王堯，董帥，張民，李振華

摘? 要：為了解煙草種子光休眠與后熟的分子機理，本研究以野生型（WT）、NtPHYB1過表達（NtPHYB1-OE）和NtPHYB1 RNA干擾（NtPHYB1-RNAi）3種煙草種子為材料，在恒溫和變溫2種環(huán)境下進行后熟。結(jié)果表明，與WT新采收種子相比，NtPHYB1-RNAi新采收種子光休眠顯著加深，而NtPHYB1-OE新采收種子光休眠未顯著變淺。與恒溫后熟相比，變溫下WT和NTPHYB1-OE種子后熟加快，而NTPHYB1-RNAi種子變化不顯著。與WT新采收種子相比，NtPHYB1-RNAi新采收種子中NtABI3的表達量顯著提高，NtPHYB1-OE新采收種子中NtABI5的表達量顯著降低。在變溫下后熟，WT種子中NtNCED6和NtGA2ox2下降變緩，NtCYP707A1和 NtGA3ox2上升變緩;NtPHYB1-RNAi種子中NtNCED6下降變緩，而NtCYP707A1上升變緩;NtPHYB1-OE種子中NtNCED6下降變緩，而NtCYP707A1、NtGA3ox2、NtGA2ox2和NtGAI下降均加快。綜上所述，NtPHYB1能夠協(xié)同儲藏溫度影響ABA和GA的信號和代謝基因表達從而調(diào)控種子光休眠和后熟。

關(guān)鍵詞：光休眠;后熟;NtPHYB1;變溫;種子萌發(fā);植物激素

NtPHYB1 Interacts with Storage Temperature to Regulate Seed Photodormancy and After-ripening in Nicotiana tabacum L.

WANG Yao， DONG Shuai， ZHANG Min， LI Zhenhua*

（College of Agronomy， Guizhou University， Guiyang 550025， China）

Abstract： To reveal the molecular mechanism of seed photodormancy and after-ripening in tobacco， wild-type （WT）， NtPHYB1 over expression （NtPHYB1-OE） and deficient （NtPHYB1-RNAi） tobacco seeds were used in this study， in conducting after-ripening experiments in two environments with constant or natural temperature. The results showed that NtPHYB1-RNAi fresh seeds had a significant increase in photodormant level compared with WT fresh seeds; However， the photodormancy of NtPHYB1-OE fresh seeds did not show significant change. The after-ripening of WT and NtPHYB1-OE seeds was accelerated under variable temperature compared with under constant temperature storage， while that of NtPHYB1-RNAi seeds was not significantly changed. Compared with WT fresh seeds， the expression of NtABI3 in NtPHYB1-RNAi fresh seeds was significantly increased， while the expression of NtABI5 in NtPHYB1-OE fresh seeds was significantly decreased. In WT seeds， expression of NtNCED6 and NtGA2ox2 decreased slowly when after-ripening under variable temperature， while NtCYP707A1 and NtGA3ox2 were up-regulated slowly. In NtPHYB1-RNAi seeds， NtNCED6 expression decreased slowly then， while NtCYP707A1 expression increased slowly. In NtPHYB1-OE seeds， NtNCED6 expression decreased slowly then， while expression of NtCYP707A1， NtGA3ox2， NtGA2ox2 and NtGAI decreased faster. In conclusion， NtPHYB1 interacts with storage temperature to regulate photodormancy and after-ripening by regulating expressions of genes involved in ABA and GA signal and metabolism in tobacco seeds.

Keywords： photodormancy; after-ripening; NtPHYB1; variable temperature; seed germination; phytochrome

種子光休眠（photodormancy）是指具有生活力的種子在黑暗環(huán)境下暫時不能萌發(fā)的現(xiàn)象。至今，已經(jīng)在上千物種中發(fā)現(xiàn)種子光休眠，特別是小粒種子物種，種子光休眠較為普遍。在生產(chǎn)上，丸化有利于小粒種子播種，但丸化后，喜光性（photophil）種子易出現(xiàn)光休眠，嚴重影響出苗率。因此，研究種子光休眠和后熟的調(diào)控機制，對于指導光敏感種子制種和播種均具有重要意義。

