劉 玫，馬 豪，張 暉，梁 贏，吳港城，齊希光

1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122

3.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

抗凍蛋白(antifreeze proteins,AFPs)是一類具有熱滯活性、修飾冰晶形態(tài)和抑制冰晶重結(jié)晶能力的蛋白質(zhì)[1-3]，在冷凍食品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。不同生物來(lái)源的AFPs由于越冬機(jī)制不同而具有不同的活性，如來(lái)源于避凍昆蟲和魚類的AFPs熱滯活性較高，來(lái)源于耐凍植物的AFPs抑制重結(jié)晶能力較強(qiáng)[4]。因此，可以根據(jù)冷凍食品的不同劣變機(jī)制選擇不同特性的AFPs加以保護(hù)。

雖然目前已從植物、魚類及昆蟲等生物體內(nèi)分離得到AFPs，但是提取AFPs存在產(chǎn)量低、成本高等不足，導(dǎo)致無(wú)法實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，限制了其工業(yè)化應(yīng)用[5-7]?；瘜W(xué)方法可以合成某些AFPs，但是成本太高，難以廣泛應(yīng)用。目前已實(shí)現(xiàn)AFPs在原核生物大腸桿菌中的克隆表達(dá)，但是AFPs在原核生物體內(nèi)常常不能被正確地加工而無(wú)抗凍活性，且用大腸桿菌表達(dá)的蛋白常以包涵體形式存在，后續(xù)分析工作十分困難[8]。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)既有原核生物分子基因操作與生長(zhǎng)的特征，又具備真核生物翻譯后蛋白修飾的亞細(xì)胞機(jī)制，是目前應(yīng)用最廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)[9]。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)主要具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1) 外源基因通過(guò)表達(dá)載體整合到酵母基因組上，基因工程菌的遺傳穩(wěn)定性良好[10]；(2) 所得目的蛋白易于分離純化[11]；(3) 不存在內(nèi)毒素殘留問(wèn)題[12]；(4) 所得目的蛋白具有天然的高級(jí)結(jié)構(gòu)和生物活性[13]；(5) 具有釀酒酵母系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，可進(jìn)行高密度發(fā)酵，易于進(jìn)行工業(yè)化放大生產(chǎn)，從而提高重組蛋白的產(chǎn)量[9]?；谏鲜鲋T多優(yōu)勢(shì)，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在rAFPs的工業(yè)化生產(chǎn)方面具有廣闊的應(yīng)用前景[14-18]。

對(duì)于天然AFPs來(lái)說(shuō)，胡蘿卜AFP富含亮氨酸，相對(duì)分子質(zhì)量為36 800，熱滯活性較低，具有較強(qiáng)的抑制冰晶重結(jié)晶能力，在冷凍面團(tuán)的儲(chǔ)存方面具有較大應(yīng)用潛力[5,19-21]；魚類AFPs是一類發(fā)現(xiàn)最早且編碼基因序列確定最多的AFPs[22]，魚的種類不同，AFPs結(jié)構(gòu)和活性的差異很大；黃粉蟲AFP的熱滯活性最高，可達(dá)5.5 ℃[18]。目前已經(jīng)有較多AFPs(美絨杜父魚和鯡魚的魚類AFPs以及來(lái)自小胸鱉甲和云杉卷葉蛾的昆蟲類AFPs)利用畢赤酵母異源表達(dá)[14,18,23-28]，而關(guān)于胡蘿卜AFP在畢赤酵母中異源表達(dá)的研究還鮮有報(bào)道，黃粉蟲AFP在畢赤酵母中表達(dá)雖也有報(bào)道[29-30]，但是研究不夠深入。另外，即使來(lái)源相同的AFPs，由于編碼rAFPs的基因序列不同，AFPs異源表達(dá)的效果也會(huì)有很大差異。

