劉艷芳，劉志文，孫玉合，楊愛國，李鳳霞

摘? 要：為了鑒定項(xiàng)目組發(fā)現(xiàn)的K326雄性不育自然突變株SK01與生產(chǎn)應(yīng)用的不育胞質(zhì)sua-CMS的異同，分析其在煙草育種和生產(chǎn)中的應(yīng)用潛力，本研究以tab1-CMS不育系SK01和其同核異質(zhì)系K326為母本，分別與4個烤煙品種雜交構(gòu)建2組F1代雜交種，在兩個地點(diǎn)和人工氣候室中比較8個F1代以及SK01和K326之間的主要農(nóng)藝性狀和抗病性差異，開展了tab1-CMS特異的DNA標(biāo)記篩選。結(jié)果表明，SK01細(xì)胞質(zhì)增強(qiáng)煙草雜交種F1代對CMV、黑脛病的抗性，對株高、莖圍等農(nóng)藝性狀以及PVY、TMV抗性無顯著的細(xì)胞質(zhì)效應(yīng);葉綠體基因組trnC-trnD基因區(qū)間，擴(kuò)增到可有效區(qū)分煙草不育胞質(zhì)類型的1個588 bp的特異性片段。本研究發(fā)現(xiàn)的不育胞質(zhì)tab1-CMS與生產(chǎn)應(yīng)用的sua-CMS類型不育系有明顯差異，對農(nóng)藝性狀和抗病性無明顯的不利影響，是一種有一定應(yīng)用潛力的不育細(xì)胞質(zhì)新突變類型。

關(guān)鍵詞：煙草;細(xì)胞質(zhì)雄性不育;農(nóng)藝性狀;抗病性;特征標(biāo)記

Cytoplasmic Effects and Specific Molecular Markers of Tobacco Cytoplasmic Male Sterile Line SK01

LIU Yanfang1，2， LIU Zhiwen3， SUN Yuhe1， YANG Aiguo1， LI Fengxia1*

（1. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China; 2. Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China; 3. East China Normal University， Shanghai 201100， China）

Abstract： Cytoplasmic male sterile line （CMS line） is an effective genetic tool for tobacco hybrid breeding. At present， there is a single type of CMS used in tobacco hybrid breeding in China. In order to identify the similarities and differences between the male sterile natural mutant SK01 and the sterile cytoplasm used in production， and to analyze its application potential in tobacco breeding and production， tab1-CMS sterile line SK01 and its homokaryon heterogeneous line K326 were used as the female parents in crossing with four flue-cured tobacco varieties to construct two sets of F1 hybrids. Eight F1 lines， SK01 and K326 were compared in two locations in the field or in artificial climate rooms. The main agronomic traits and disease resistance differences between tab1-CMS-specific DNA marker screening were carried out. The results showed that the SK01 cytoplasm enhanced the resistance of tobacco hybrid F1 to CMV and black shank， and had no significant cytoplasmic effect on resistance to PVY and TMV， plant height， stem circumference or other agronomic traits. A 588 bp specific fragment was amplified from the trnC-trnD gene interval of the chloroplast genome， to that can effectively distinguish the sterile cytoplasm of tobacco. It shows that the sterile cytoplasmic tab1-CMS identified in this study is significantly different from the sua-CMS type sterile line used in production and has no obvious adverse effects on agronomic traits and disease resistance. It is a new type of cytoplasmicsterility with certain application potential.

Keywords： tobacco; cytoplasmic male sterility; agronomic traits; disease resistance; characteristic markers

細(xì)胞質(zhì)雄性不育（cytoplasmic male sterility， CMS）是植物因雄蕊退化、花粉敗育或功能不育等原因造成的雄蕊不能正常授粉而雌蕊功能正常的一種母性遺傳性狀。雜種優(yōu)勢是作物提高單產(chǎn)、改進(jìn)品質(zhì)、增強(qiáng)抗逆的重要途經(jīng)[1]。利用雄性不育系生產(chǎn)雜交種可降低種子生產(chǎn)成本并保證種子的純度，水稻、十字花科蔬菜等多種植物的雜交種在生產(chǎn)中具有重要地位。煙草（Nicotiana tabacum）雜種優(yōu)勢明顯，雜種F1代在生長勢、生長量、抗逆性以及品質(zhì)等方面都比雙親平均值有明顯提高[2]。雜交種逐漸成為煙草品種培育的趨勢。目前煙草不育系和雜交種的種植面積占我國烤煙總面積的70%，但只有胞質(zhì)來源于N. suavelens的sua-CMS類型不育系被廣泛使用。作物長期使用單一不育胞質(zhì)遺傳基礎(chǔ)脆弱，易受病害蟲侵害，在生產(chǎn)上具有很大風(fēng)險(xiǎn)性。上世紀(jì)70年代美國玉米雜交種的不育胞質(zhì)幾乎全部為T-CMS，由于T-CMS易感小斑病菌（Elminthosporium Maydis Shoemaker），造成了全美范圍內(nèi)玉米的嚴(yán)重減產(chǎn)，T胞質(zhì)被停用[3]。因此，急需開展煙草不育胞質(zhì)創(chuàng)制、鑒定和評價等研究，打破煙草雜交育種中長期、大面積使用單一不育胞質(zhì)的局面。