光照和后熟均具有解除種子休眠和促進萌發(fā)

的作用。目前關(guān)于光解除種子休眠和促進萌發(fā)的分子機制研究較為深入，它通過激發(fā)光敏色素（Phytochrome，PHY）信號通路解除種子休眠和促進萌發(fā)[1-2]。早在1934年，F(xiàn)LINT[3]在萵苣中發(fā)現(xiàn)光調(diào)控種子休眠和萌發(fā)現(xiàn)象。1952年，BORTHWICK等[4]發(fā)現(xiàn)萵苣種子萌發(fā)受紅光和遠紅光可逆轉(zhuǎn)換調(diào)控并發(fā)現(xiàn)PHY。90年代末，在萵苣種子中發(fā)現(xiàn)PHY調(diào)節(jié)赤霉素（GA）的合成[5]和脫落酸（Abscisic acid，ABA）的分解[6]，從而促進喜光性種子萌發(fā)[7-8]。2012年，LEE等[9]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了PHYB和PHYA時空特異性調(diào)控ABA和GA代謝基因（GA3ox1，GA2ox2，NCED6，NCED9，GA3ox2CYP707A2）與信號基因（ABI3，ABI5，RGA）表達控制種子萌發(fā)?？臻g上PHYA和PHYB分別定位于胚和胚乳中，時間上胚的作用晚于胚乳[10]。2016年，JIANG等[11]發(fā)現(xiàn)在擬南芥中PHYB不僅參與調(diào)控紅光/遠紅光可逆轉(zhuǎn)換的種子萌發(fā)，而且調(diào)控種子初生休眠。2019年，MERAI等[12]發(fā)現(xiàn)光促進需光性種子萌發(fā)和抑制厭光性種子萌發(fā)均需要PHY的參與;而且激素ABA和GA調(diào)控需光性種子、光中性種子和抑制厭光性種子萌發(fā)是保守的，均表現(xiàn)為ABA抑制而GA促進萌發(fā)。

新采收的煙草種子普遍存在光休眠，在黑暗條件下，即使延長培育時間，種子亦不能萌發(fā)。LEUBNER-METZGER等[13]發(fā)現(xiàn)后熟（After-ripening）有利于打破煙草種子光休眠，在自然條件下干燥儲藏6個月后，煙草種子將完成后熟，具備在黑暗下萌發(fā)的能力。適宜的含水量（7%～10%）加速煙草種子后熟，而含水量過高（>15%）或者過低（<7%）減緩種子后熟。宋碧清等[14]發(fā)現(xiàn)較高溫度下（25 ℃）下煙草種子后熟時間較低溫下（18℃）明顯縮短。然而，關(guān)于后熟解除種子光休眠的分子機理知之甚少。因此，本研究以野生型（WT）、NtPHYB1過表達（NtPHYB1-OE）和NtPHYB1 RNAi種子為材料，在變溫和恒溫2種環(huán)境下進行儲藏，研究新采收和后熟種子萌發(fā)差異;在此基礎(chǔ)上，研究后熟過程種子對ABA和GA的敏感性變化及ABA和GA代謝和信號基因表達變化。研究結(jié)果將有助于深入理解后熟解除種子光休眠和促進萌發(fā)的分子機理。

1? 材料與方法

1.1? 供試材料

煙草品種K326的WT、NtPHYB1-OE和NtPHYB1-RNAi種子由貴州省煙草科學研究院提供。NtPHYB1基因克隆、遺傳轉(zhuǎn)化和進化分析詳見課題組已公開發(fā)表的論文[15]。

1.2? 試驗設(shè)計

以K326的WT、NtPHYB1-OE和NtPHYB1- RNAi T3代種子為供試材料，分析基因型和后熟處理（包括后熟溫度和后熟時間）對種子光休眠的影響（表1）。5種處理分別為新采收種子（FS），在變溫條件下（日均溫15 ℃，日較差6 ℃）后熟1（NT1）和2個月（NT2）的種子，和在恒溫（25 ℃）條件下后熟1（CT1）和2個月（CT2）的種子，基因型×后熟共計15個處理。

