王 偉， 林 翔， 陳萬(wàn)金， 王 檸， 金 銘

杜氏進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是一種致死性的X連鎖隱性遺傳病，是兒童最常見(jiàn)的遺傳性神經(jīng)肌肉疾病，發(fā)病率為(10.71～27.78)/105[1]。致病原因?yàn)閄染色體上的dystrophin基因發(fā)生突變，導(dǎo)致編碼的細(xì)胞骨架蛋白Dystrophin的功能缺失以及持續(xù)性的肌纖維退行性變，造成肌纖維的強(qiáng)度和穩(wěn)定性下降，出現(xiàn)進(jìn)行性肌肉萎縮。患者常在13歲前失去獨(dú)立行走能力，20～30歲時(shí)因心肺功能衰竭而死亡，目前尚無(wú)成熟有效的治療手段[2]。

在DMD的治療研究中，除了大規(guī)模的藥物臨床試驗(yàn)，主要使用各類研究模型，常見(jiàn)的有小鼠、犬、豬和猴，以及人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)等[3-6]，其中作為遺傳特性與人體最為接近的hiPSCs，由于可以定向分化為肌肉組織，是目前研究肌肉疾病最重要的體外模型，在基因編輯治療、長(zhǎng)鏈非編碼RNA治療和小分子藥物篩選方面都發(fā)揮了重要作用[7-9]。hiPSCs由已終末分化的細(xì)胞通過(guò)重編程的方式，重新獲得與胚胎干細(xì)胞相同的多向分化與自我更新能力[10]。然而，人體來(lái)源的hiPSCs依賴于患者組織的獲取，如皮膚、血液、尿液等，獲取渠道有限，對(duì)于一些特殊類型獲取難度較大。本研究擬通過(guò)CRISPR-Cas9技術(shù)，在正常hiPSCs中切除dystrophin基因的52號(hào)外顯子，從而引入大片段缺失突變，構(gòu)建DMD細(xì)胞模型，為后續(xù)治療研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細(xì)胞：293T細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)提供；正常的hiPSCs為本團(tuán)隊(duì)前期研究中通過(guò)重編程方式獲得[11]。(2)試劑：SpCas9表達(dá)載體構(gòu)建自張鋒實(shí)驗(yàn)室的PX-330(42230，美國(guó)Addgene公司)；干細(xì)胞培養(yǎng)基Essential 8TMMedium(A1517001，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；PEIpro (PT-115-0015，法國(guó)Polyplus Transfection公司)；T7E1酶切試劑盒(E3321，美國(guó)New England Biolabs公司)；Y-27632 (10005583，美國(guó)Cayman Chemical公司)；Accutase干細(xì)胞消化液(07920，加拿大Stemcell公司)；干細(xì)胞電轉(zhuǎn)試劑盒(VPH-5012，瑞士Lonza公司)。(3)儀器：多功能全自動(dòng)流式細(xì)胞分選儀(MA900，日本Sony公司)；核轉(zhuǎn)儀(NucleofectorTM2b Device，瑞士Lonza公司)。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體構(gòu)建 以PX-330為骨架構(gòu)建U6-sg-BpiI-CBA-SpCas9-CMV-EGFP及U6-sg-BpiI-CBA-SpCas9-CMV-mCherry載體，使用BpiI酶切后回收作為質(zhì)粒骨架。單鏈引導(dǎo)RNA(single guide RNA，sgRNA)挑選使用高保真Cas9深度學(xué)習(xí)預(yù)測(cè)模型(deep learning for high-fidelity Cas9，deepHF)在線工具[12]，選擇dystrophin基因52號(hào)外顯子上下游約800 bp剪切效率最高的sgRNA，并使用MIT特異性分值[13]及切割頻率測(cè)定(cutting frequency determination，CFD)特異性分值[14]計(jì)算工具評(píng)估其脫靶效率，選用評(píng)分在適用范圍內(nèi)的序列作為sgRNA。采用T4連接酶將質(zhì)粒骨架與sgRNA連接，構(gòu)建sgRNA1/2-Cas9-EGFP(上游)及sgRNA3/4/5/6-Cas9-mCherry(下游)質(zhì)粒。