由于核質(zhì)互作的影響，不育細(xì)胞質(zhì)對作物多種性狀有顯著的細(xì)胞質(zhì)遺傳效應(yīng)[4]。水稻h2s細(xì)胞質(zhì)對結(jié)實(shí)率、穗重、產(chǎn)量等性狀具有顯著的正效應(yīng)[5-6]，棉花不育細(xì)胞質(zhì)對產(chǎn)量性狀具有明顯負(fù)效應(yīng)[7]。在抗病性方面，據(jù)水稻、小麥、油菜等作物的相關(guān)報(bào)道，不同細(xì)胞質(zhì)對抗病性一般表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)，但多個外源胞質(zhì)在小麥抗病性上表現(xiàn)為正效應(yīng)[8]。煙草不育細(xì)胞質(zhì)對后代的影響研究表明，與對照相比，不育胞質(zhì)來源于N. bigelovii、N. megalosiphon、N. plumbaginifolia的不育系有效葉數(shù)減少;不育胞質(zhì)來源于N. undulata的不育系開花期推遲[2]，sua-CMS細(xì)胞質(zhì)對煙草的農(nóng)藝性狀和品質(zhì)性狀沒有顯著的負(fù)效應(yīng)[9]。

鑒定胞質(zhì)雄性不育系類型的方法有形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子標(biāo)記，其中分子標(biāo)記是鑒定胞質(zhì)雄性不育類型的主要方法[10-13]，包括線粒體特異基因[14-16]、線粒體/葉綠體簡單序列重復(fù)（simple sequence repeat， SSR）[17-19]、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNP）[20-22]等。葉綠體是與CMS有關(guān)的一個細(xì)胞器，在葉綠體基因組的基因間區(qū)和內(nèi)含子區(qū)有大量的SNP、InDel、易位、重復(fù)、點(diǎn)突變以及基因組結(jié)構(gòu)變異，具有比核基因組更高的核苷酸替代率[23]，可用于區(qū)分細(xì)胞質(zhì)雄性不育系[24-25]。葉綠體trnC-trnD約為3000 bp，包括trnC、petN、psbM、trnD 4個基因。該區(qū)域在多個物種中具有豐富的多態(tài)性，研究人員利用trnC-trnD序列構(gòu)建了人參[26]、山礬屬[27]等物種的系統(tǒng)發(fā)育樹[28]。

SK01（tab1-CMS）是2010年7月在K326的試驗(yàn)田中發(fā)現(xiàn)的一株雄性不育自然突變體，表現(xiàn)為完全敗育。2011—2016年間在青島和西昌兩地連續(xù)8代對SK01進(jìn)行K326回交，回交后代均表現(xiàn)雄性不育，且為細(xì)胞質(zhì)雄性不育。

本研究以SK01（tab1-CMS）及其同核異質(zhì)系K326為母本、4個烤煙品種為父本配制8個雜交組

合，由此產(chǎn)生5組成對的細(xì)胞核基因組相同而細(xì)胞質(zhì)不同的雜交種，以此評價SK01不育細(xì)胞質(zhì)在煙草主要農(nóng)藝性狀和抗病性等方面的胞質(zhì)效應(yīng);通過比較tab1-CMS不育系、sua-CMS不育系及其可育對照的葉綠體trnC-trnD多態(tài)性，鑒定tab1-CMS的特定分子標(biāo)記。這將為豐富煙草不育胞質(zhì)源及煙草優(yōu)異不育胞質(zhì)在育種和生產(chǎn)上使用奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? ?試驗(yàn)材料

1.1.1? 植物材料? SK01（K326的同核異質(zhì)系，tab1-CMS），可育對照K326，以及以SK01（S）和K326（F）為母本，以中煙100（M1），NC82（M2），紅花大金元（M3）和Speight G-28（M4）為父本分別雜交的F1代。tab1-CMS組包括S以及S與M1-M4的4種雜交組合;對照組包括F以及F與M1-M4的雜交組合。

