陳 虹， 陳 琪， 陶 璇， 林 斕， 黃愛民

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤，雖然針對HCC的治療水平不斷進展，但其預后并未得到有效改善，腫瘤相關死亡率不降反升[1]。Notch信號是進化中高度保守的信號通路，存在4種受體(即Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)和5種配體(即DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1、Jagged2)，具有調(diào)控胚胎發(fā)育、組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)及細胞分化、增殖、凋亡等作用[2]。在腫瘤中，Notch信號通路的調(diào)控作用取決于腫瘤的類型，有的作為“癌基因”，有的則作為“抑癌基因”[3-5]。HCC中Notch信號通路的作用也存在爭議，部分研究認為，Notch信號通路受體在HCC中高表達，通過抑制Notch信號通路受體及其靶基因可以抑制HCC的生長，發(fā)揮“癌基因”的作用[6-9]；另有研究認為，Notch信號通路受體在HCC中發(fā)揮的是“抑癌基因”的作用，抑制HCC的生長[10-12]。為進一步明確Notch信號通路受體在HCC中的作用，本研究通過比較Notch信號通路家族4個受體在HCC和癌旁肝組織中的表達量，尋找在HCC中發(fā)揮關鍵作用的Notch信號通路受體。通過分析Notch信號關鍵受體與HCC臨床病理特征的相關性，探討Notch受體在HCC中的可能作用。應用生物信息學技術(shù)篩選可能調(diào)控Notch信號關鍵基因的microRNAs，并在組織中進行驗證，以期為深入研究Notch信號通路受體在HCC中的作用機制提供前期實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 收集2011-2017年筆者醫(yī)院手術(shù)切除的原發(fā)性HCC標本106例，男性90例，女性16例，年齡中位數(shù)56歲(30～71歲)。術(shù)前均未進行新輔助治療。按“Edmondson組織學分級法標準”[13]，HCC Ⅰ～Ⅱ級為高-中分化(77例)，Ⅲ～Ⅳ級為低分化(29例)。臨床分期按“BCLC肝癌臨床分期系統(tǒng)”[14]，分為0/A期(48例)，B/C/D期(58例)。微血管浸潤、肝硬化及肝外轉(zhuǎn)移等由病理組織學和影像學資料判斷。術(shù)前血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)水平和乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)等相關數(shù)據(jù)來源于病案系統(tǒng)存檔資料。分別取HCC和癌旁肝組織的存檔蠟塊，制成組織芯片行免疫組織化學染色。另收集38例新鮮的原發(fā)性HCC組織樣本，取HCC組織和癌旁肝組織，進行Notch信號通路受體mRNA的檢測；46例新鮮的HCC組織和正常肝組織(取自肝臟血管瘤切除周圍的肝組織)進行microRNAs的篩選和Notch2 mRNA的檢測。

1.1.2 試劑 Notch2抗體(ab118824，英國Abcam公司)；EnvisionTMplus試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)；Notch1、Notch2、Notch3、Notch4和β-actin引物(上海生工公司)；Trizol試劑和mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(中國賽默飛公司)；實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, RT-qPCR)檢測試劑盒(美國Invitrogen公司)；miR-146a、miR-16、miR-30b、miR-181a、miR-29b、U6引物以及microRNAs逆轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)。

1.2 方法

1.2.1 RT-qPCR檢測 肝組織勻漿Trizol抽提RNA，37 ℃逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，microRNAs和Notch1、Notch2、Notch3、Notch4在ABI7500定量PCR儀上擴增和檢測，反應條件分別為：95 ℃預變性 30 s，95 ℃ 5 s→60 ℃ 34 s，40個循環(huán)；95 ℃預變性 60 s，95 ℃ 15 s→60 ℃ 20 s，40個循環(huán)。各樣本mRNA和microRNAs相對表達水平采用相對定量(relative quantity，RQ)法(RQ=2-△△Ct)計算，以實驗組目的基因相對對照組基因的倍數(shù)來比較不同樣品基因表達的差異。每個反應設3個復孔，結(jié)果取平均值。Notch1、Notch2、Notch3、Notch4選用β-actin作為內(nèi)參；miR-146a、miR-16、miR-30b、miR-181a、miR-29b選用U6作為內(nèi)參，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.2 組織芯片免疫組織化學染色 106例HCC組織樣本先經(jīng)H-E染色，顯微鏡下圈定HCC組織和癌旁肝組織，分別取3個組織芯(每個孔徑約2 mm)制成組織芯片，厚度3～4 μm，常規(guī)脫蠟水化，經(jīng)EnvisionTMplus免疫組織化學二步法染色，顯微鏡下觀察。Notch2抗體稀釋度為1∶300，陽性細胞定位于細胞質(zhì)和細胞核。每個病例于高倍鏡視野(400×)下計數(shù)500個細胞。當細胞質(zhì)和細胞核出現(xiàn)中重度染色強度的棕黃色、棕褐色顆粒，陽性腫瘤細胞比例≥10%定義為陽性；中重度染色強度的腫瘤細胞<10%或呈現(xiàn)為微弱棕黃色或不著色均定義為陰性。以上資料均由2位病理科醫(yī)師以雙盲的形式獨立評估獲得。