1.2.2 T7E1分析 293T細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清，每日換液，1∶3傳代，傳代后12 h，使用PEIpro轉(zhuǎn)染試劑盒分別將各質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，質(zhì)粒與PEIpro比例為1∶2。48 h后進(jìn)行流式分選，收集熒光細(xì)胞約104個(gè)，使用直接擴(kuò)增PCR試劑盒對(duì)切割區(qū)域進(jìn)行片段擴(kuò)增，所用引物見(jiàn)表1(Ex52_1_F/R, Ex52_2_F/R)，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 20 s→60 ℃ 20 s→72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。切膠回收，使用T7E1酶切試劑盒，按說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行切割，通過(guò)Image J計(jì)算切割的條帶占總條帶的比例，得到sgRNA的切割效率，結(jié)合MIT特異性分值，挑選切割效率高、預(yù)測(cè)脫靶可能性低的sgRNA組合進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 hiPSCs突變模型構(gòu)建 構(gòu)建流程示意圖見(jiàn)圖1。hiPSCs的培養(yǎng)：細(xì)胞維持使用干細(xì)胞培養(yǎng)基Essential 8(E8)，每日換液。使用0.5 mmol/L EDTA解離細(xì)胞，1∶3～1∶5傳代。細(xì)胞傳代后3 d，長(zhǎng)至90%融合時(shí)準(zhǔn)備電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)前換含有10 μmol/L Y-27632的E8培養(yǎng)基于37 ℃下孵育1 h，隨后換Accutase于37 ℃下孵育10 min(可根據(jù)不同細(xì)胞系調(diào)整時(shí)間至完全消化為單細(xì)胞)，加入培養(yǎng)基中和，1 000 r/min離心3 min后收集細(xì)胞。每個(gè)反應(yīng)電轉(zhuǎn)5×106個(gè)細(xì)胞，2種質(zhì)粒按1∶1(物質(zhì)的量)混合，總量不高于10 μg，設(shè)置程序B016，電轉(zhuǎn)后鋪于基質(zhì)包被的6 cm 培養(yǎng)皿上。電轉(zhuǎn)后48 h，充分消化為單細(xì)胞后進(jìn)行流式分選，流式數(shù)據(jù)以FACS格式導(dǎo)出，使用FlowJo軟件分析，收集紅、綠雙陽(yáng)性的細(xì)胞約3×104個(gè)，均勻分散在50 mL含5 μmol/L Y-27632的E8培養(yǎng)基中，分鋪于5個(gè)10 cm培養(yǎng)皿上，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2中孵育，24 h后換液。5 d后挑選形態(tài)良好、未分化的單克隆，轉(zhuǎn)移至包被過(guò)的48孔板中。5 d后消化傳代，留取部分細(xì)胞使用直接擴(kuò)增PCR試劑盒裂解后進(jìn)行基因型鑒定。所用引物見(jiàn)表1(Ex52_cut)。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 20 s→60 ℃ 20 s→72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。

sg：sgRNA，單鏈引導(dǎo)RNA；hiPSCs:人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 sgRNA選擇 deepHF計(jì)算得到的sgRNA如表1所示，MIT特異性分值及CFD特異性分值計(jì)算結(jié)果如表2所示。為了驗(yàn)證不同sgRNA的切割效率，使用293T細(xì)胞測(cè)試載體的切割效率。T7E1酶切凝膠電泳如圖1B所示，切割效率如表2所示。

表2 各sgRNA切割效率

2.2 hiPSCs電轉(zhuǎn)及流式分選 電轉(zhuǎn)后24 h觀察hiPSCs貼壁及熒光情況(圖2A)。電轉(zhuǎn)后48 h進(jìn)行流式分選，收集Q2區(qū)域的紅、綠雙陽(yáng)性的細(xì)胞，雙質(zhì)粒電轉(zhuǎn)效率可達(dá)40.2%(圖2B)，將分選下來(lái)的單細(xì)胞鋪于10 cm培養(yǎng)皿中長(zhǎng)成單克隆，圖2C為分選后24 h貼壁的單細(xì)胞。

2.3 單克隆基因型鑒定 根據(jù)設(shè)置的鑒定引物，正?；蛐蛿U(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 397 bp，而sgRNA 1+sgRNA 3組合為185 bp(圖3A)，23/48株中出現(xiàn)該截短片段；sgRNA 1+sgRNA 4組合為492 bp(圖3B)，6/35株中出現(xiàn)該截短片段；sgRNA 2+sgRNA 4組合為692 bp(圖3C)，4/24株中出現(xiàn)該截短片段。截短片段的Sanger測(cè)序結(jié)果也證實(shí)了以切割位點(diǎn)為斷裂點(diǎn)的非同源末端連接模式。

sg:sgRNA。A：sgRNA 1+sgRNA 3的單克隆基因型鑒定結(jié)果；B：sgRNA 1+sgRNA 4的單克隆基因型鑒定結(jié)果；C：sgRNA 2+sgRNA 4的單克隆基因型鑒定結(jié)果。