1.1.2? 供試毒株及菌種? 煙草花葉病毒（TMV）、黃瓜花葉病毒（CMV）、馬鈴薯Y病毒（PVY）、黑脛病菌種，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所育種研究中心保存。

1.2? 試驗(yàn)方法

1.2.1? 農(nóng)藝性狀調(diào)查? 在山東省諸城市（北緯35°95'，東經(jīng)119°19'，海拔65 m）和四川省西昌市（北緯27°84′，東經(jīng)102°37′，海拔2100 m）兩個不同的煙草生態(tài)區(qū)分別種植SK01，K326和8個F1代雜交組合，采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置2次重復(fù)，每個重復(fù)50株，在50%植株中心開放時，每個重復(fù)選取長勢相對均一的10個單株，按照煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 142—2010測定株高、有效葉數(shù)、節(jié)距、莖圍、最大葉葉長和最大葉葉寬[29]。

1.2.2? 抗病性調(diào)查? 抗性鑒定在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所人工氣候室進(jìn)行，溫度為25 ℃，濕度為60%，每個材料設(shè)2次重復(fù)，每個重復(fù)25株。

TMV、CMV、PVY的抗性鑒定：將新鮮繁毒葉片研磨、過濾，濾液經(jīng)純凈水5倍比例稀釋，待煙苗長至5～6片真葉時進(jìn)行人工摩擦接種。接種30～35 d后，參照我國煙草病蟲害分級及調(diào)查方法B/T23222—2008進(jìn)行抗病性調(diào)查。病情等級劃分為0、1、3、5、7、9六個等級。

黑脛病抗性鑒定：采用莖基部菌谷接種的方法，待煙苗長到4～5葉期時，在每株煙苗的莖基部用小刀輕輕劃一條大小相同的傷口，然后在根部接種3～5 g菌谷，立即覆土并灌水保濕。接種3周后調(diào)查每株發(fā)病情況，病害分級按國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T39—1996規(guī)定執(zhí)行，病情等級劃分為0、1、3、5、7、9六個等級。

1.2.3? 數(shù)據(jù)處理? （1）農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)處理：使用SAS PROC GLM（版本9.3;SAS Institute Inc.）中的III型平方和固定模型和ANOVA進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。如果細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、環(huán)境之間相互作用顯著，則采用固定效應(yīng)的最小二乘法（LS-均值）分析環(huán)境和細(xì)胞核的細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)。細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)、細(xì)胞質(zhì)與核及環(huán)境相互作用的多重比較采用Duncan多極差檢驗(yàn)。tab1-CMS細(xì)胞質(zhì)對農(nóng)藝性狀的影響估計(jì)計(jì)算如下：[S/M（M1-M4）]F1-[異核同質(zhì)系F/M（M1-M4）]F1[30]。

（2）抗病性數(shù)據(jù)處理：使用SAS 9.3軟件的協(xié)因素方差分析，對SK01，K326和8個F1代雜交組合進(jìn)行病情指數(shù)分析（LSD分析p<0.05為有顯著差異）。

1.2.4? 特征標(biāo)記擴(kuò)增? 選用sua-CMS，tab1-CMS兩種不育類型的不育系以及可育煙草共8個材料（表1），用試劑盒提取葉片總DNA（TIANGEN Biotech，中國）。根據(jù)煙草葉綠體基因組序列（GenBank No：Z00044），設(shè)計(jì)兩對特異性引物（S1：5'-GAGTGGTAAGGCAGAGGAC-3'和5'-AAATCA ATGAAGGAAAAGC-3';S2：5'-TATCGCTTTTCC TTCATTG-3'和5'-ATTTTC TGCTAGATCCCGT-3'）擴(kuò)增葉綠體trnC-trnD基因間區(qū)域。PCR程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min，PCR擴(kuò)增30個循環(huán)，每循環(huán)94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，最后72 ℃延伸7 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物。

使用PCR純化試劑盒（TIANGEN Biotech，中國）回收DNA片段，并將其連接到pMD18-T載體（TAKARA，日本）中。每個片段挑選5個陽性克隆進(jìn)行測序，測序結(jié)果一致。根據(jù)sua-CMS、tab1-CMS和可育煙草中1738位點(diǎn)和2321位點(diǎn)的序列特征，用Primer 5設(shè)計(jì)特異引物S3：5'-AGGGGGCAGCAACTACAAT-3'和5'-CGGAAA AAATGATAAATAAAT-3'以擴(kuò)增tab1-CMS的特異性標(biāo)記。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，PCR擴(kuò)增30個循環(huán)，每循環(huán)94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸7 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物。

