鄭洪亮，孫世臣，丁國(guó)華，王彤彤，趙宏偉，王敬國(guó)，劉化龍，韓 笑，鄒德堂，來(lái)永才

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站，哈爾濱 150086；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)寒地糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與生理生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，哈爾濱 150086）

淀粉作為稻米主要成分，占稻米干重90%左右，其組分主要包括直鏈淀粉和支鏈淀粉，其中直鏈淀粉含量是影響水稻蒸煮食味品質(zhì)重要因素，研究認(rèn)為稻米直鏈淀粉含量、結(jié)構(gòu)和組成影響膠稠度、糊化溫度[1]，且稻米蒸煮食味與直鏈淀粉含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與膠稠度呈顯著正相關(guān)[2]。因此，挖掘稻米直鏈淀粉含量QTLs/基因，對(duì)于改良稻米品質(zhì)具有重要意義。

稻米直鏈淀粉含量是由多基因控制的數(shù)量性狀，利用正向遺傳學(xué)和反向遺傳學(xué)方法挖掘到與直鏈淀粉含量相關(guān)QTLs/基因。目前，已利用傳統(tǒng)QTL分析方法從32個(gè)遺傳群體中定位直鏈淀粉含量相關(guān)QTL 141個(gè)[3]，但由于不同研究人員采用試驗(yàn)材料遺傳背景差異較大，且選用分子標(biāo)記不同，導(dǎo)致定位結(jié)果差異較大。李修平等進(jìn)一步采用元分析方法對(duì)141個(gè)QTL構(gòu)建一致性圖譜，最終映射得到30個(gè)“一致性”QTL[3]。目前，已克隆水稻直鏈淀粉相關(guān)基因11個(gè)，包括位于第6染色體上的顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因Wx，也是公認(rèn)的水稻直鏈淀粉含量主效基因[4]，位于第6和第8染色體上與可溶性淀粉合成酶相關(guān)的3個(gè)基因SSSI[5]、SSIIa[6]和SSIIIa[7]，位于第1、3、5、7、8、9染色體上與ADP葡萄糖焦磷酸化酶相關(guān)的6個(gè)基因[8]：AGPL1、AGPL2、AGPL3、AGPL4、AGPS1、AGPS2a，以及位于第2染色體上與淀粉分支酶相關(guān)的基因SBEIIb[9]。但以上研究結(jié)果對(duì)于解析稻米直鏈淀粉含量復(fù)雜的遺傳基礎(chǔ)仍不充分。

除傳統(tǒng)QTL分析外，全基因組關(guān)聯(lián)分析是另外一種解析復(fù)雜性狀遺傳基礎(chǔ)的重要方法，具有群體構(gòu)建簡(jiǎn)單，表型變異豐富，且可在同一位點(diǎn)上分析多個(gè)等位基因，定位精度高等優(yōu)勢(shì)。目前稻米品質(zhì)相關(guān)研究應(yīng)用廣泛，如Chen等利用收集世界各地527份水稻品種為試驗(yàn)材料，結(jié)合3 916 415個(gè)SNP對(duì)稻谷籽粒4種貯藏蛋白作全基因組關(guān)聯(lián)分析，共檢測(cè)到34個(gè)位點(diǎn)與4種貯藏蛋白顯著關(guān)聯(lián)，其中有28個(gè)位點(diǎn)與已知QTLs/基因處于相同或相近位置[10]。Qiu等以272份秈稻品種構(gòu)成的自然群體為試驗(yàn)材料，利用18 824個(gè)高質(zhì)量SNP對(duì)粒長(zhǎng)、粒寬、長(zhǎng)寬比、粒厚、千粒重、堊白度、堊白率、糙米率等10個(gè)性狀作全基因組關(guān)聯(lián)分析，共檢測(cè)到38個(gè)顯著關(guān)聯(lián)QTL，其中有5個(gè)QTL為已知QTLs/基因[11]。但利用全基因組關(guān)聯(lián)分析研究粳稻直鏈淀粉含量遺傳基礎(chǔ)及基因挖掘的報(bào)道較少。

本研究以收集的295份溫帶粳稻種質(zhì)組成的自然群體為試驗(yàn)材料，于2019～2020年測(cè)定稻米直鏈淀粉含量，結(jié)合高通量測(cè)序獲得788 396個(gè)多態(tài)性SNP作GWAS分析，并針對(duì)重要QTL區(qū)間挖掘候選基因，以期為解析粳稻直鏈淀粉含量遺傳機(jī)制及利用分子育種手段改良稻米品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以國(guó)內(nèi)外收集的295份溫帶粳稻種質(zhì)構(gòu)成的自然群體為試驗(yàn)材料，國(guó)內(nèi)材料主要來(lái)自于黑龍江、吉林、遼寧和寧夏，國(guó)外材料主要來(lái)自于日本、韓國(guó)、朝鮮和俄羅斯。具體材料明細(xì)見(jiàn)表1。

