付 麗 莊軍輝 高雪琴 郝修振

河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院 河南鄭州 450046

近年來，關(guān)于亞硝酸鹽的食品安全事件頻繁發(fā)生，給消費者的身體健康和安全帶來了很大威脅。在肉制品加工中，亞硝酸鹽是最常使用的一種食品添加劑[1]，能使肉呈現(xiàn)誘人的粉紅色，其發(fā)色原理是肉中存在的肌紅蛋白與亞硝酸鹽結(jié)合生成鮮艷、亮紅色的亞硝基肌紅蛋白，對保持肉制品的色澤有著重要作用[2，3]；同時，其對肉制品的口感、風(fēng)味、組織狀態(tài)都發(fā)揮著重要的作用。另外，亞硝酸鹽對肉毒梭狀芽胞桿菌的抑制作用是不可替代的[4]。因此，亞硝酸鹽是肉制品加工中重要的發(fā)色劑、抗氧化劑和防腐劑，對肉制品的色、香、味及安全性均具有重要的作用。但亞硝酸鹽在肉制品加工中的殘留能產(chǎn)生亞硝胺和亞硝基酰胺等致癌物質(zhì)[5，6]，所以關(guān)于亞硝酸鹽的食品安全問題已成為肉制品加工生產(chǎn)中急需要解決的問題。國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)明確規(guī)定了肉制品中亞硝酸鹽的最大使用量不得超過0.15g/kg，還規(guī)定亞硝酸鹽殘留量(以亞硝酸鈉計)不能超過30mg/kg[7]。另外，世界衛(wèi)生組織和食品科學(xué)委員會規(guī)定亞硝酸鹽的每日允許攝入量為0～0.06mg/kg[8]。隨著人們對于綠色和清潔標(biāo)簽食品的強(qiáng)烈追求，有關(guān)亞硝酸鹽天然替代物質(zhì)的研究非常多[9，10]，但到目前為止還沒有找到理想的亞硝酸鹽替代物[11]，采用添加一些天然成分降低亞硝酸鹽的殘余量則是提高肉品安全的直接途徑，因此關(guān)于降低肉制品中亞硝酸鹽殘余量的研究成為了眾多學(xué)者關(guān)注的課題。

學(xué)者們目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多物質(zhì)都對亞硝酸鹽有一定清除作用，包括抗壞血酸(VC)及多種天然植物提取物，原因是這些植物都含有比較豐富的VC、類黃酮和酚類等還原性物質(zhì)[12]。Deda[13](2007)等研究得出低濃度的亞硝酸鹽與12%的番茄醬混合腌制香腸能達(dá)到最佳的發(fā)色效果，能減少肉制品中亞硝酸鹽殘留量。Li[14](2013)等研究發(fā)現(xiàn)綠茶多酚、葡萄籽多酚和抗壞血酸對香腸發(fā)酵過程中殘留的亞硝酸鹽和亞硝胺都有顯著的清除效果。

現(xiàn)代科學(xué)研究表明，香辛調(diào)味料具有清除亞硝酸鹽功能，可有效清除亞硝酸鹽[15]。羅思玲[16](2019)等研究發(fā)現(xiàn)生姜殘渣中黃酮濃度0.1mg/mL時對亞硝酸鹽具有一定清除作用，清除率可達(dá)50.25%。李玉邯[17](2016)等研究發(fā)現(xiàn)大蒜提取液對香腸和熟肉中亞硝酸鹽清除率分別可達(dá)85%和92%。李品艾[18](2011)等研究花椒水浸提液對亞硝酸鹽的清除作用較為明顯。張強(qiáng)[19](2015)等研究了10種香辛調(diào)味料對亞硝酸鹽的清除能力并發(fā)現(xiàn)桂皮提取液的清除效果最好。李文龍[20](2020)研究得出竹葉提取物、茶多酚、迷迭香提取物、葡萄籽提取物和甘草提取物均能夠不同程度地降低火腿中亞硝酸鹽殘留量。李佳棟[21](2017)等研究發(fā)現(xiàn)桂皮、丁香和花椒提取液對風(fēng)干腸中的亞硝酸鹽具有很好的清除作用且還能有效阻斷有毒物質(zhì)N-亞硝胺的生成。這些研究都說明了天然物質(zhì)對亞硝酸鹽有著一定的清除能力，尤其是香辛料提取物中存在的某些天然成分對于亞硝酸鹽都有著一定的清除能力。