2? 結(jié)? 果

2.1? tab1-CMS胞質(zhì)對煙草農(nóng)藝性狀的影響

在諸城、西昌兩個煙草生態(tài)區(qū)種植SK01（tab1-CMS）和可育對照K326，以及8對雜交組合，中心花開放期對其株高、節(jié)距、有效葉數(shù)、莖圍、最大葉葉長、最大葉葉寬等農(nóng)藝性狀進(jìn)行調(diào)查（表2）。

方差分析（表3）發(fā)現(xiàn)，tab1-CMS細(xì)胞質(zhì)對所調(diào)查的農(nóng)藝性狀除節(jié)距外無顯著影響，環(huán)境是影響農(nóng)藝性狀的最重要因素，而核基因組對節(jié)距、有效葉數(shù)、莖圍和最大葉葉長等農(nóng)藝性狀有顯著影響，對株高、最大葉葉寬無顯著影響。細(xì)胞質(zhì)與環(huán)境互作對節(jié)距有顯著影響，細(xì)胞質(zhì)-細(xì)胞核組互作、細(xì)胞質(zhì)-細(xì)胞核-環(huán)境三因素互作均對節(jié)距、有效葉數(shù)、葉長等性狀有顯著影響。

2.2? tab1-CMS對產(chǎn)量性狀的胞質(zhì)效應(yīng)

對每一對具有相同父本的兩個雜交組合（例如S/M1-F/M1，S/M2-F/M2，S/M3-F/M3，S/M4-F/M4）以及S-F進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可以估算tab1-CMS對煙草產(chǎn)量相關(guān)性狀的細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明（表4），在兩個煙草生態(tài)區(qū)，tab1-CMS的胞質(zhì)效應(yīng)不一致。在西昌生態(tài)區(qū)，tab1-CMS細(xì)胞質(zhì)對產(chǎn)量相關(guān)性狀均無顯著的細(xì)胞質(zhì)效應(yīng);在諸城生態(tài)區(qū)，tab1-CMS細(xì)胞質(zhì)對大多數(shù)雜交組合的產(chǎn)量相關(guān)性狀均表現(xiàn)出細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)，正效應(yīng)和負(fù)效應(yīng)的個數(shù)相同。對于有效葉數(shù)，tab1-CMS胞質(zhì)在S/M1-F/M1、S/M2-F/M2、S/M4-F/M4三個組合上表現(xiàn)為正胞質(zhì)效應(yīng)，在組合S-F中表現(xiàn)為有負(fù)胞質(zhì)效應(yīng)，在S/M3-F/M3中表現(xiàn)為無顯著胞質(zhì)效應(yīng)。對于最大葉葉長，tab1-CMS細(xì)胞質(zhì)在S/M1-F/M1、S/M2-F/M2兩個組合中表現(xiàn)為負(fù)胞質(zhì)效應(yīng)，在組合S-F中表現(xiàn)為有正效應(yīng)，在其他兩個組合S/M3-F/M3、S/M4-F/M4中無顯著細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)。對于最大葉寬，tab1-CMS細(xì)胞質(zhì)在S/M1-F/M1、S/M3-F/M3兩個組合中表現(xiàn)為有負(fù)效應(yīng)，在組合S-F中表現(xiàn)為正效應(yīng)，在S/M2-F/M2、S/M4-F/M4中則無顯著細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)。表明tab1-CMS的細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)與其互作的核基因組有關(guān)。

2.3? tab1-CMS胞質(zhì)對煙草抗病性的影響

抗病性是胞質(zhì)評價的重要內(nèi)容，對SK01和K326以及它們分別與M1、M2、M3、M4四個煙草品種的各雜交F1代的病情指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（表5），結(jié)果顯示，tab1-CMS細(xì)胞質(zhì)對黑脛病抗性有顯著影響（p=0.0369），對CMV抗性有極顯著影響（p<0.0001），對TMV、PVY抗性無顯著影響。細(xì)胞質(zhì)-細(xì)胞核互作對黑脛病、CMV有顯著影響，對TMV、PVY則無顯著影響。

比較父本相同、母本細(xì)胞核一致而細(xì)胞質(zhì)不同的兩個F1代雜交種的病情指數(shù)差異（表6），可以看出當(dāng)父本為中煙100（M1）、NC82（M2）時，F(xiàn)1代的黑脛病病情指數(shù)存在顯著差異，細(xì)胞質(zhì)為tab1-CMS的F1代病情指數(shù)顯著低于可育胞質(zhì)，表現(xiàn)出tab1-CMS胞質(zhì)在黑脛病抗性上的正效應(yīng)。在CMV抗性上，父本為中煙100（M1）時，tab1-CMS的F1代病情指數(shù)顯著低于可育胞質(zhì);SK01和K326兩個材料在黑脛病抗性和CMV抗性上均存在顯著差異。在TMV、CMV抗性上，細(xì)胞質(zhì)不同、細(xì)胞核相同的成對雜交組合間病情指數(shù)的差異不顯著。