本研究基于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中胡蘿卜AFP (登錄號(hào)：AAC62932.1)、點(diǎn)帶石斑魚AFP (登錄號(hào)：AGM15882.1)和黃粉蟲AFP (登錄號(hào)：ABB03885.1)的氨基酸序列，根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性，分別合成rCaAFP、rFiAFP和rTmAFP的基因序列，通過(guò)構(gòu)建酵母表達(dá)載體、G418和24孔板多重篩選，獲得3株分別產(chǎn)rCaAFP、rFiAFP和rTmAFP的重組畢赤酵母菌株；對(duì)重組畢赤酵母菌株產(chǎn)rAFPs的發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行初步優(yōu)化，并將發(fā)酵得到的rAFPs進(jìn)行一系列純化，得到3種抗凍活性較好的rAFPs。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

畢赤酵母GS115、大腸桿菌DH5α、表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K：美國(guó)Invitrogen公司。

限制性內(nèi)切酶EcoRI、NotI、Solution I連接液、T4連接酶、2×Super pfu PCR MasterMix、2×Taq PCR MasterMix等：中國(guó)大連Takara公司。

1.1.2 工具酶及試劑

SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽屜試劑盒、SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒等：上海生物工程有限公司。LB培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)基、BMMY培養(yǎng)基等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 rCaAFP、rFiAFP和rTmAFP的基因合成

基于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中胡蘿卜AFP (登錄號(hào)：AAC62932.1)、點(diǎn)帶石斑魚AFP (登錄號(hào)：AGM15882.1)和黃粉蟲AFP (登錄號(hào)：ABB03885.1)的氨基酸序列，按照畢赤酵母的密碼子偏好性，結(jié)合避免稀有密碼子、平衡G+C含量和提高mRNA穩(wěn)定性等原則，分別合成了rCaAFP、rFiAFP和rTmAFP的基因序列，結(jié)合表達(dá)載體pPIC9K內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的分布情況，在基因序列兩端均分別加上EcoRI (5′端)和NotI (3′端)酶切位點(diǎn)。

1.2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI對(duì)含目的基因的質(zhì)粒pMD18-T/rCaAFP和質(zhì)粒pPIC9K分別進(jìn)行雙酶切，膠回收后將得到的雙酶切目的基因和質(zhì)粒pPIC9K進(jìn)行連接獲得重組表達(dá)載體pPIC9K/rCaAFP。pPIC9K/rFiAFP和pPIC9K/rTmAFP的構(gòu)建方法同pPIC9K/rCaAFP。

大腸桿菌感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化：參考生工生物工程(上海)股份有限公司的細(xì)菌超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒的說(shuō)明，制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。利用熱擊轉(zhuǎn)化的方法[31]，將連接液轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)中。

1.2.3 畢赤酵母的電擊轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子的篩選

重組表達(dá)質(zhì)粒的線性化：為提高重組真核表達(dá)質(zhì)粒在酵母染色體上的整合效率，方便后續(xù)篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化前利用限制性內(nèi)切酶SalI對(duì)構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行單酶切，達(dá)到質(zhì)粒線性化的效果。

畢赤酵母感受態(tài)的制備：參照文獻(xiàn)[31]。

畢赤酵母的電擊轉(zhuǎn)化：將線性化后的重組質(zhì)粒pPIC9K/rCaAFP、pPIC9K/rFiAFP、pPIC9K/rTmAFP和線性化后的空pPIC9K質(zhì)粒，分別通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)入畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞[31]。

1.2.4 產(chǎn)高熱滯活性rAFPs重組畢赤酵母的篩選

將1.2.3中獲得的轉(zhuǎn)化子依次接種于G418質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8 g/L的YPD-G418固體培養(yǎng)基，在30 ℃條件下培養(yǎng)直至單菌落產(chǎn)生，篩選高拷貝數(shù)的3株重組畢赤酵母菌株；然后用24孔板進(jìn)行發(fā)酵篩選，取20 mL發(fā)酵上清液凍干后復(fù)溶于2 mL磷酸鹽(PBS)緩沖液(50 mmol/L，pH 7.4)，將發(fā)酵上清液濃縮至原體積的1/10，測(cè)定熱滯活性，篩選出濃縮發(fā)酵上清液熱滯活性最高的3株重組畢赤酵母菌株(GS115-pPIC9K/rCaAFP、GS115-pPIC9K/rFiAFP和GS115-pPIC9K/rTmAFP)用于后續(xù)研究。

1.2.5 重組畢赤酵母產(chǎn)rAFPs的誘導(dǎo)表達(dá)

