劉永靜， 于虹敏， 張 華， 陳 強(qiáng)， 陳達(dá)煒

荷丹片是由荷葉(君藥)、丹參和鹽補(bǔ)骨脂(臣藥)、山楂(佐藥)、番瀉葉(使藥)等五味中藥組成的復(fù)方制劑，是我國(guó)著名老中醫(yī)楊濟(jì)生先生獨(dú)創(chuàng)的方劑。荷丹片具有活血化瘀、化痰降濁等功效，適用于高脂血癥屬痰濁挾瘀證候者[1]。研究表明，荷丹片具有良好的降血脂作用，臨床上常用于治療動(dòng)脈粥樣硬化和高脂血癥[2-4]。荷丹片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)一部中(簡(jiǎn)稱《藥典》)，藥典規(guī)定，以君藥成分荷葉中的荷葉堿作為荷丹片的指標(biāo)性成分，采用高效液相色譜法對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定。對(duì)于中藥復(fù)方制劑，樣品前處理是整個(gè)分析過(guò)程中最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，主要是為了實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的分離、提純和富集，盡量排除其他物質(zhì)或雜質(zhì)的干擾，便于進(jìn)一步分析。傳統(tǒng)的處理技術(shù)主要有液液萃取(liquid-liquid extraction, LLE)和固相萃取(solid phase extraction, SPE)[5-6]。這些方法有機(jī)溶劑用量大、耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，對(duì)環(huán)境不利。近年來(lái)，基于LLE和SPE的特點(diǎn)和不足，分散微固相萃取技術(shù)(dispersive micro solid phase extraction，DMSPE)得到一定的發(fā)展[7-12]，其原理是將待凈化提取液直接加入含有固體填料的離心管中，通過(guò)渦旋振蕩離心等方式將待測(cè)目標(biāo)物吸附于填料上，然后利用解吸附溶劑進(jìn)行洗脫分析。目前，最常用的固體吸附填料有石墨烯、磁性碳納米管、金屬納米粒子和離子交換樹脂填料。

本研究基于荷葉中生物堿成分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，以強(qiáng)離子交換樹脂填料(polymer cation exchange, PCX)作為吸附劑，采用DMSPE技術(shù)對(duì)荷丹片進(jìn)行前處理，建立高效液相色譜法測(cè)定荷葉堿、O-去甲基荷葉堿、N-去甲基荷葉堿含量的新方法。該前處理技術(shù)簡(jiǎn)便快捷，消耗溶劑少，凈化效果好，單個(gè)樣品的處理時(shí)間僅需3～5 min。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 甲醇(分析純)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、三乙胺(優(yōu)級(jí)純)、冰醋酸(分析純)、甲酸(分析純)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙腈(分析純，西隴化工股份有限公司)；水為超純水，由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。

荷葉堿對(duì)照品(批號(hào)：111566，北京中國(guó)藥品生物制品檢定所)；N-去甲基荷葉堿對(duì)照品(含量≥99%)、O-去甲基荷葉堿對(duì)照品(含量≥98%)(成都曼思特生物科技有限公司)；荷丹片(批號(hào)：20150610，20141211，20150906，南昌濟(jì)順制藥有限公司);高分子陽(yáng)離子交換填料(polymer cation exchange,PCX)(天津博納艾杰爾公司)。

1.1.2 儀器 液相色譜儀(LC-20A，日本島津公司)；萬(wàn)分之一分析天平(AR 2140，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；超聲波清洗器(KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司)；快速渦旋混勻器(SK-1，常州國(guó)華電器有限公司)；超純水系統(tǒng)(美國(guó)Milli-Q公司)。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制備

1.2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取O-去甲基荷葉堿對(duì)照品8.50 mg、N-去甲基荷葉堿對(duì)照品9.60 mg、荷葉堿對(duì)照品11.40 mg，置10 mL量瓶中，加適量甲醇溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得0.85、0.96和1.14 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密吸取上述3種對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、0.5、1.0 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得混合對(duì)照品溶液。

1.2.1.2 供試品溶液的制備 (1)提取。取荷丹片10片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取0.1 g，用甲酸-水-甲醇溶液(5∶28.5∶66.5)10.0 mL溶解，超聲(功率250 W，頻率40 kHz)提取30 min，靜置至室溫，過(guò)濾，殘?jiān)盟崴芤憾啻蜗礈熘?0.0 mL，搖勻，即得荷丹片提取液。(2)純化。精密吸取1.0 mL荷丹片提取液，加入1.5 mL的裝有25 mg PCX粉末的 EP管中，渦旋混勻30 s，轉(zhuǎn)移至帶有0.45 μm有機(jī)相濾膜的2.5 mL注射器過(guò)濾裝置，棄去濾液，再用1.0 mL乙腈淋洗注射器過(guò)濾裝置進(jìn)行過(guò)濾，棄去濾液。用3.0 mL 5%的氨-乙腈溶液洗脫注射器過(guò)濾裝置，收集洗脫液，供HPLC分析。