2.4? tab1-CMS特異的DNA標(biāo)記

設(shè)計(jì)S1、S2兩對引物在sua-CMS（MS中煙100、中煙201、NC55）、tab1-CMS（SK01、YL-1、YL-6）兩種不育胞質(zhì)類型的不育系和可育煙草（中煙100、K326）共8個煙草材料中擴(kuò)增trnC-trnD的完整基因間區(qū)域，擴(kuò)增結(jié)果（表7）顯示每個樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物單一，且同一引物在不同材料間的擴(kuò)增長度一致，其中S1擴(kuò)增長度為1492 bp，S2擴(kuò)增長度為1756 bp。對每個片段的5個克隆測序結(jié)果表明每個PCR片段序列完全一致。而S1和S2的擴(kuò)增區(qū)域在tab1-CMS不育系、sua-CMS不育系與可育煙草間存在25個多態(tài)性位點(diǎn)，含有相同細(xì)胞質(zhì)的煙草材料序列具有100%的相似性（表7）。在可育煙草和tab1-CMS與sua-CMS之間存在16個差異位點(diǎn)，sua-CMS和可育煙草與tab1-CMS之間存在5個差異位點(diǎn)，tab1-CMS和sua-CMS與可育煙草之間存在3個差異位點(diǎn)。在3種細(xì)胞質(zhì)中，trnC-trnD基因間區(qū)域的s1738位點(diǎn)各不相同。在s1738位點(diǎn)，sua-CMS不育系為TTTTATTCCAGG GGGG，tab1-CMS不育系為GGGGGCAA，可育煙草為GGGGGCAGCT TTATAA，而在s2321位點(diǎn)，sua-CMS不育系和可育煙草均為ATCATT，而tab1-CMS不育系該位點(diǎn)缺失。根據(jù)sua-CMS、tab1-CMS和可育煙草中trnC-trnD基因間區(qū)域中s1738和s2321位點(diǎn)的序列特征，設(shè)計(jì)特異性引物S3在tab1-CMS不育系中特異性地?cái)U(kuò)增到一個588 bp的片段，該片段在sua-CMS不育系和可育煙草中未得到擴(kuò)增（圖1）。

3? 討? 論

煙草不育系或雜交種的種植面積占總種植面積的70%以上，但不育胞質(zhì)來源單一，急需擴(kuò)大不育胞質(zhì)來源。本研究對一個新的不育胞質(zhì)tab1-CMS在農(nóng)藝性狀和抗病性上的胞質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評價，結(jié)果顯示tab1-CMS細(xì)胞質(zhì)對農(nóng)藝性狀無顯著影響，對黑脛病、CMV抗性具有正效應(yīng)，對TMV、PVY無顯著影響，表明tab1-CMS表現(xiàn)優(yōu)異，有望用于煙草雜交育種和不育系轉(zhuǎn)育。

農(nóng)藝性狀是品種選育的基礎(chǔ)。在本研究中，一年兩點(diǎn)的試驗(yàn)結(jié)果表明tab1-CMS細(xì)胞質(zhì)對煙草株高、節(jié)距、莖圍、最大葉葉長、最大葉葉寬，有效葉數(shù)等農(nóng)藝性狀無顯著影響，但在西昌、諸城兩個煙葉生態(tài)區(qū)，不育細(xì)胞質(zhì)對農(nóng)藝性狀的影響各不相同：在西昌，tab1-CMS細(xì)胞質(zhì)對所調(diào)查的6個農(nóng)藝性狀均無顯著的細(xì)胞質(zhì)效應(yīng);在諸城，tab1-CMS細(xì)胞質(zhì)對62.9%（17/27）的性狀有顯著影響，有些表現(xiàn)為正效應(yīng)，有些表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)。以云煙87和G13-5為材料配制正反交組合F1代農(nóng)藝性狀分析顯示，株高、有效葉數(shù)、腰葉長正反交存在顯著差異，而節(jié)距、莖圍、腰葉寬不存在正反交差異[31]，說明細(xì)胞質(zhì)在一定程度上會影響煙草F1代的農(nóng)藝性狀。