將3株重組畢赤酵母菌株(GS115-pPIC9K/rCaAFP、GS115-pPIC9K/rFiAFP和GS115-pPIC9K/rTmAFP)分別接種至含50 mL BMGY液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，200 r/min、30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即OD600為5～6，振蕩培養(yǎng)時(shí)間20～24 h。以轉(zhuǎn)化了pPIC9K空載體的畢赤酵母菌株作為試驗(yàn)對(duì)照。

室溫條件下，3 000g離心5 min后回收酵母細(xì)胞。棄上清液，用100 mL BMMY培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞于500 mL三角瓶。

將500 mL三角瓶用透氣濾膜封口后，200 r/min、30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)并用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)酵120 h后將發(fā)酵液在8 010g、4 ℃條件下離心5 min，測(cè)定上清液的總蛋白含量和熱滯活性。總蛋白含量利用Bradford法[32]測(cè)定，牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.6 重組畢赤酵母產(chǎn)rAFPs的高密度發(fā)酵

重組畢赤酵母在YPD培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h (30 ℃和200 r/min)，然后將400 mL種子培養(yǎng)液接種至7 L發(fā)酵罐(含有4 L BMGY和10 mL/L PTM1溶液)中，高密度發(fā)酵過(guò)程包含3個(gè)階段：初始分批發(fā)酵階段、甘油流加階段和甲醇誘導(dǎo)階段。(1) 初始分批發(fā)酵階段：pH值和溫度分別控制在6.0和30 ℃，溶氧水平大于20%；溶氧水平突然上升表明甘油耗盡，即甘油流加階段開始。(2) 甘油流加階段：500 g/L甘油(含有12 mL/L PTM1溶液)以40.0 mL/h的速度加入培養(yǎng)基中；pH值、溫度和溶氧水平設(shè)置同初始分批發(fā)酵階段；流加8 h后停止補(bǔ)加甘油，隨后，溶氧水平增加直至100%，然后維持100%溶氧水平1 h以完全耗盡培養(yǎng)基中的甘油。(3) 甲醇誘導(dǎo)階段：甲醇(含有12 mL/L PTM1溶液)先以11.6 mL/h的速度補(bǔ)加，當(dāng)溶氧水平恒定時(shí)，補(bǔ)加速度改為23.2 mL/h直至發(fā)酵過(guò)程結(jié)束；pH值以搖瓶水平的最適pH為準(zhǔn)，溫度30 ℃，溶氧水平大于20%。

菌體生物量用稀釋倍數(shù)乘以O(shè)D600表示?？偡置诘鞍踪|(zhì)含量利用Bradford法(BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白)進(jìn)行測(cè)定[32]。rAFPs含量(mg/L)等于總分泌蛋白質(zhì)含量乘以rAFPs所占比例，rAFPs所占比例利用軟件Image J通過(guò)灰度分析法分析SDS-PAGE電泳圖譜得到。

1.2.7 rAFPs的純化

發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液在8 000g和4 ℃的條件下離心10 min，收集上清液，然后用超濾離心管濃縮上清液，截留液依次用硫酸銨沉淀、冰特異性親和法和高效液相色譜(HPLC)法進(jìn)行純化[33]，最后利用SDS-PAGE鑒定rAFPs的純度和相對(duì)分子質(zhì)量[34]。

1.2.7.1 超濾濃縮

分別選用截留相對(duì)分子質(zhì)量為10 000、3 000和3 000的超濾離心管處理發(fā)酵液，超濾的終點(diǎn)是原發(fā)酵液體積的1/10，并收集截留液。

1.2.7.2 硫酸銨沉淀法

將超濾濃縮后收集的截留液平均分成3份，緩慢加入研磨的硫酸銨粉末至其最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為20%、40%和60%，離心收集上清液和沉淀，上清液中繼續(xù)添加硫酸銨粉末，使質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別從原來(lái)的20%升至40%、40%升至60%、60%升至80%，離心收集沉淀。收集的沉淀分別復(fù)溶于PBS緩沖液(50 mmol/L，pH 7.4)，用截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 500的透析袋過(guò)夜透析，最后通過(guò)測(cè)定截留液的熱滯活性確定純化每種rAFPs所需的最佳硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.7.3 冰特異性親和法