1.3? 試驗方法

1.3.1? 種子萌發(fā)試驗? 采用本課題組已經(jīng)公開發(fā)表的方法[16]。將經(jīng)0.5% CuSO4消毒后的100粒種子均勻點播在0.8%的瓊脂發(fā)芽床表面，將培養(yǎng)皿置于25 ℃全天黑暗的人工氣候箱內(nèi)萌發(fā)。重復(fù)3次。從第2天開始每隔24 h記錄一次種子萌發(fā)數(shù)（以種子露白計為萌發(fā)），連續(xù)記錄至第7天為止。計算萌發(fā)勢（第4天）、萌發(fā)率（第7天）和萌發(fā)指數(shù)。

1.3.2? 激素敏感性試驗? 稱取一定量的GA3、ABA、PAC（多效唑，GA3合成抑制劑）、FLU（氟啶酮，ABA合成抑制劑）粉末用少量無水乙醇溶解后，分別加入蒸餾水配制成10-6、10-5、10-4、10-3 mol/L的GA3溶液;10-7、10-6、10-5、10-4 mol/L的ABA溶液;5×10-6、5×10-5 mol/L的PAC溶液;5×10-6、5×10-5 mol/L的FLU溶液。在培養(yǎng)皿內(nèi)分別加入1 mL上述濃度的溶液，然后加入0.8%瓊脂滅菌液，制作發(fā)芽床。然后用1.3.1的方法測定種子在不同發(fā)芽床上的發(fā)芽能力。

1.3.3? ABA和GA代謝和信號基因表達測定? RT-PCR采用實驗室已經(jīng)公開發(fā)表的方法[16]。分別取0.1 g不同基因型FS、NT1、CT1、NT2、CT2、的煙草種子裝入1.5 mL的離心管，迅速放入液氮中冷凍3 min，再放入?80 ℃超低溫冰箱備用。采用TIANGEN RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，中國）提取煙草種子RNA。采用TaKaRaPrimeScript? II 1st Strand

cDNA Synthesis 試劑盒（寶生物工程有限公司，中國）進行RNA反轉(zhuǎn)錄。采用TaKaRaTB Green? Premix Ex Taq?（TliRNaseH Plus）熒光定量試劑盒進行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為：10 ?L TBGreen Premix Ex TaqII（2X），0.4 ?L ROX Reference Dye（50X），2 ?L稀釋為40 ng/?L的cDNA，上下游引物各0.8 ?L（表2），用水補足至20 ?L。PCR反應(yīng)的條件為：95 ℃預(yù)變性0.5 min，然后95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s進行40個循環(huán)。采用StepOnePlusReal-Time PCR儀（應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，美國）進行基因的擴增。依據(jù)2-△△Ct法計算相對表達水平[17]。目標基因及其引物見表2。

1.3.4? 統(tǒng)計分析? 用Excel軟件進行數(shù)據(jù)整理。運用SPSS Statistics 25對數(shù)據(jù)進行多重（圖基HSDa）比較;采用GLM模型（General Linear Model， GLM）中的全因子模型及Ⅲ型平方和評價基因型、后熟溫度、后熟期及其互作對種子萌發(fā)的影響。最后采用Origin 8.5作圖。

2? 結(jié)? 果

2.1? NtPHYB1和溫度對種子后熟的影響

煙草種子萌發(fā)情況見表3。3種基因型新采收種子萌發(fā)勢、萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)均存在一定差異：NtPHYB1-RNAi種子萌發(fā)勢、萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)均顯著低于WT種子;NTPHYB1-OE種子萌發(fā)勢和萌發(fā)指數(shù)與WT種子無顯著差異，但萌發(fā)率顯著低于WT種子?？梢奛tPHYB1-RNAi種子光休眠水平加深，而NtPHYB1-OE種子光休眠未顯著變淺。方差分析結(jié)果（表4）也表明，基因型顯著影響了種子光休眠與后熟。

與新采收種子相比，3種基因型種子恒溫或變溫后熟1月或2月，其種子萌發(fā)勢、萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)均顯著提高;且后熟2月的種子萌發(fā)勢和萌發(fā)指數(shù)均高于或顯著高于后熟1個月的處理，而萌發(fā)率沒有顯著差異。后熟1月時，經(jīng)恒溫后熟處理的WT和NTPHYB1-OE種子的萌發(fā)勢顯著低于變溫后熟處理;后熟2月時，恒溫后熟處理的WT種子的萌發(fā)勢依然顯著低于變溫后熟處理。