環(huán)境是影響農(nóng)藝性狀的重要因素，本研究中的諸城和西昌兩個煙草生態(tài)區(qū)海拔、緯度不同，環(huán)境因素對所調(diào)查的6個農(nóng)藝性狀均有顯著或極顯著影響。其他研究者的研究也表明，環(huán)境因素對不同品種的煙草農(nóng)藝性狀有一定的影響[32]。核基因組（品種）是影響農(nóng)藝性狀的主要因素，在本研究中，核基因組對莖圍和最大葉葉長等部分農(nóng)藝性狀有顯著影響，對株高、最大葉葉寬無顯著影響。黃鵬等[33]對畢納1號等7個煙草品種的農(nóng)藝性狀比較也顯示，在株高等農(nóng)藝性狀上不同品種間的表現(xiàn)不同，暗示品種間的農(nóng)藝性狀差異與品種間的親緣關(guān)系有一定的關(guān)系。細(xì)胞質(zhì)-環(huán)境、細(xì)胞質(zhì)-細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)-細(xì)胞核-環(huán)境之間存在相互作用，互作對節(jié)距等部分性狀有顯著影響?？偟膩碚f，在配置雜交組合和不?育系轉(zhuǎn)育時，需要考慮父本的核背景以及品種的種植區(qū)域等因素。

在本研究中，tab1-CMS細(xì)胞質(zhì)在黑脛病、CMV抗性上表現(xiàn)為正效應(yīng)，在PVY和TMV抗性上與可育胞質(zhì)無顯著差別。煙草其他不育胞質(zhì)在抗病性上也觀察到顯著的胞質(zhì)效應(yīng)，孫玉合等[34]的研究表明，不育胞質(zhì)來源于N. glauca的不育系86-6與其保持系革新一號相比，在黑脛病、赤星病的抗性上好于革新一號，而不育胞質(zhì)來源于N. bigelovii、N. megalosiphon和 N. plumbaginifolia的不育系抗病性減弱[2]。因此，在煙草抗病育種中，除了發(fā)掘優(yōu)異的抗病種質(zhì)外，還需要考慮細(xì)胞質(zhì)對抗病性的影響。

高等植物葉綠體基因組在結(jié)構(gòu)和組成上高度保守，但在葉綠體基因組的非編碼區(qū)（如內(nèi)含子或基因間區(qū)）存在大量的SNP、InDel和基因組結(jié)構(gòu)變異[35-36]，葉綠體中這些快速進(jìn)化的序列片段為快速準(zhǔn)確地識別物種提供了大量的分子標(biāo)記信息[37-38]。本研究中，通過比較tab1-CMS，sua-CMS和可育煙草中trnC-trnD基因間區(qū)域的序列，獲得了25個變異位點(diǎn)。變異頻率為0.7%，顯示了在trnC-trnD的基因間區(qū)域變異豐富。

4? 結(jié)? 論

本研究通過比較tab1-CMS不育系YK01和同核異質(zhì)系K326與4個烤煙品種雜交F1代在農(nóng)藝性狀和抗病性上的差異，認(rèn)為tab1-CMS細(xì)胞質(zhì)對后代的農(nóng)藝性狀和抗病性上沒有顯著的負(fù)效應(yīng)，有的性狀還表現(xiàn)為正效應(yīng)，可作為煙草育種中的優(yōu)異不育胞質(zhì)來源。但是煙草農(nóng)藝性狀和抗病性的影響因素很多且存在著復(fù)雜的相互作用，尚需更多研究明確tab1-CMS細(xì)胞質(zhì)在煙草遺傳改良中的利用規(guī)律，以對其胞質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行更全面的評價。

參考文獻(xiàn)

[1] KUMAR B V， VENUGOPAL M， BARWALE Z U， et al. Heterosis： emerging ideas about hybrid vigour[J]. Journal of Experimental Botany， 2012， 63（18）： 6309-6314.

[2] 佟道儒. 煙草育種學(xué)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1997：279-294.

TONG D R. Tobacco breeding[M]. Beijing： China Agricultural Press， 1997： 279-294.

[3] GRACEN， GROGAN. Diversity and Suitability for Hybrid Production of Different Sources of Cytoplasmic Male Sterility in Maize[J]. Agronomy Journal， 1974， 66（5）： 654-657.

[4] TRAVEN A， WONG J M S， XU D， et al. Interorganellar Communication[J]. Journal of Biological Chemistry， 2001， 276（6）： 4020-4027.

[5] QIN P， WANG Y， LI Y Y， et al. Analysis of cytoplasmic effects and fine-Mapping of a genic male sterile line in rice[J]. Plos One， 2013， 8（4）： e61719.

[6] YAO S， CHEN T， ZHANG Y D， et al. Transferring translucent endosperm mutant gene wx-mq and rice stripe disease resistance gene stv-bi by marker-assisted selection in rice （Oryza sativa）[J]. Rice Science. 2011， 18（2）： 102-109.

[7] 王學(xué)德. 棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育的研究與利用[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，52（8）：1341-1354.