將硫酸銨沉淀后得到的rAFPs粗提液，采用冰特異性親和法[35]進(jìn)行純化，然后將收集的冰晶組分復(fù)溶于PBS緩沖液(50 mmol/L，pH 7.4)，利用該方法重復(fù)吸附。測(cè)定每次吸附后rAFPs粗提液的熱滯活性，以確定吸附每種rAFPs所需的最佳吸附次數(shù)。

1.2.7.4 HPLC法

將冰特異性親和吸附后的rAFPs粗提液凍干后，利用HPLC進(jìn)一步純化。

液相條件：洗脫柱C18柱(10 mm×250 mm，Waters)；流動(dòng)相：溶液A是水(含0.1%三氟乙酸)，溶液B是乙腈(含0.1%三氟乙酸)；進(jìn)樣量100 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm。純化rCaAFP：流速4 mL/min，線性洗脫，乙腈50 min由5%升至85%，5 min由85%升至100%。純化rFiAFP：流速3 mL/min；線性洗脫，乙腈50 min由5%升至85%，5 min由85%升至100%。純化rTmAFP：流速3 mL/min，線性洗脫，乙腈50 min由5%升至85%，5 min由85%升至100%。最后收集具有熱滯活性的洗脫峰，并用SDS-PAGE鑒定rAFPs的純度和相對(duì)分子質(zhì)量。

1.2.8 SDS-PAGE分析

參照Laemmli[34]建立的不連續(xù)系統(tǒng)進(jìn)行SDS-PAGE，其中濃縮膠為15%。樣品的相對(duì)分子質(zhì)量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Marker的相對(duì)遷移率計(jì)算得到。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)至少3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。利用SPSS 20.0軟件處理數(shù)據(jù)，并通過(guò)單因素方差分析(ANOVA)和Duncan法分析顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 rCaAFP、rFiAFP和rTmAFP的基因合成

基于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中胡蘿卜AFP (登錄號(hào)：AAC62932.1)、點(diǎn)帶石斑魚AFP (登錄號(hào)：AGM15882.1)和黃粉蟲AFP (登錄號(hào)：ABB03885.1)的氨基酸序列，根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏好性，合成長(zhǎng)度分別為966、519、360 bp的rCaAFP、rFiAFP和rTmAFP基因，結(jié)果分別如圖1—圖3所示。

圖1 rCaAFP的基因序列

2.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

為鑒定重組表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果，對(duì)陽(yáng)性克隆子搖瓶培養(yǎng)并提取質(zhì)粒后，利用EcoRI和NotI對(duì)其進(jìn)行雙酶切，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，雙酶切得到的基因片段大小與質(zhì)粒pPIC9K及相應(yīng)rAFPs基因的大小一致。測(cè)序結(jié)果表明，PCR獲得的基因序列與編碼rAFPs的基因序列完全一致(因測(cè)序結(jié)果與圖1—圖3的基因序列一致，故略去)。綜合分析可知，3種包含相應(yīng)編碼rAFPs基因的表達(dá)載體均已構(gòu)建成功。

圖2 rFiAFP的基因序列

圖3 rTmAFP的基因序列

注：M為Marker；1為雙酶切產(chǎn)物。

2.3 產(chǎn)高熱滯活性rAFPs重組畢赤酵母的篩選

重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K/rCaAFP、pPIC9K/rFiAFP和pPIC9K/rTmAFP分別經(jīng)SalI線性化后，電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞中，然后經(jīng)過(guò)不含組氨酸MD平板的篩選。以生長(zhǎng)最快的重組轉(zhuǎn)化子的基因組為模板，利用目的基因的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖5所示，擴(kuò)增獲得的基因片段與目的基因大小一致。說(shuō)明rCaAFP、rFiAFP和rTmAFP的基因已經(jīng)成功整合到畢赤酵母基因組上。