1.2.3 蛋白免疫印跡法(Western-blot)檢測 取新鮮HCC組織和癌旁正常肝組織4例，液氮中研碎洗滌離心后取上清液。采用Bradford法檢測蛋白濃度，15%聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，Notch2抗體孵育過夜，二抗孵育后顯色，凝膠電泳圖像Image J系統(tǒng)分析目的條帶的分子量和灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 Notch信號通路受體mRNA在HCC組織和癌旁肝組織中的表達 RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，HCC組織中Notch1 和Notch4 mRNA的相對表達量均低于癌旁肝組織，癌旁肝組織表達量分別是HCC組織的1.3和1.5倍，但差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而Notch2和Notch3 mRNA的相對表達量均高于癌旁肝組織，其中Notch2 mRNA是癌旁肝組織的2.1倍，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，Notch3 mRNA是癌旁肝組織的1.4倍，差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖1)。

圖1 Notch信號通路受體家族成員在肝細胞癌和癌旁肝組織的表達情況

2.2 Notch2蛋白在HCC組織和癌旁肝組織中的表達 免疫組織化學檢測顯示，Notch2蛋白主要定位于細胞質(zhì)和細胞核。HCC組織中除了細胞質(zhì)以外，部分細胞核也有陽性表達，陽性表達率為37.7%(40/106)；癌旁肝組織中主要表現(xiàn)為細胞質(zhì)著色或不著色，陽性表達率為23.6%(25/106)，明顯低于HCC組織(P<0.05，圖2)。Western-blot檢測顯示，HCC組織Notch2蛋白表達高于癌旁肝組織，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。

HCC:肝細胞癌。A：HCC組織Notch2蛋白呈陽性表達，癌旁肝組織呈陰性表達(Envision×40)；B：HCC組織中Notch2在胞質(zhì)和胞核中呈棕褐色強陽性表達(Envision×200)；C：癌旁肝組織中Notch2蛋白在胞質(zhì)中呈微弱棕黃色顆粒，為陰性表達(Envision×200)；D：Notch2蛋白在HCC組織的陽性表達率高于癌旁肝組織(P<0.05)。

HCC:肝細胞癌，T：HCC組織；P：癌旁肝組織?！睿篜<0.05。

2.3 HCC組織中Notch2蛋白的表達與其臨床病理特征的關系 HCC組織中,Notch2蛋白在復發(fā)、肝外轉(zhuǎn)移及B-D期的HCC患者中的表達水平明顯高于未復發(fā)、未轉(zhuǎn)移和0-A期的患者(P<0.05)，而與患者的性別、年齡、術(shù)前血清AFP水平、HBsAg狀態(tài)、微血管浸潤、有無肝硬化及組織學分級無關(P>0.05，表2)。

表2 HCC中Notch2蛋白的表達與其臨床病理特征的關系

2.4 生物信息學預測篩選與Notch2靶基因可能相關的microRNAs 通過microRNAs預測軟件TargetScan、ENCORI、miRWalk獲取Notch2基因相關的microRNAs，分別獲取1 448、274和2 228個，取交集后得157個(圖4)，包含本研究的microRNAs。同時，進一步在http://www.mirbase.org和https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/上進行驗證，最后通過評估m(xù)icroRNAs的綜合相關評分(context++score percentile，Pct)等相關參數(shù)，選擇5個microRNAs進行驗證。再用GEO數(shù)據(jù)庫在線分析工具GEO2R分析GSE21362數(shù)據(jù)集，篩選出30個與HCC組織Notch2相關的差異顯著的microRNAs(P<0.01，|log2FoldChange|>1)，其中包括miR-146a(P=0.00，log2FoldChange =-1.04)。靶基因Notch2和miR-16、miR-146a、miR-30b、miR-181a、miR-29b互補配對的序列見圖5。

圖4 生物信息數(shù)據(jù)庫預測Notch2基因相關microRNAs的交集圖

圖5 Notch2和miR-146a、miR-181a、miR-16、miR-30b、miR-29b互補結(jié)合位點

2.5 Notch2相關microRNAs在HCC組織和正常肝組織中的表達 應用RT-qPCR對以上5種與Notch2相關的microRNAs進行檢測，結(jié)果顯示，正常肝組織的miR-30b、miR-181a和miR-29b的相對表達量高于HCC組織，而miR-16的相對表達量低于HCC組織，4種microRNAs在正常肝組織和HCC組織的相對表達量差別均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而正常肝組織的miR-146a相對表達量是HCC組織的1.8倍，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3)。

表3 microRNAs在HCC組織和正常肝組織中的表達情況

2.6 HCC組織中Notch2和miR-146a表達的相關性 分析46例HCC組織中Notch2和miR-146a相對表達量，發(fā)現(xiàn)Notch2 mRNA在HCC組織中的表達高于正常肝組織，而miR-146a在HCC組織的表達量低于正常肝組織，兩者呈現(xiàn)相反的趨勢。通過Pearson′s相關分析發(fā)現(xiàn),Notch2和miR-146a在HCC組織中的表達呈明顯負相關，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖6)。

