化率高而不斷被引進(jìn)中國(guó)，目前占據(jù)著中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的統(tǒng)治地位，導(dǎo)致中國(guó)地方豬的養(yǎng)殖數(shù)量顯著減少，楓涇豬、梅山豬和沙烏頭豬的種群規(guī)模也因此受到影響。在本研究中，楓涇豬、梅山豬和沙烏頭豬樣品采集于保種場(chǎng)，種群數(shù)量有限，從而導(dǎo)致近世代較高程度的近交。

每個(gè)環(huán)代表1個(gè)豬群體，從內(nèi)到外的環(huán)分別為楓涇豬、梅山豬、沙烏頭豬，柱子代表ROH頻率。圖中數(shù)據(jù)表示染色體的位置信息。

研究發(fā)現(xiàn)，基于ROH的近交系數(shù)（ F?? ROH ）與基于系譜信息的近交系數(shù)（ F?? PED ）間的相關(guān)系數(shù)隨著ROH長(zhǎng)度的增加而提高，在群體系譜信息不全的情況下， F?? ROH 可以替代 F?? PED 來(lái)評(píng)估近交程度? [7] 。楓涇豬、梅山豬和沙烏頭豬保種場(chǎng)早期的豬主要從主產(chǎn)區(qū)及周邊長(zhǎng)期從事地方豬飼養(yǎng)的農(nóng)戶收集而來(lái)，系譜信息不全，因此需要通過(guò)基于ROH的近交系數(shù)（ F?? ROH ）來(lái)評(píng)估其近交程度。本研究基于ROH計(jì)算了每個(gè)豬群的4種近交系數(shù)（ F?? ROH 1.0～5.0 Mb 、 F ??ROH 5.1～10.0 Mb 、 F?? ROH >10.0 Mb 和 F?? ROH total ），結(jié)果表明，3個(gè)豬群中楓涇豬的近交程度最低，梅山豬的近交程度最高。與 F?? ROH 1.0～5.0 Mb 、 F?? ROH 5.1～10.0 Mb 相比，3個(gè)豬群的 F?? ROH >10.0 Mb 與 F?? ROH total 最接近，與4種近交系數(shù)間的相關(guān)性分析結(jié)果一致， F?? ROH >10.0 Mb 和 F?? ROH total 間的相關(guān)系數(shù)最高。Zhong等? [5] 利用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序數(shù)據(jù)計(jì)算了金華豬的 F?? ROH 1.0～5.0 Mb 、 F?? ROH 5.1～10.0 Mb 、 F?? ROH >10.0 Mb 和 F?? ROH all ，結(jié)果表明， F?? ROH >10.0 Mb 和 F?? ROH all 間的相關(guān)系數(shù)最高，與本研究結(jié)果一致。

本研究通過(guò)將富集到生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路的基因與豬QTL數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，鑒定到9個(gè)楓涇豬候選功能基因和8個(gè)梅山豬候選功能基因，其中 LIF 基因是共同的候選功能基因， ?HNF1A? 基因是豬肉質(zhì)和胴體性狀的候選基因? [8] ， ?CDH17? 基因影響公豬睪丸中雄烯酮水平? [9] ， LIF 基因影響豬的產(chǎn)活仔數(shù)和21日齡仔豬數(shù)? [10] ， ?DECR1? 基因與杜洛克豬脂質(zhì)組成性狀顯著相關(guān)? [11] ， ?ARL15? 基因是豬的眼肌面積的候選基因? [12] ， ?ACTN2? 基因與豬肉的烹飪損失有關(guān)? [13] ， ?FABP5? 和? FABP4? 基因與豬的脂肪性狀相關(guān)? [14-15] ， ?EWSR1? 基因影響豬肉肉色? [13] ， ?CTSH? 基因與飼料增質(zhì)量比相關(guān)? [16] ， ?MSTN? 基因與豬日增質(zhì)量和體質(zhì)量等性狀顯著相關(guān)? [17] ， ?GC? 基因與皮特蘭豬的pH? 24 h 相關(guān)? [18] ， ?VEGFA? 基因影響豬后腿步態(tài)評(píng)分? [19] ， ?ZDHHC2? 基因是魯萊黑豬肌內(nèi)脂肪含量的候選基因? [20] ， ?MTMR7? 基因與豬血液中平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量有關(guān)? [21] ， ?CDC5L? 基因與豬血細(xì)胞比容和血紅蛋白相關(guān)? [22] 。本研究鑒定到的候選功能基因與豬的生長(zhǎng)發(fā)育、胴體性狀、肉質(zhì)性狀和繁殖性狀相關(guān)，下一步試驗(yàn)將利用候選基因法研究候選功能基因與相關(guān)性狀的關(guān)系，從而為解析豬生長(zhǎng)發(fā)育、胴體性狀、肉質(zhì)性狀和繁殖性狀的分子機(jī)制提供參考。

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（責(zé)任編輯：徐 艷）