注：M為Marker; 1、2、3為PCR樣品。

然后依次利用G418質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8 g/L的YPD-G418培養(yǎng)基篩選上述陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，分別獲得了17個(gè)GS115-pPIC9K/rCaAFP轉(zhuǎn)化子、22個(gè)GS115-pPIC9K/rFiAFP轉(zhuǎn)化子和19個(gè)GS115-pPIC9K/rTmAFP轉(zhuǎn)化子。

將上述獲得的轉(zhuǎn)化子單菌落分別接種到Y(jié)PD平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)2 d，然后利用24孔板進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示，所有的濃縮發(fā)酵上清液均有熱滯活性，說(shuō)明構(gòu)建的重組畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)可以胞外分泌具有熱滯活性的rCaAFP、rFiAFP和rTmAFP。

選擇產(chǎn)rCaAFP、rFiAFP和rTmAFP熱滯活性最高的5個(gè)轉(zhuǎn)化子，分別在搖瓶發(fā)酵72 h和96 h，測(cè)定發(fā)酵上清液(濃縮至原體積的1/10)的熱滯活性，結(jié)果見圖6。由圖6可知，發(fā)酵96 h，rCaAFP重組菌株C-2、rFiAFP重組菌株F-4和rTmAFP重組菌株T-5濃縮發(fā)酵上清液的熱滯活性分別為0.95、1.64、3.21 ℃，均顯著高于產(chǎn)同一rAFPs的其他重組菌株。因此，選擇編號(hào)為C-2、F-4和T-5的重組畢赤酵母菌株用于后續(xù)研究。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖7—圖9同。

2.4 重組畢赤酵母產(chǎn)rAFPs的誘導(dǎo)表達(dá)

2.4.1 誘導(dǎo)起始時(shí)間對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)rAFPs的影響

重組畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)rAFPs的過(guò)程可分為菌體積累期和誘導(dǎo)產(chǎn)rAFPs期[36]。誘導(dǎo)起始時(shí)間是影響rAFPs誘導(dǎo)表達(dá)的重要因素。因此，考察誘導(dǎo)起始時(shí)間對(duì)3株重組畢赤酵母菌株產(chǎn)rAFPs的影響，結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，不同的誘導(dǎo)起始時(shí)間對(duì)重組畢赤酵母菌株產(chǎn)rAFPs的能力均有顯著影響。誘導(dǎo)起始時(shí)間在12～24 h，隨著誘導(dǎo)起始時(shí)間的推遲，3株重組畢赤酵母菌株發(fā)酵上清液的總蛋白含量和熱滯活性均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。這可能是：當(dāng)誘導(dǎo)起始時(shí)間較早時(shí)，菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的前期，生長(zhǎng)狀態(tài)不穩(wěn)定，且菌體數(shù)量較少，總蛋白含量和熱滯活性較低；當(dāng)誘導(dǎo)起始時(shí)間較晚時(shí)，菌體細(xì)胞活力較低，更易受到甲醇毒害，rAFPs的誘導(dǎo)效率降低。3株重組畢赤酵母菌株發(fā)酵上清液的熱滯活性達(dá)到最大值時(shí)的誘導(dǎo)起始時(shí)間分別為16、18、18 h，與總蛋白含量達(dá)到最大值時(shí)的誘導(dǎo)起始時(shí)間一致。因此，在搖瓶水平上，重組畢赤酵母菌株GS115-pPIC9K/rCaAFP、GS115-pPIC9K/rFiAFP和GS115-pPIC9K/rTmAFP的誘導(dǎo)起始時(shí)間分別為16、18、18 h時(shí)，3株菌株進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)時(shí)均具有最好的rAFPs表達(dá)能力。

圖7 誘導(dǎo)起始時(shí)間對(duì)發(fā)酵上清液的總蛋白含量和熱滯活性的影響

2.4.2 甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)rAFPs的影響

畢赤酵母誘導(dǎo)發(fā)酵時(shí)，甲醇可以作為唯一碳源，同時(shí)也是外源蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)劑。誘導(dǎo)時(shí)的甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)是調(diào)控誘導(dǎo)發(fā)酵產(chǎn)外源蛋白的重要參數(shù)[37]。因此，以誘導(dǎo)96 h后發(fā)酵上清液的總蛋白含量和熱滯活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甲醇(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%)對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)rAFPs的影響，結(jié)果如圖8所示。