由方差分析結(jié)果（表4）可知，后熟時間和后熟溫度均顯著影響種子萌發(fā)，后熟時間延長更有利于打破種子光休眠，變溫儲藏種子后熟普遍快于常溫儲藏?；蛐?、后熟溫度和后熟時間之間存在不同程度的互作，影響種子萌發(fā)勢、萌發(fā)率和萌發(fā)指數(shù)。

2.2? 煙草種子后熟過程中GA和ABA敏感性變化

由圖1可知，WT、NtPHYB1-OE和NtPHYB1-RNAi等3種基因型新采收種子萌發(fā)率均較低，10-6～10-3 mol/L的GA3可促進種子萌發(fā)。變溫或恒溫后熟處理1或2月，種子萌發(fā)率均顯著提高，幾乎達到最大值，GA3的促進作用不再明顯。

由圖2-3可知，PAC和ABA具有抑制新采收煙草種子萌發(fā)的作用，且隨著濃度增加，二者對種子萌發(fā)的抑制作用顯著增強。后熟1個月，煙草種子萌發(fā)率顯著提高，二者對種子萌發(fā)的抑制作用依然較強且隨濃度增加而增強;后熟2個月，抑制作用明顯減弱，但高濃度處理仍有較強抑制作用。3種基因型種子和2種后熟溫度處理基本表現(xiàn)為相似規(guī)律。

由圖4可知，5×10-5 mol/L FLU具有抑制WT和NtPHYB1-OE新采收種子萌發(fā)的作用，而對

NtPHYB1-RNAi種子的抑制作用不顯著。隨著后熟期延長，F(xiàn)LU對種子萌發(fā)的抑制作用在逐漸減弱。3種基因型種子和2種后熟溫度處理基本表現(xiàn)為相似規(guī)律。

上述結(jié)果說明不同基因型種子后熟過程中對ABA和GA敏感性變化是相似的，新采收種子對GA3和ABA均較為敏感，它們分別促進和抑制種子萌發(fā)。隨著后熟時間延長，外源GA3促進種子萌發(fā)和外源ABA抑制種子萌發(fā)的作用在逐漸減弱。

2.3? 煙草種子后熟過程中ABA和GA代謝和信號基因表達變化

由圖5可知，NtPHYB1-RNAi新采收種子中ABA合成關(guān)鍵基因NtNCED6，ABA分解關(guān)鍵基因NtCYP707A1和ABA信號關(guān)鍵調(diào)控基因NtABI3表達量顯著高于WT種子;NtPHYB1-OE新采收種子中NtNCED6、NtCYP707A1和NtABI3表達量也顯著高于WT種子，而NtABI5表達量則顯著低于WT種子。上述結(jié)果說明與野生型新采收種子相比，NtPHYB1-RNAi新采收種子中ABA合成和分解代謝水平提高，ABA信號增強;而NtPHYB1-OE新采收種子中僅ABA合成和分解代謝水平提高。

隨著后熟的進行，WT種子中NtNCED6和NtABI3，NtABI5表達量逐漸或波動下降，NtCYP707A1表達量逐漸升高;NtPHYB1-RNAi種子中NtNCED6、NtCYP707A1和NtABI3，NtABI5表達變化與WT種子基本一致，說明WT與NtPHYB1-RNAi煙草種子后熟過程中ABA合成代謝水平下降，分解代謝水平提高，信號也減弱，ABA對種子萌發(fā)的抑制作用逐漸降低。而NtPHYB1-OE種子中NtNCED6和NtABI3表達變化與WT種子基本一致，但NtCYP707A1和NtABI5表達變化與WT種子相反，顯示NtPHYB1-OE煙草種子后熟過程中ABA合成和分解代謝水平均降低。