1.2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱BDS HYPERSIL C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈和水-三乙胺-乙酸(100∶25.5∶1.1)，比例為30∶70；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL。分別精密吸取混合對(duì)照品溶液和荷丹片供試品溶液20 μL，按照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖1。荷葉堿在270 nm波長(zhǎng)下與其相鄰色譜峰的分離度均>1.5，拖尾因子在0.95～1.05之間，理論塔板數(shù)按荷葉堿色譜峰計(jì)算，不低于2 000。

1.2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備與線性關(guān)系的考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液0.2、1.0、2.0、5.0、10.0 mL置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得各個(gè)濃度的對(duì)照品溶液。分別精密吸取各個(gè)濃度的對(duì)照品溶液20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 專屬性考察 按照“1.2.1.2”項(xiàng)下的方法制備缺君藥成分荷葉的陰性對(duì)照品溶液，按照“1.2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行色譜分析(圖1)。

1：O-去甲基荷葉堿；2：N-去甲基荷葉堿；3：荷葉堿。A：混合對(duì)照品；B：純化前荷丹片提取液；C：純化后荷丹片溶液；D：陰性對(duì)照。

1.2.3.3 儀器精密度試驗(yàn) 按照“1.2.2”項(xiàng)下的色譜條件，將同一份混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，分別測(cè)定O-去甲基荷葉堿、N-去甲基荷葉堿和荷葉堿的峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)。

1.2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取同一批(批號(hào)：20150610)荷丹片粉末6份，按照“1.2.1.2”項(xiàng)的制備方法操作，按照“1.2.2”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算O-去甲基荷葉堿、N-去甲基荷葉堿和荷葉堿的含量及其RSD。

1.2.3.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 分別取9份已知含量的荷丹片片粉(批號(hào)：20150610，O-去甲基荷葉堿0.31 mg/g，N-去甲基荷葉堿0.35 mg/g，荷葉堿0.93 mg/g)約0.05 g，精密稱定，分別加入O-去甲基荷葉堿含量對(duì)照品溶液(0.017 0 mg/mL)、N-去甲基荷葉堿對(duì)照品溶液(0.019 2 mg/mL)以及荷葉堿對(duì)照品溶液(0.045 6 mg/mL)0.8、1.0、1.2 mL，按照“1.2.1.2”項(xiàng)下的方法制備，按照“1.2.2”項(xiàng)的色譜條件分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算3個(gè)生物堿的含量，求得平均回收率。

1.2.4 DMSPE純化條件的優(yōu)化 在對(duì)荷丹片中生物堿類成分進(jìn)行純化時(shí)，基于DMSPE前處理技術(shù)的原理，對(duì)吸附填料PCX的用量、吸附時(shí)間、洗脫溶劑中氨/乙腈濃度和洗脫體積進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4.1 PCX用量的優(yōu)化 準(zhǔn)確量取同一份供試品提取液1.0 mL，加入裝有10、15、20、25、30、35、40 mg PCX填料的1.5 mL的EP管中，按照“1.2.1.2”中的純化方法進(jìn)行純化，收集洗脫液，供HPLC分析。每個(gè)PCX填料用量平行操作3份，結(jié)果取平均值。

1.2.4.2 吸附時(shí)間的優(yōu)化 取同一份供試品提取液，按照“1.2.1.2”中純化方法進(jìn)行純化，考察不同渦旋時(shí)間(15、30、60、90、120 s)對(duì)吸附率的影響。

1.2.4.3 洗脫劑中氨濃度的優(yōu)化 分別取同一份供試品提取液1.0 mL，按照“1.2.1.2”中的純化方法進(jìn)行純化，考察0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、10.0%的氨-乙腈溶液對(duì)生物堿的洗脫影響，收集洗脫液，供HPLC分析。每個(gè)濃度的氨-乙腈洗脫液平行操作3份，結(jié)果取平均值。

1.2.4.4 洗脫劑體積的優(yōu)化 分別量取同一份供試品提取液1.0 mL，按照“1.2.1.2”中純化方法進(jìn)行純化，考察不同洗脫劑體積(1、2、3、4 mL)對(duì)生物堿洗脫的影響，平行操作3份，結(jié)果取平均值。

2 結(jié) 果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備與線性關(guān)系的考察O-去甲基荷葉堿、N-去甲基荷葉堿、荷葉堿的線性相關(guān)系數(shù)為0.999 90～0.999 95，三者在各自線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(表1)。

表1 3種生物堿的線性回歸方程

2.1.2 專屬性考察 陰性對(duì)照品溶液在O-去甲基荷葉堿、N-去甲基荷葉堿和荷葉堿的保留時(shí)間處未出現(xiàn)干擾峰，說(shuō)明荷丹片中其他成分對(duì)于荷葉生物堿類成分的分析沒有干擾(圖1)。