3 討 論

本研究通過(guò)電轉(zhuǎn)CRISPR-Cas9系統(tǒng)的方式，利用雙sgRNA切割，以非同源末端連接的方式，在正常hiPSCs中切除了dystrophin基因第52號(hào)外顯子及上下游小段內(nèi)含子，成功構(gòu)建了52號(hào)外顯子缺失的DMD hiPSCs細(xì)胞模型，為后續(xù)的基因修復(fù)研究提供幫助。

dystrophin基因自1987年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，一直是遺傳性疾病研究的熱點(diǎn)，盡管經(jīng)歷了諸多挫折，但作為治療遺傳性疾病的樣板，醫(yī)生和科學(xué)家們始終未放棄對(duì)該基因的研究。近年來(lái)，隨著遞送技術(shù)及基因編輯技術(shù)的進(jìn)展，DMD的治療有了跨越性的進(jìn)步[2]。這種進(jìn)步離不開(kāi)各種DMD模型的貢獻(xiàn)，例如最經(jīng)典的mdx小鼠，在23號(hào)外顯子中發(fā)生了無(wú)義突變，導(dǎo)致dystrophin基因翻譯提前終止[15]，可以很好地模擬出dystrophin基因突變與蛋白表達(dá)之間的關(guān)系，加上其遺傳背景單純，繁殖速度快，在幾乎所有的DMD治療研究中均作為重要的在體實(shí)驗(yàn)對(duì)象[2]。另外，犬、豬、猴等大型動(dòng)物模型由于可較好地模擬人類的臨床表型，也在治療研究中發(fā)揮重要的驗(yàn)證作用[16-17]。然而，動(dòng)物模型也存在一定的局限性，如小鼠模型缺少典型的人類臨床表型，大動(dòng)物模型飼養(yǎng)周期長(zhǎng)、成本高、難以大量繁殖。更重要的是，無(wú)論模型動(dòng)物的臨床表型如何接近人類，他們的遺傳背景還是與人類不同，針對(duì)它們?cè)O(shè)計(jì)的基因修復(fù)方案并不一定適用于人類，而患者來(lái)源的細(xì)胞模型可克服這個(gè)局限性。常見(jiàn)的DMD患者來(lái)源的細(xì)胞有成纖維細(xì)胞、外周血單個(gè)核細(xì)胞、羊水上皮細(xì)胞、成肌細(xì)胞等，而全長(zhǎng)Dystrophin蛋白只在骨骼肌、心肌、大腦中表達(dá)[18]，在上述細(xì)胞中并不表達(dá)，不能直接用于治療研究。成肌細(xì)胞可在體外分化為骨骼肌細(xì)胞，但因來(lái)源于骨骼肌活檢，對(duì)患者創(chuàng)傷較大，制備方法復(fù)雜且得率低，可傳代次數(shù)少，難以支持規(guī)?；幕A(chǔ)研究，如治療性小分子、sgRNA篩選等。借助hiPSCs則可克服上述缺點(diǎn)：首先，hiPSCs可以在體外制備出遺傳背景與患者完全相同的各種組織類型的細(xì)胞，如心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、神經(jīng)元、腎小球、肝細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等[7,9,19-22]，可有效補(bǔ)充動(dòng)物模型在體試驗(yàn)的不足；其次，hiPSCs在體外可長(zhǎng)期保持分化潛能，需要時(shí)可大量分化制備表達(dá)Dystrophin蛋白的細(xì)胞，目前已成為DMD治療研究中首選的細(xì)胞模型。

隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)家們甚至能便捷、快速地對(duì)hiPSCs進(jìn)行改造，使其更高效地輔助研究，如將熒光蛋白序列插入目的基因可檢測(cè)基因表達(dá)的報(bào)告系統(tǒng)[23]，又如敲除基因的相關(guān)功能區(qū)以研究蛋白功能等[24]。本研究采取的CRISPR-Cas9大片段切除是對(duì)hiPSCs進(jìn)行改造的一種方案，其他可拓展的方案還包括利用同源重組在基因組中插入重復(fù)片段制備外顯子重復(fù)模型，利用單堿基編輯系統(tǒng)制備無(wú)義/錯(cuò)義/剪切位點(diǎn)突變模型等。目前，絕大多數(shù)hiPSCs模型都來(lái)自患者的體細(xì)胞重編程，由于各種原因，可能存在難以獲得特定基因型體細(xì)胞的情況，而本研究提供了一種解決方案，即在無(wú)法獲得相應(yīng)基因型的患者來(lái)源的體細(xì)胞時(shí)，可采用基因編輯技術(shù)構(gòu)建出某種特定基因型的細(xì)胞模型，為后續(xù)的機(jī)制或治療研究提供研究材料。

綜上所述，本研究?jī)H以dystrophin基因的52號(hào)外顯子切除為例，介紹了運(yùn)用基因編輯工具構(gòu)建hiPSCs模型的方法及流程。這種方法可用于多種疾病的研究，適用于不同類型的基因功能驗(yàn)證?；蚓庉嫎?gòu)建的hiPSCs模型相較于疾病動(dòng)物模型更貼近人類遺傳背景，是在無(wú)法獲得特定基因突變類型體細(xì)胞時(shí)的一種有效替代。