圖8 甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)發(fā)酵上清液的總蛋白含量和熱滯活性的影響

由圖8可知，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甲醇對(duì)3株重組畢赤酵母菌株產(chǎn)rAFPs的能力均有顯著影響。隨著甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，3株重組畢赤酵母菌株發(fā)酵上清液的總蛋白含量和熱滯活性均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.5%、1.5%和1.0%時(shí)，重組畢赤酵母菌株GS115-pPIC9K/rCaAFP、GS115-pPIC9K/rFiAFP和GS115-pPIC9K/rTmAFP發(fā)酵上清液中的總蛋白含量和熱滯活性均達(dá)到最大值。當(dāng)甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)，誘導(dǎo)力不足，導(dǎo)致外源蛋白的產(chǎn)量較低；當(dāng)甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的甲醛等中間產(chǎn)物，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不佳，也會(huì)降低外源蛋白的表達(dá)能力[37]。因此，在搖瓶水平上，重組畢赤酵母菌株GS115-pPIC9K/rCaAFP、GS115-pPIC9K/rFiAFP和GS115-pPIC9K/rTmAFP分別補(bǔ)加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%、1.5%和1.0%的甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵時(shí)，具有最佳的rAFPs表達(dá)能力。

2.4.3 誘導(dǎo)階段pH值對(duì)重組畢赤酵母產(chǎn)rAFPs的影響

培養(yǎng)基pH值既可以影響微生物的生長(zhǎng)速度和代謝產(chǎn)物的生成速率，也會(huì)影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的解離狀態(tài)和相應(yīng)成分的利用速率[38]。通過(guò)考察誘導(dǎo)階段不同pH值對(duì)發(fā)酵上清液總蛋白含量和熱滯活性的影響，以確定重組畢赤酵母產(chǎn)rAFPs的最適誘導(dǎo)pH值，結(jié)果見圖9。

圖9 pH值對(duì)發(fā)酵上清液的總蛋白含量和熱滯活性的影響

由圖9可知，3株重組畢赤酵母菌株產(chǎn)rAFPs的能力隨著誘導(dǎo)階段pH值的升高呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)誘導(dǎo)階段pH值分別為6.0、6.5和6.5時(shí)，3株重組畢赤酵母菌株發(fā)酵上清液的總蛋白含量和熱滯活性均達(dá)到最大值。當(dāng)誘導(dǎo)pH值低時(shí)，細(xì)胞死亡速率加快，會(huì)產(chǎn)生更多的雜蛋白；當(dāng)誘導(dǎo)pH值高時(shí)，蛋白酶活性增加，會(huì)引起蛋白酶對(duì)rAFPs的降解效率增大。因此，在搖瓶水平上，3株重組畢赤酵母菌株合成rAFPs的最適誘導(dǎo)pH值分別為6.0、6.5和6.5，此時(shí)，發(fā)酵上清液的總蛋白含量分別為99.47、104.89、113.79 mg/L，熱滯活性分別為0.39、0.52、0.69 ℃。在后續(xù)發(fā)酵研究中，3株重組畢赤酵母菌株產(chǎn)rAFPs的誘導(dǎo)階段pH值分別控制為6.0、6.5和6.5。

2.5 重組畢赤酵母產(chǎn)rAFPs的高密度發(fā)酵

為進(jìn)一步提高重組畢赤酵母菌株GS115-pPIC9K/rCaAFP、GS115-pPIC9K/rFiAFP和GS115-pPIC9K/rTmAFP產(chǎn)rAFPs的水平，在7 L發(fā)酵罐水平上進(jìn)行高密度發(fā)酵，結(jié)果如圖10所示。

圖10 重組畢赤酵母菌株的高密度發(fā)酵

由圖10可知，經(jīng)過(guò)初始分批發(fā)酵階段和甘油流加階段后，重組畢赤酵母菌株GS115-pPIC9K/rCaAFP、GS115-pPIC9K/rFiAFP和GS115-pPIC9K/rTmAFP的生物量分別為74.87、125.79和104.83。進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)階段后，3株重組畢赤酵母菌株的生物量基本保持不變。3株重組畢赤酵母菌株分別誘導(dǎo)64、80、80 h后，發(fā)酵上清液的總蛋白含量和目的蛋白均達(dá)到最大值，總蛋白含量分別為1 936.39、2 582.75、1 889.36 mg/L，rCaAFP、rFiAFP和rTmAFP含量分別為214.29、418.18、57.95 mg/L，3種目的蛋白的生產(chǎn)強(qiáng)度(產(chǎn)量/有效時(shí)間)分別為1.91、3.27、0.45 mg·L-1·h-1。