與恒溫后熟相比，變溫后熟時WT種子中NtNCED6下降變緩，而NtCYP707A1上升變緩，NtPHYB1-RNAi種子與WT種子變化規(guī)律基本一致，說明在變溫后熟過程中NtPHYB1-RNAi與WT種子中ABA合成代謝水平下降，分解代謝水平上升，但與恒溫后熟相比，變化減緩。NtPHYB1-OE種子中NtNCED6下降變緩，而NtCYP707A1下降加快，顯示在變溫后熟過程中NtPHYB1-OE煙草種子ABA合成代謝水平下降，但較恒溫后熟減緩;ABA分解代謝水平下降，且較恒溫后熟加快。

由圖6可知，NtPHYB1-RNAi新采收種子中GA合成關(guān)鍵基因NtGA3ox2，GA信號關(guān)鍵基因NtGAI和細胞壁松弛關(guān)鍵基因NtXTH2的表達量顯著高于WT新采收種子，但增加幅度較低;而NtPHYB1-OE新采收種子中NtGA3ox2、NtGA2ox2、NtGAI和NtXTH2的表達量均較WT種子顯著增加數(shù)倍。顯示與野生型種子相比，NtPHYB1-RNAi新采收種子中GA代謝和信號變化較小;而NtPHYB1-OE新采收種子GA代謝和信號變化較大。

后熟過程中，WT種子中NtGA3ox2表達量顯著增加，NtGA2ox2表達量顯著降低，顯示煙草種子后熟過程中GA合成代謝水平提高，分解代謝水平降低，GA對種子萌發(fā)的促進作用逐漸升高。與WT種子中變化一致，NtPHYB1-RNAi和NtPHYB1-OE種子中NtGA2ox2的表達量隨著后熟逐漸或波動下降，顯示后熟過程中不同基因型煙草種子GA分解代謝水平均在降低。

與恒溫后熟相比，在變溫下WT種子中NtGA3ox2上升減緩，而NtGA2ox2下降減緩，顯示變溫后熟過程中WT種子中GA合成代謝水平提高，分解代謝水平降低，但與恒溫后熟相比，變化減緩。恒溫后熟NtPHYB1-RNAi種子中NtGA3ox2表達量升高，而變溫后熟其表達量降低;顯示NtPHYB1-RNAi種子在恒溫后熟時GA合成代謝水平提高而變溫后熟時GA合成代謝水平降低。在變溫下NtPHYB1-OE種子中NtGA3ox2、NtGA2ox2和NtGAI下降加快，顯示變溫后熟過程中NtPHYB1-OE煙草種子GA合成代謝、分解代謝和信號水平均較恒溫后熟顯著提高。

3? 討? 論

新采收的煙草種子普遍存在光休眠，在黑暗條件下，即使延長培育時間，種子亦不能萌發(fā)。LEUBNER-METZGER等[13]研究表明室溫儲藏6個月后，種子完成后熟，具備在黑暗條件下萌發(fā)的能力。與前人研究結(jié)果一致，本研究表明3種基因型的煙草新采收種子均呈現(xiàn)光休眠，室溫儲藏后種子完成后熟。與前人研究結(jié)果不同之處在于后熟期明顯縮短為2個月，這種差異可能是由于儲藏環(huán)境不同所致，宋碧清等[14]發(fā)現(xiàn)適溫（25 ℃）下比相對低溫條件下（18 ℃）下利于種子后熟。說明在一定范圍內(nèi)高溫更利于種子后熟，而本研究卻發(fā)現(xiàn)日均溫15 ℃自然儲藏較25 ℃恒溫儲藏更利于種子后熟，這可能是源于自然儲藏過程中溫度在不斷變化，而變溫較恒溫更利于種子后熟，但自然儲藏過程中其他多種因素亦影響試驗結(jié)果，如若得出確切結(jié)果還值得今后進一步研究。