本試驗選用八角、桂皮、生姜3種香辛料，分別采用水浸提法、醇浸提法、超聲-水浸提法、超聲-醇浸提法4種方法進(jìn)行浸提，模擬體外胃液環(huán)境下對亞硝酸鹽進(jìn)行清除作用的研究，篩選出每種香辛料的適宜浸提方法；研究3種香辛料不同添加量對亞硝酸鹽清除效果，分別得出其適宜的添加量，最終優(yōu)化出3種香辛料清除亞硝酸鹽的適宜配比。通過本試驗的研究開發(fā)出一種亞硝酸鹽天然復(fù)合清除劑，可為其在肉品加工中的應(yīng)用提供一定的數(shù)據(jù)指導(dǎo)，從而大大減少亞硝酸鹽在肉制品中的殘留量，提高肉制品的安全性。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

八角、生姜、桂皮，購于鄭州調(diào)味品市場；

亞硝酸鈉，為食品級，由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院畜產(chǎn)品研究室提供；

檸檬酸、氫氧化鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺，均為分析純，購于天津永大化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)JY96-IIN，寧波新芝生物科技股份有限公司；

紫外可見分光光度計BluseStarB，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；

多功能粉碎機(jī)GX-04，浙江省永康市昌發(fā)工具廠；

電子天平FA224，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；

雙功能水浴恒溫振蕩器SHA-B，金壇市杰瑞爾電器有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-080，鄭州生元儀器有限公司；

循環(huán)水真空泵SHZ-Ⅲ，鞏義市英峪予華儀器廠；

酸度計PHSJ-3F，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

2 試驗方法

2.1 香辛料預(yù)處理

分別稱取八角、桂皮、生姜3種香辛料各100g。用粉碎機(jī)將桂皮、八角粉碎至粉狀，備用；將生姜洗凈后去皮、切碎，備用。

2.2 香辛料的浸提及提取液的制備

采用水浸提、醇浸提、超聲-水浸提、超聲-醇浸提4種方法對八角、桂皮、生姜3種香辛料進(jìn)行有效成分的浸提。

2.2.1 水浸提法

準(zhǔn)確稱取3種處理好的香辛料各50g，放入250mL帶塞三角瓶中，加150mL蒸餾水，在40℃的水浴中振蕩浸提1h，用濾紙過濾后取濾液，濃縮至50mL，得到1g/L的提取液，冰箱冷藏備用。

2.2.2 醇浸提法

準(zhǔn)確稱取3種處理好的香辛料各50g，放入250mL帶塞三角瓶中，加150mL無水乙醇，在40℃的水浴中振蕩浸提1h，用濾紙過濾后取濾液，濃縮至50mL，得到1g/L的提取液，冰箱冷藏備用。

2.2.3 超聲-水浸提法

準(zhǔn)確稱取3種處理好的香辛料各50g，放入250mL帶塞三角瓶中，加150mL蒸餾水，放入超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中，頻率為25KHz，功率為300W，在40℃的水浴中超聲浸提25min，用濾紙過濾后取濾液，濃縮至50mL，得到1g/L的提取液，冰箱冷藏備用。

2.2.4 超聲-醇浸提法

準(zhǔn)確稱取3種處理好的香辛料各50g，放入250mL帶塞三角瓶中，加150mL無水乙醇，放入超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中，頻率為25KHz，功率為300W，在40℃的水浴中超聲浸提25min，用濾紙過濾后取濾液，濃縮至50mL，得到1g/L的提取液，冰箱冷藏備用。

2.3 不同添加量的香辛料提取液對亞硝酸鹽的清除效果

2.3.1 3種香辛料提取方法的篩選

吸取不同提取方法制備的八角、桂皮、生姜3種香辛料提取液(濃度為1g/mL)各1mL，分別置于50mL比色管中，加水至刻度，混勻后進(jìn)行亞硝酸鹽清除率的測定，篩選出3種香辛料的適宜提取方法。

2.3.2 不同添加量的香辛料提取液對亞硝酸鹽清除的效果

吸取適宜方法提取的生姜和桂皮(濃度為1g/mL)提取液1、2、3、4、5mL，分別置于50mL比色管中，加水至刻度，混勻；進(jìn)行亞硝酸鹽清除率的測定，研究不同添加量的香辛料提取液對亞硝酸鹽的清除效果，以確定其適宜的添加量。