HCC:肝細胞癌。A：HCC組織中Notch2 mRNA的相對表達量明顯高于正常肝組織(☆☆：P=0.043)，而miR-146a表達量則明顯低于正常肝組織(☆：P=0.010)；B：Pearson′s相關分析顯示，HCC組織Notch2和miR-146a的表達呈明顯負相關(r=-0.752, P<0.0001)。

3 討 論

Notch信號通路受體在HCC中的作用報道不一。Gao等[6]研究發(fā)現(xiàn)，激活Notch1可促進HCC細胞的增殖和生長；而Viatour等[11]卻發(fā)現(xiàn)，活化Notch信號通路受體使轉(zhuǎn)錄因子E2F失活，導致HCC細胞生長變慢；過表達Notch1誘導細胞凋亡，抑制HCC細胞生長[12]。HCC組織中Notch2的表達水平是上調(diào)還是降低，相關研究的結(jié)果也不一致[15-16]。為明確Notch信號通路受體在HCC中的作用，本研究檢測HCC和癌旁肝組織中Notch信號通路4個受體的mRNA表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCC組織和癌旁肝組織中Notch1、Notch3和Notch4的表達并沒有明顯差異，只有Notch2的表達量有顯著差異，推測Notch2可能是HCC中發(fā)揮關鍵作用的Notch信號通路受體。當然，Notch信號通路受體家族在不同研究中的結(jié)果也大相徑庭，可能與不同研究納入的人群不同有關。

Notch2蛋白在HCC組織中的表達水平高于癌旁正常肝組織，這與Notch2 mRNA水平的表達是一致的。免疫組織化學形態(tài)學顯示，HCC組織和癌旁肝組織Notch2的陽性表達定位不同，陽性細胞在HCC組織定位于細胞質(zhì)和細胞核，在癌旁肝組織則定位于細胞質(zhì)，這種差異可能與Notch2的功能狀態(tài)相關。眾所周知，Notch信號受體與相鄰細胞間配體結(jié)合后，受體經(jīng)2次蛋白水解作用被分為胞外段和胞內(nèi)段，其中胞內(nèi)段從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核調(diào)控下游靶基因，而胞外段則與其結(jié)合的配體胞外段一起被細胞內(nèi)吞[17]。HCC組織中既有細胞質(zhì)亦有細胞核的陽性表達，推測HCC組織和正常肝組織中Notch2的功能處于不同狀態(tài)，當Notch2的胞內(nèi)段從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核時，開始發(fā)揮其激活下游靶基因的生物學效應。HCC復發(fā)、肝外轉(zhuǎn)移和BCLC分期高的患者，Notch2蛋白的陽性表達率較高，提示Notch2蛋白高表達可作為預測HCC復發(fā)或轉(zhuǎn)移的生物標志物。BCLC高分期的HCC患者，Notch2蛋白高表達，與文獻報道一致[18]。

microRNAs是基因在轉(zhuǎn)錄后表達水平的重要調(diào)控因子，調(diào)控大量的癌基因和抑癌基因[19]。已知多種microRNAs的靶基因作用于HCC的發(fā)生、進展相關的信號通路，調(diào)控HCC細胞的增殖、侵襲和凋亡等過程[20-21]。本研究通過生物信息學預測軟件TargetScan、ENCORI、miRWalk獲取Notch2基因相關的microRNAs，取交集后共獲得157個microRNAs，miRBase和BiBiServ進一步篩選，GEO數(shù)據(jù)庫在線分析工具GEO2R分析驗證，發(fā)現(xiàn)miR-146a在HCC組織和癌旁肝組織中的表達量有明顯差異(P=0.00，log2FoldChange=-1.04)。本研究選擇46例HCC組織對所篩選的5個microRNAs進行驗證，同樣發(fā)現(xiàn)miR-146a在HCC組織和正常肝組織中的表達量有明顯差異。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在HCC組織中，miR-146a低表達，而Notch2高表達，兩者的表達情況恰好相反，推測miR-146a與Notch2可能存在調(diào)控關系。相關分析顯示，HCC組織中，Notch2的表達和miR-146a呈明顯負相關，提示Notch2可能是miR-146a調(diào)控的下游靶基因。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a在HCC中通過調(diào)控不同的靶基因發(fā)揮不同的抗腫瘤作用。miR-146a下調(diào)表達TRAF6抑制HCC細胞的增殖和浸潤[20]，下調(diào)VEGF抑制HCC細胞轉(zhuǎn)移[22]，miR-146a還可通過STAT3調(diào)控HCC細胞的抗腫瘤免疫抑制[23]。因此，HCC組織中可能還存在miR-146a調(diào)控的其他信號通路。本研究結(jié)果提示，Notch2可能是miR-146a調(diào)控HCC的又一個靶基因，為將來進一步研究miR-146a和Notch2在HCC中具體的調(diào)控機制奠定前期理論基礎。