后熟解除種子光休眠和促進萌發(fā)的機理是較為復(fù)雜的，目前學界依然未得出確切結(jié)論。LEUBNER-METZGER等[18-19]研究表明后熟促進煙草種子光休眠解除可能是基于以下幾個方面的作用：（1）拓寬了種子萌發(fā)所需求溫度范圍;（2）降低種子中ABA水平和其對ABA的敏感性，提升種子對GA的敏感性或者促進種子萌發(fā)時失去對GA的需求;（3）解除種子萌發(fā)對光的需求;（4）增加在光下不能萌發(fā)種子對光的敏感性;（5）促進種皮和胚乳破裂，加速種子萌發(fā)。本研究也發(fā)現(xiàn)新采收煙草種子萌發(fā)需要光的參與，而后熟種子萌發(fā)并不依賴于光的存在;新采收煙草種子對ABA和GA3均較為敏感，隨著后熟種子對ABA的敏感性在降低，而對GA3的敏感性在升高，這與前人研究結(jié)果一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)后熟過程中的ABA和GA3代謝基因和信號基因發(fā)生變化，從而影響種子光休眠水平和后熟期。近來。王堯等[16]研究也表明在種子儲藏過程ABA代謝和信號被抑制，而GA合成和信號被激發(fā)，從而促進種子后熟。

近年來，光調(diào)控種子休眠與萌發(fā)的分子機制已經(jīng)取得顯著進展，光、ABA和GA調(diào)控擬南芥種子休眠與萌發(fā)存在交互作用[1-2]。PHY感知光信號從而影響下游的ABA和GA信號和代謝基因表達水平，進而調(diào)控種子休眠和萌發(fā)[11， 20]。而關(guān)于光敏色素是否參與種子光休眠和后熟調(diào)控卻知之甚少。本研究發(fā)現(xiàn)與WT種子相比，NtPHYB1-RNAi種子光休眠水平顯著加深，說明NtPHYB1可能負調(diào)控種子光休眠。然而，NtPHYB1-OE種子光休眠卻未顯著變淺，這與預(yù)期結(jié)果不一致，可能是因為種子休眠和萌發(fā)存在不同的調(diào)控機制，依據(jù)萌發(fā)率判斷種子光休眠水平和后熟期存在一定局限性。

ARANA等[21]研究表明變溫較常溫更利于擬南芥種子萌發(fā)，在變溫下PHYB調(diào)節(jié)ABA和GA代謝和信號基因（GA3ox1、NCED9、CYP707A2等）及細胞壁松弛基因（Expansion10）的表達，促進GA/ABA比值提高和細胞壁松弛，進而促進種子萌發(fā)。而本研究發(fā)現(xiàn)NtPHYB1協(xié)同變溫通過改變種子ABA信號調(diào)控煙草種子光休眠和后熟。如：與恒溫后熟相比，變溫后熟過程中，不同基因型種子中ABA和GA3相關(guān)基因表達量上升或下降的趨勢有的加速，有的減緩，呈現(xiàn)出不同的變化。上述結(jié)果說明NtPHYB1能夠協(xié)同變溫調(diào)控種子休眠、后熟與萌發(fā)，其調(diào)控機制值得今后研究。

4? 結(jié)? 論

新采收的煙草種子存在光休眠，在黑暗條件下萌發(fā)困難，而后熟有利于解除種子光休眠，促進種子在暗下萌發(fā)。與WT種子相比，NtPHYB1-RNAi種子光休眠水平加深，后熟期延長。與恒溫相比，變溫加速種子后熟。煙草的基因型與溫度協(xié)同影響種子后熟，變溫下WT和NTPHYB1-OE種子后熟加快，而NTPHYB1-RNAi種子變化不顯著。植物激素水平和信號影響種子光休眠和后熟，新采收種子對GA和ABA較為敏感，隨著后熟時間延長，外源ABA抑制和GA3促進種子萌發(fā)的作用在逐漸減弱;NtPHYB1協(xié)同變溫通過改變ABA和GA代謝和信號水平調(diào)控煙草種子光休眠和后熟。

參考文獻

[1] AN Y， ZHONG C. The control of seed dormancy and germination by temperature， light and nitrate[J]. The Botanical Review， 2020， 86： 39-75.

[2] 李振華，徐如宏，任明見，等. 光敏色素感知光溫信號調(diào)控種子休眠與萌發(fā)研究進展[J]. 植物生理學報，2019，55（5）：539-546.

LI Z H， XU R H， REN M J， et al. Advances in phytochrome regulating seed dormancy and germination by sensing light and temperature signals[J]. Plant Physiology Journal， 2019， 55（5）： 539-546.

[3] FLINT L H. Light in relation to dormancy and germination in lettuce seed[J]. Science，1934， 80（2063）： 38-40.