WANG X D. Overview of the study and application of cytoplasmic male sterility in cotton[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2019， 52（8）： 1341-1354.

[8] 黃得潤，沈君輝，劉光杰，等. 作物抗病蟲性的細(xì)胞質(zhì)遺傳效應(yīng)研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2006（9）：333-337.

HUANG D R， SHEN J H， LIU G J， et al. Recent advances in inheritance of cytoplasmic effects on crop resistance to diseases and insect pests[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2006（9）： 333- 337.

[9] 馬文廣，張恒，白永富，等. 烤煙雄性不育系與其同型可育品種性狀比較[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005（5）：38-41.

MA W G， ZHANG H， BAI Y F， et al. Comparison of traits of the mail sterile lines and their maintainer lines of flue-cured tobacco[J]. Journal of Hunan Agricultural University （Natural Sciences）， 2005（5）： 38-41.

[10] KIM S， PLAGNOL V， HU T T， et al. Recombination and linkage disequilibrium in Arabidopsis thaliana[J]. Nature Genetics， 2007， 39（9）： 1151.

[11] YU X L， LIU Y P， LV Y X， et al. Development of molecular markers specific to petaloid-type cytoplasmic male sterility in tuber mustard （Brassica juncea var. tumida Tsen et Lee）[J]. Mol.Biol. Rep， 2014， 41（2）： 769-778.

[12] TAN Y P， XU X， WANG C T， et al. Molecular characterization and application of a novel cytoplasmic male sterility-associated mitochondrial sequence in rice. BMC Genet 16， 45 （2015）. https：//doi.org/10.1186/s12863-015-0205-0.

[13] HENG S， LIU S S， XIA C X， et al. Morphological and genetic characterization of a new cytoplasmic male sterility system （oxa CMS） in stem mustard （Brassica juncea）[J]. Theoretical and applied genetics. Theoretische und angewandte Genetik， 2018， 131（1）： 59-66.

[14] HENNG S P， SHI D Y， HU Z H， et al. Characterization and classification of one new cytoplasmic male sterility （CMS） line based on morphological， cytological and molecular markers in non-heading [J]. Chinese cabbage （Brassica rapa L.）， 2015， 34（9）： 1529-1537.

[15] SHU J， LIU Y， LI Z， et al. Detection of the diversity of cytoplasmic male sterility sources in Broccoli （Brassica Oleracea var. Italica） using mitochondrial markers[J]. Frontiers in Plant Science， 2016， 7： 927-927.

[16] LI N， ZHENG Y Q， DING H M， et al. Development and validation of SSR markers based on transcriptome sequencing of Casuarina equisetifolia[J]. Trees， 2018， 32（1）： 41-49.

[17] 李鳳霞，楊愛國，崔萌萌，等. 四種細(xì)胞質(zhì)來源的煙草不育系線粒體SSR位點(diǎn)差異[J]. 作物學(xué)報(bào)，2011，37（12）：2285-2285.

LI F X， YANG A G， CUI M M， et al. Mitochondrial microsatellite variability of tobacco cms lines with four different cytoplasms[J]. Acta Agronomica Sinica， 2011， 37（12）： 2285-2285.

[18] 孫炳蕊，范芝蘭，李晨，等. 含不同地區(qū)野生稻胞質(zhì)的水稻雄性不育材料線粒體SSR標(biāo)記分析[J]. 分子植物育種，2016，14（9）：2392-2404.

SUN B R， FAN Z L， LI C， et al. The analysis of rice cytoplasmic male sterility lines with different wild rice cytoplasm using the mitochondrial SSR markers[J]. Molecular Plant Breeding， 2016， 14 （9）： 2392-2404.

[19] 袁凱，張婷，史曉芳，等. K、V、T型小麥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系葉綠體DNA的SSR分析及RuBP羧化酶活性比較[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2019，39（3）：97-104.

YUAN K， ZHANG T， SHI X F， et al. Comparison of chloroplast DNA and RuBP carboxylase （rubisco） activity with K， V， T-type cytoplasmic male-sterile wheat lines[J]. Acta Botanica Boreali- Occidentalia Sinica， 2019， 39（3）： 97-104.

[20] 劉光照. 辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系細(xì)胞學(xué)觀察和mtDNA-AFLP分析[D]. 咸陽市：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2010.

LIU G Z. Cytological observation of pepper CMS and mtDNA-AFLP analysis[D]. Xianyang： Northwest A & F University， 2010.

[21] CHRISTOPHER V， AGNIESZKA K， MICHAEL H. Sequencing and annotation of the chloroplast DNAs and identification of polymorphisms distinguishing normal male-fertile and male-sterile cytoplasms of onion[J]. Genome， 2013， 56（12）： 737-742.