2.3.3 3種香辛料提取液配比的優(yōu)化

在單因素試驗確定的3種香辛料提取液添加量的基礎(chǔ)上，將3種香辛料提取液復(fù)合研究其協(xié)同對亞硝酸鹽的清除效果，進(jìn)行三因素三水平正交試驗，因素水平表見表1。按不同配比分別吸取3種香辛料提取液(濃度為1g/mL)置于50mL比色管中，加水至刻度，混勻，以亞硝酸鹽清除率為測定指標(biāo)，優(yōu)化出八角、桂皮、生姜3種香辛料協(xié)同配比。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Level table of orthogonal test factors

2.3.4 亞硝酸鹽清除率的測定

亞硝酸鹽清除率的測定方法依照趙二勞[22](2006)等的研究方法并稍做改動。分別取各種提取液10mL于50mL容量瓶中，然后再加入配制好的25mL的pH值為3.0檸檬酸鈉-鹽酸緩沖溶液，再加入100mg/kg的NaNO2溶液5mL，最后用蒸餾水定容至刻度，并在恒溫箱內(nèi)，37℃恒溫1h。然后用移液槍各吸取1mL反應(yīng)液于25mL具塞試管內(nèi)，再分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2mL 4g/L的對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置3～5min后各加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2mL 2g/L鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15min。用分光光度計在540nm處測吸光度，分別用相應(yīng)濃度相同用量的提取液做空白試驗。亞硝酸鹽消除率按公式(1)計算。

亞硝酸鹽清除率(%)=[(A0-Ax)/A0]×100%

(1)

式中：A0為加入相應(yīng)提取液空白試驗的吸光度；Ax為加入不同濃度提取液時的吸光度。

2.3.5 數(shù)據(jù)處理與分析

每個試驗平行進(jìn)行3次，結(jié)果表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SigmaPlot12.5繪制圖表，采用SPSS17.0進(jìn)行顯著性分析，顯著性水平0.05。

3 結(jié)果與討論

3.1 3種香辛料提取方法的篩選

不同方法提取香辛料提取液的亞硝酸鹽清除率變化見圖1。

由圖1可見，針對八角提取物對亞硝酸鹽清除率來講，醇提法、超聲-醇提法、超聲-水提法無顯著差異且均顯著優(yōu)于水提法(p<0.05)，說明超聲處理與醇提法協(xié)同效果無差異，而超聲處理與水協(xié)同效果明顯。原因可能是八角中存在對亞硝酸鹽有清除作用的成分與水相比更容易溶于無水乙醇中，醇提取效率比較好，超聲波作用不明顯，而水提取效率低，使用超聲處理能有效提高其提取率。針對桂皮提取物對亞硝酸鹽清除率來講，醇提法明顯優(yōu)于水提取法、超聲-水提取法(p<0.05)，略高于超聲-醇提取法(p>0.05)，其原因可能由于桂皮中對亞硝酸鹽具有清除作用的物質(zhì)易溶于無水乙醇中，使用超聲波輔助會對這種物質(zhì)具有一定的破壞作用，降低其清除作用。針對生姜提取物對亞硝酸鹽清除率來講，醇提取和超聲-醇提效果差異不顯著且顯著低于水提取和超聲-水提(p<0.05)，原因可能是醇會破壞生姜中有效成分，使用超聲處理也會在一定程度上起破壞作用。綜上所述，在4種提取方法中，八角、桂皮以醇提取法效果較好，生姜以水提取法效果較好。

圖1 不同方法提取香辛料提取液的亞硝酸鹽清除率變化Fig. 1 Changes in nitrite removal rate of spices extracted by different methods注：小寫字母不同表示同一香辛料不同提取方法間亞硝酸鹽清除率差異顯著(p<0.05)。

3.2 不同添加量的香辛料提取液對亞硝酸鹽清除效果

不同添加量的香辛料提取液對亞硝酸鹽清除效果見圖2。

圖2 不同添加量香辛料提取液的亞硝酸鹽清除率變化Fig. 2 Changes of nitrite scavenging rate of spices with different supplemental levels注：小寫字母不同表示同一香辛料提取液對亞硝酸鹽清除效果差異顯著(p<0.05)。