[4] BORTHWICK H A， HENDRICHS S B， PARKER M W， et al. A reversible photoreaction controlling seed germination[J]. Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America，1952， 38（8）： 662-666.

[5] TOYOMASU T， KAWAIDE H， MITSUHASHI W， et al. Phytochrome regulates gibberellin biosynthesis during germination of photoblastic lettuce seeds[J]. Plant Physiology， 1998， 118（4）： 1517-1523.

[6] SAWADA Y， AOKI M， NAKAMINAMI K， et al. Phytochrome- and gibberellin-mediated regulation of abscisic acid metabolism during germination of photoblastic lettuce seeds[J]. Plant Physiology， 2008， 146（3）： 1386-1396.

[7] KAMIYA Y， GARCIA-MARTINEZ J L. Regulation or gibberellin biosynthesis by light[J]. Current Opinion in Plant Biology， 1999， 2（5）： 398-403.

[8] YAMAGUCHI S， KAMIYA Y. Gibberellins and light-stimulated seed germination[J]. Journal of Plant Growth Regulation， 2001， 20 （4）： 369-376.

[9] LEE K P， PISKUREWICZ U， TURECKOVA V， et al. Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B[J]. Genes and Development， 2012， 26（17）： 1984-1996.

[10] DE WIT M， GALVAO V C， FANKHAUSER C. Light-Mediated hormonal regulation of plant growth and development[J]. Annual Review of Plant Biology， 2016， 67： 513-537.

[11] JIANG Z， XU G， JING Y， et al. Phytochrome B and REVEILLE1/2-mediated signalling controls seed dormancy and germination in Arabidopsis[J]. Nature Communications， 2016， 7： 12377.

[12] MERAI Z， GRAEBER K， WILHELMSSON P， et al. Aethionema arabicum： a novel model plant to study the light control of seed germination[J]. Journal of Experimental Botany， 2019， 70（12）： 3313-3328.

[13] LEUBNER-METZGER G. Seed after-ripening and over-expression of classI β-1，3-glucanase confer maternal effects on tobacco testarupture and dormancy release[J]. Planta， 2002， 215（6）： 959-968.

[14] 宋碧清，鄭昀曄，馬文廣，等. 貯藏溫度對煙草種子后熟的影響研究[J]. 種子，2017，36（4）：77-79.

SONG B Q， ZHENG Y Y， MA W G， et al. Effects of storage temperature on after-ripening of tobacco seed[J]. Seed， 2017， 36（4）： 77-79.

[15] ZHAO J H， HAN J， ZHANG J et al. NtPHYB1K326， a homologous gene of Arabidopsis PHYB， positively regulates the content of phenolic compounds in tobacco[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2016， 109： 45-53.

[16] 王堯，李振華，彭忠華. 煙草種子后熟對GA和ABA代謝與信號基因表達及萌發(fā)的影響[J]. 分子植物育種，2021，19（7）：2312-2319.

WANG Y， LI Z H， PENG Z H. Effects of seed after-ripening on GA and ABA metabolism， signal gene expression and germination in tobacco[J]. Molecular Plant Breeding， 2021， 19（7）： 2312-2319.

[17] LIVAK K J， SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2?ΔΔCt method[J]. Methods， 2001， 25（4）： 402-408.

[18] LEUBNER-METZGER G， MEINS FJ R. Sense transformation reveals a novel role for class I β-1， 3-glucanase in tobacco seed germination[J]. Plant Journal， 2000， 23： 215-221.

[19] LEUBNER-METZGER G， MEINS FJ R. Antisense-transformation reveals novel roles for class Iβ-1，3-glucanase in tobacco seed after-ripening and photodormancy[J]. Journal of Experimental Botany， 2001， 52： 1753-1759.

[20] YANG L W， LIU S R， LIN R C. The role of light in regulating seed dormancy and germination[J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2020， 62（9）： 1310-1326.

[21] ARANA MV， TOGNACCA RS， ESTRAVIS-BARCALA M， et al. Physiological and molecular mechanisms underlying the integration of light and temperature cues in Arabidopsis thaliana seeds[J]. Plant Cell and Environment， 2017， 40： 3113-3121.