2.6 3種rAFPs的純化及鑒定分析

根據(jù)重組畢赤酵母發(fā)酵液可能的組分和rAFPs的性質(zhì)，對(duì)發(fā)酵上清液中的rAFPs進(jìn)行純化，結(jié)果見表1，并將純化后的樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖11所示。

注：M為Marker；1、3、5為發(fā)酵上清液；2、4、6為純化后的rAFP。

表1 3種rAFPs的純化情況

硫酸銨沉淀試驗(yàn)結(jié)果表明:純化rCaAFP、rFiAFP和rTmAFP對(duì)應(yīng)的最佳硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度分別是40%～60%、60%～80%和40%～60%，3種rAFPs熱滯活性分別為0.74、1.62、2.48 ℃，回收率分別為68.39%、63.74%、67.39%。冰特異性親和吸附結(jié)果表明：rCaAFP、rFiAFP和rTmAFP最佳吸附次數(shù)分別為4、4、3次，吸附后3種rAFPs的熱滯活性分別為1.49、3.29、5.93 ℃。HPLC法梯度洗脫后將具有熱滯活性的組分收集并進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明：rCaAFP、rFiAFP和rTmAFP在SDS-PAGE圖中均顯示相對(duì)集中的單一條帶。說(shuō)明經(jīng)過(guò)一系列純化步驟后得到電泳純的3種rAFPs，并且3種rAFPs的純度均大于90%，可以用于后續(xù)研究。另外，rCaAFP的相對(duì)分子質(zhì)量約為35 000，與已報(bào)道的胡蘿卜AFP的相對(duì)分子質(zhì)量(36 800)相近[19]；rFiAFP和rTmAFP的相對(duì)分子質(zhì)量分別約為20 000和14 400。

3 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了分別產(chǎn)rCaAFP、rFiAFP和rTmAFP的重組畢赤酵母菌株GS115/pPIC9K-rCaAFP、GS115/pPIC9K-rFiAFP和GS115/pPIC9K-rTmAFP。搖瓶發(fā)酵結(jié)果表明，當(dāng)誘導(dǎo)起始時(shí)間分別為16、18、18 h，誘導(dǎo)甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.5%、1.5%和1.0%，誘導(dǎo)pH值分別為6.0、6.5、6.5時(shí)，重組畢赤酵母菌株GS115/pPIC9K-rCaAFP、GS115/pPIC9K-rFiAFP和GS115/pPIC9K-rTmAFP發(fā)酵上清液的熱滯活性最高，分別為0.39、0.52、0.69 ℃；7 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵結(jié)果表明，3株重組畢赤酵母菌株發(fā)酵上清液中rCaAFP、rFiAFP和rTmAFP含量分別為214.29、418.18、57.95 mg/L，生產(chǎn)強(qiáng)度分別為1.91、3.27、 0.45 mg·L-1·h-1。將上清液依次經(jīng)過(guò)截留相對(duì)分子質(zhì)量分別為10 000、3 000和3 000的超濾離心管濃縮、質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度分別是40%～60%、60%～80%和40%～60%的硫酸銨沉淀、吸附次數(shù)分別為4、4、3次的冰特異性親和吸附，以及通過(guò)HPLC收集具有熱滯活性洗脫峰的純化步驟后，獲得了電泳純的rCaAFP、rFiAFP和rTmAFP，這3種rAFPs的熱滯活性分別為1.62、4.23、7.57 ℃ (10 mg/mL)。利用畢赤酵母異源表達(dá)生產(chǎn)rCaAFP、rTmAFP和rFiAFP，產(chǎn)量高、易純化、抗凍活性好，對(duì)于抗凍蛋白的研究及應(yīng)用具有重要價(jià)值。