由圖2可見，隨著桂皮和生姜提取液添加量的增多，其對亞硝酸鹽的清除效果呈上升趨勢，而八角提取液的亞硝酸鹽清除效果隨其添加量的增多呈下降趨勢。八角提取液添加量為1mL時，其亞硝酸鹽的清除率為52%，原因是八角提取液中的茴香醛具有一定的抗氧化性[23]，可與亞硝酸酸鹽發(fā)生某種反應(yīng)使用消除；當(dāng)添加量為2mL時，其亞硝酸鹽清除率顯著下降(p<0.05)。當(dāng)桂皮提取液添加量在1～4mL時，其亞硝酸鹽的清除率差異顯著(p<0.05)，其值從65.74%升至86.53%，可能是桂皮提取液中含某種物質(zhì)(如乙酸桂皮酯、乙酸苯丙酯、鞣質(zhì)等)能與亞硝酸鹽發(fā)生氧化還原反應(yīng)從而降低其殘留量[24]；當(dāng)添加量達(dá)到5mL時，其亞硝酸鹽的清除率變化不顯著(p>0.05)。生姜提取液添加量為4mL時，其亞硝酸鹽清除率顯著高于添加量為3mL時的亞硝酸鹽清除率(p<0.05)，原因是生姜提取液中含有愈創(chuàng)木酚[25]，同樣具有一定的抗氧化作用；當(dāng)生姜提取液添加量為5mL時的亞硝酸鹽清除率增加并不顯著(p>0.05)。因此，經(jīng)不同添加量的香辛料提取液對亞硝酸鹽清除效果研究，篩選出3種香辛料提取液適宜添加量分別為：八角添加量1mL，桂皮添加量4mL，生姜添加量4mL。

3.3 香辛料進(jìn)行復(fù)配后對亞硝酸鹽清除率的變化

正交試驗結(jié)果及極差分析見表2。

由表2所見，由極差分析可知，八角、桂皮、生姜對亞硝酸鹽清除率影響的主次關(guān)系為：C>B>A，其中生姜的影響最大，桂皮次之，影響最小的為八角。并得出最優(yōu)組合配比為A3B3C3，即濃度為1g/mL的八角、桂皮及生姜提取液的復(fù)合添加量分別為2、4mL和4mL，三者添加配比為1∶2∶2。

3.4 驗證試驗

按上述優(yōu)化得到的3種香辛料提取液最優(yōu)組合配比A3B3C3,用于模擬體外胃液環(huán)境下對亞硝酸鹽清除驗證試驗，以亞硝酸鹽清除率為測定指標(biāo)，分別做3組平行試驗，得出其亞硝酸鹽的清除率為88.71%，高于正交試驗表2中亞硝酸鹽清除率88.55%的最高組合A3B3C2，說明驗證試驗結(jié)果具有可靠性。

4 結(jié)論

香辛料多為藥食兩用植物資源，中國是世界上香辛調(diào)味料主要生產(chǎn)國和出口國，研究天然香辛料對亞硝酸鹽的清除效果，具有得天獨厚的資源優(yōu)勢且安全有效。本試驗采用八角、桂皮、生姜這3種香辛料作為清除劑，分別采用水提法、醇提法、超聲-水提法、超聲-醇提法這4種方法進(jìn)行其有效成分的提取并濃縮。在模擬體外胃液環(huán)境下對亞硝酸鹽進(jìn)行清除作用的研究，以亞硝酸鹽清除率為考察指標(biāo)，得到八角、桂皮的最適提取方法為醇提法，而生姜的最適提取方法為水提法；以最適方法對香辛料進(jìn)行提取并濃縮，分別取1、2、3、4、5mL配成同體積溶液，分別研究3種香辛料不同添加量對亞硝酸鹽清除效果，得出八角添加量為1mL、桂皮添加量為4mL、生姜添加量為4mL時清除效果最優(yōu)。最后進(jìn)行正交試驗優(yōu)化出濃度為1g/mL的八角、桂皮及生姜提取液適宜的復(fù)合添加量分別為2、4mL和4mL時對于亞硝酸鹽的清除有著較好的效果，清除率達(dá)到88.71%，即復(fù)合配比為1∶2∶2。本試驗開發(fā)出3種天然香辛料復(fù)合的亞硝酸鹽清除劑，為低硝肉制品的開發(fā)提供一定的數(shù)據(jù)參考。但針對香辛調(diào)味料功能成分與清除亞硝酸鹽的作用機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。