2.1.3 儀器精密度試驗(yàn) 將同一份混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次后，測(cè)得O-去甲基荷葉堿、N-去甲基荷葉堿和荷葉堿的峰面積的RSD為0.93%～1.56%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取同一批(批號(hào)：20150610)供試品粉末6份，測(cè)得O-去甲基荷葉堿、N-去甲基荷葉堿和荷葉堿含量的RSD分別為1.64%、2.16%和2.10%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好(表2)。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 測(cè)得的O-去甲基荷葉堿、N-去甲基荷葉堿和荷葉堿的平均加樣回收率(n=9)為97.76%～98.93%，RSD為1.84%～2.72%(表3)。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2 DMSPE純化條件的優(yōu)化

2.2.1 PCX用量的優(yōu)化 PCX用量對(duì)純化結(jié)果的影響見圖2A，當(dāng)PCX的用量從5 mg增加到25 mg時(shí)，3種分析物的吸附率隨著PCX用量的增加而增大，但當(dāng)PCX用量>25 mg時(shí)，繼續(xù)增加PCX的用量，峰面積反而有所減少，可能是因?yàn)樘盍嫌昧窟_(dá)到飽和狀態(tài)后，過(guò)量的填料會(huì)增加生物堿死吸附的量。因此，選擇25 mg作為PCX的最佳用量。

2.2.2 吸附時(shí)間的優(yōu)化 吸附時(shí)間對(duì)純化結(jié)果的影響結(jié)果見圖2B，吸附率在渦旋30 s時(shí)達(dá)到最高，渦旋時(shí)間>30 s時(shí)，吸附效率未顯著提高。因此，確定最佳吸附時(shí)間為30 s。

2.2.3 洗脫劑中氨濃度的優(yōu)化 氨濃度對(duì)純化結(jié)果的影響見圖2C，在其他提取純化條件均相同的情況下，不同體積分?jǐn)?shù)的氨-乙腈洗脫液對(duì)荷葉堿的洗脫效果不同，當(dāng)濃度從2%增加到5%時(shí)，堿性化合物荷葉堿從強(qiáng)陽(yáng)離子交換吸附劑中緩慢地被洗脫出來(lái)，峰面積達(dá)到最大；繼續(xù)增加氨-乙腈濃度，峰面積反而有所減少。因此，選擇5%作為氨-乙腈的最佳洗脫濃度。

2.2.4 洗脫劑體積的優(yōu)化 洗脫劑體積對(duì)純化結(jié)果的影響見圖2D，當(dāng)洗脫體積達(dá)到3 mL時(shí)，洗脫劑中3種生物堿的峰面積達(dá)到最大。因此，認(rèn)為3.0 mL洗脫液對(duì)于分析物的完全洗脫是足夠的。

A：PCX用量的考察；B：吸附時(shí)間考察；C：氨濃度考察；D：洗脫劑體積考察。

2.3 供試品的測(cè)定 分別取3批荷丹片粉末，按照“1.2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法進(jìn)行操作，按照“1.2.2”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，代入回歸方程計(jì)算3種生物堿含量，結(jié)果見表4。

表4 荷丹片中3種生物堿的含量

2.4 與《藥典》記載的前處理方法比較 取荷丹片片粉約0.4 g，精密稱定，按《藥典》中荷丹片項(xiàng)下含量測(cè)定中的“供試品溶液制備方法”進(jìn)行制備，最終轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，濾過(guò)，取濾液按照“1.2.2”項(xiàng)下的方法進(jìn)行分析，測(cè)得荷丹片中荷葉堿的平均含量為0.91 mg/g，與采用DMSPE純化后的含量無(wú)顯著性差異。

2.5 DMSPE的優(yōu)點(diǎn) 為了解基質(zhì)干擾和清除效果，在DMSPE純化前后分別獲得2張高效液相色譜圖(圖1)。從圖1B可以看出，在沒有DMSPE純化的樣品中，在10 min內(nèi)(尤其是5 min內(nèi))可以觀察到大量的干擾化合物，但是在所研究的色譜條件下，O-去甲基荷葉堿在5.67 min出峰，由于出峰的保留時(shí)間較早，很容易與干擾化合物共洗脫；同樣，N-去甲基荷葉堿色譜峰也會(huì)受到干擾峰的影響，導(dǎo)致色譜峰的基線噪聲提高，進(jìn)而導(dǎo)致靈敏度降低。然而，當(dāng)提取液進(jìn)行了DMSPE純化時(shí)，獲得了更好的純化效果，去除了干擾峰的影響，使O-去甲基荷葉堿、N-去甲基荷葉堿具有很好的選擇性。

3 討 論

荷丹片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《藥典》，其含量測(cè)定采用HPLC法測(cè)定其君藥荷葉中的荷葉堿，供試品溶液的處理方法是采用堿性三氯甲烷進(jìn)行提取，此操作過(guò)程較為繁瑣，且三氯甲烷的毒性和揮發(fā)性均較大，給操作帶來(lái)不便。本研究建立了基于PCX填料的DMSPE-高效液相色譜法測(cè)定荷丹片中3種生物堿類成分的含量測(cè)定方法，其中DMPSE具有凈化周期短、有機(jī)溶劑用量少、操作較簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)考察，該方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性均良好，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，可用于荷丹片中O-去甲基荷葉堿、N-去甲基荷葉堿和荷葉堿的質(zhì)量控制方法。