[22] LIN H， HONG X， ZHOU P， et al. Combination of microRNA expression profiling with genome-wide SNP genotyping to construct a coronary artery disease-related miRNA-miRNA synergistic network[J]. Bioscience trends， 2014， 8（6）： 297-307.

[23] DANIELL H， LIN C S， YU M， et al. Chloroplast genomes： diversity， evolution， and applications in genetic engineering[J]. Genome Biology， 2016， 17（1）： 1-29.

[24] LIN D， GONG X， JIANG Q， et al. The rice ALS3 encoding a novel pentatricopeptide repeat protein is required for chloroplast development and seedling growth[J]. Rice， 2015， 8（1）： 17.

[25] KOHN C V， KIELKOWSKA A， HAVEY M J. Sequencing and annotation of the chloroplast DNAs and identification of polymorphisms distinguishing normal male-fertile and male-sterile cytoplasms of onion[J]. Genome 2013， 56： 737-742.

[26] LEE C， WEN J. Phylogeny of Panax using chloroplast trnC-trnD intergenic region and the utility of trnC-trnD in interspecific studies of plants[J]. Molecular Phylogenetics & Evolution， 2004， 31（3）： 894-903.

[27] FRITSCH， PETER W， CRUZ， et al. Phylogeny of Symplocos Based on DNA Sequences of the Chloroplast trnC-trnD Intergenic Region[J]. Systematic Botany， 2006. 31（1）： 181-192.

[28] TALEBI， MAJID， AKBARI， et al. Molecular polymorphism in Pistacia vera L. using non-coding regions of chloroplast DNA[J]. Genetic Engineering and Biotechnology Journal， 2016， 14（1）： 31-37.

[29] 國家煙草專賣局. 煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查方法：YC/T 142—2010[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003：227-231.

State Tobacco Monopoly Administration. Investigation method of tobacco agronomic traits： YC/T 142—2010[S]. Beijing： China Standards Press， 2003： 227-231.

[30] 張維軍，袁漢民，王小亮，等. 寧夏春小麥抗旱性的遺傳多樣性分析[J]. 干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2017，9（6）：95-103.

ZHANG W J， YUAN H M， WANG X L， et al. Genetic diversity of spring wheat germplasm resources based on drought resistance in Ningxia[J]. Agricultural Research in the Arid Areas， 2017，9（6）：95-103.

[31] QIN P， WANG Y， LI Y， et al. Analysis of cytoplasmic effects and fine-mapping of a genic male sterile line in rice[J]. PLoS One， 2013， 8： e61719.

[32] 宋鵬飛，陳興位，馬迅，等. 緯度和海拔二維因素對云南烤煙農(nóng)藝性狀的影響[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，30（10）：2345-2351.

SONG P F， CHEN X W， MA X， et al. Effects of latitude and altitude on agronomic traits of flue-cured tobacco in Yunnan[J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences， 2017， 30（10）： 2345-2351.

[33] 黃鵬，徐慶國. 不同烤煙品種農(nóng)藝性狀與經(jīng)濟(jì)性狀的差異研究[J]. 作物研究，2016，2（2）：126-130.

HUANG P， XU Q G. The Differences of agronomic and economic characters in different flue-cured tobacco cultivars[J]. Crop Research， 2016， 2（2）： 126-130.

[34] 孫玉合，丁昌敏，張歷歷，等. 煙草新胞質(zhì)雄性不育系86-6的創(chuàng)造及其利用[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，1999（1）：3-5.

SUN Y H， DING C M， ZHANG L L， et al. Creation and utilization of new cytoplasmic male sterile line 86-6 in tobacco[J]. Acta Tabacaria Sinica， 1999（1）： 3-5.

[35] NIELL H， LIN C S， YU M， et al. Chloroplast genomes： diversity， evolution， and applications in genetic engineering[J]. Genome Biology， 2016， 17（1）： 1-29.

[36] BAO H， XIONG Y， GUO H， et al. MapNext： a software tool for spliced and unspliced alignments and SNP detection of short sequence reads[J]. BMC Genomics， 2009， 10（16）： 1851-1858.

[37] JANSEN RK， CAI Z， RAUBESON LA， et al. Analysis of 81 genes from 64 plastid genomes resolves relationships in angiosperms and identifies genome-scale evolutionary patterns[J]. Proc Natl Acad Sci， 2007， 104： 19369-19374.

[38] HAN Y W， DUAN D， MA X F， et al. Efficient identification of the forest tree species in Aceraceae using DNA barcodes[J]. Front Plant Sci， 2016， 7： 1707.