表1 295個(gè)粳稻品種具體信息Table 1 Detailed information of 295 japonica rice varieties

1.2 田間種植及稻米直鏈淀粉含量測(cè)定

2019～2020年將所有供試材料種植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)阿城實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地水稻試驗(yàn)基地，4月15日播種，5月20日插秧，插秧密度為30 cm×16.7 cm，4行區(qū)，每行40株，田間采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，田間管理同當(dāng)?shù)卮筇锷a(chǎn)。于水稻成熟后收獲籽粒，置于40℃烘箱中烘干48 h至水分含量為14%，經(jīng)糙米機(jī)、精米機(jī)及磨粉機(jī)加工后，用于稻米直鏈淀粉含量測(cè)定，測(cè)定方法參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T17891-2017）[12]。

續(xù)表

續(xù)表

1.3 全基因組重測(cè)序、群體結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系及連鎖不平衡分析

本研究所用自然群體基因型數(shù)據(jù)獲取及群體結(jié)構(gòu)、親緣關(guān)系、連鎖不平衡分析等工作前期實(shí)驗(yàn)室已完成，具體分析過(guò)程及結(jié)果如下：①利用Illumina HiSeq XTen平臺(tái)作高通量測(cè)序，平均測(cè)序深度14.62×，以粳稻品種日本晴（IRGSP-1.0）為參考基因組，采用BWA軟件序列比對(duì)，采用GATK軟件“Best Practice”作群體SNP檢測(cè)，共獲得3 437 749個(gè)多態(tài)性SNP標(biāo)記，進(jìn)一步利用Plink軟件作數(shù)據(jù)質(zhì)控，最終篩選出最小等位基因頻率（MAF）＞5%，且缺失率（Missing data）＜20%的788 396個(gè)SNP用于后續(xù)分析；②利用ADMIXTURE軟件分析群體結(jié)構(gòu)[13]，結(jié)果表明，當(dāng)K=3時(shí)，群體CV值最小，因此將群體劃分為3個(gè)亞群，并將其對(duì)應(yīng)Q矩陣用于后續(xù)關(guān)聯(lián)分析；③利用Tassel 5.0軟件評(píng)估群體材料間親緣關(guān)系[14]，結(jié)果表明，親緣關(guān)系系數(shù)小于0.1材料占78.8%，＞0.5材料僅有0.4%，因此本研究所用群體材料間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，對(duì)后續(xù)GWAS分析結(jié)果影響較??；④利用PopLDdecay軟件計(jì)算得到水稻全基因組r2值[15]，依據(jù)Huang等方法[16]，將r2衰減到最大值一半時(shí)對(duì)應(yīng)的物理距離作為L(zhǎng)D衰減距離，經(jīng)計(jì)算，位點(diǎn)間最大r2值為0.84，群體LD衰減距離為109.7 kb。

1.4 稻米直鏈淀粉含量全基因組關(guān)聯(lián)分析

利用Tassel 5.0軟件混合線性模型（Q+K）對(duì)稻米直鏈淀粉含量作GWAS分析[14]，采用Li等方法通過(guò)GEC軟件計(jì)算有效獨(dú)立SNP數(shù)目，最終將P＜5.46×10-6作為顯著性關(guān)聯(lián)閾值[17]。如果在LD區(qū)間內(nèi)有多個(gè)顯著SNP存在，則將這些SNP視為同一個(gè)QTL，結(jié)果中僅列出P值最小的SNP作為峰值SNP，且峰值SNP貢獻(xiàn)率代表QTL貢獻(xiàn)率，以峰值SNP位置上下游分別增加109.7 kb（LD衰減距離）作為QTL區(qū)間范圍。GWAS分析結(jié)果的曼哈頓圖和Q-Q圖使用R語(yǔ)言中“qqman”軟件包繪制。

1.5 候選基因單倍型分析

將兩年共同檢測(cè)且不含已知基因的QTL作為重要QTL，根據(jù)區(qū)間內(nèi)基因注釋結(jié)果，分析區(qū)間內(nèi)所有基因單倍型。具體操作過(guò)程參考文獻(xiàn)[18]：①根據(jù)水稻注釋數(shù)據(jù)庫(kù)（http://rapdb.dna.affrc.go.jp/）獲取QTL區(qū)間內(nèi)全部基因；②利用水稻3K RGP的Rice SNP-Seek Database網(wǎng)站提取所有基因非同義突變SNP[19]，結(jié)合QTL區(qū)間內(nèi)所有SNP確定本研究自然群體最終非同義突變SNP；③對(duì)具有非同義突變SNP的所有候選基因作單倍型分析；④對(duì)不同單倍型（≥10份材料）直鏈淀粉含量作方差分析，篩選出具有顯著性差異基因，并結(jié)合基因功能注釋和前人研究結(jié)果確定候選基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 粳稻品種稻米直鏈淀粉含量表型分析

通過(guò)測(cè)定2019～2020年295份粳稻材料直鏈淀粉含量。結(jié)果表明，直鏈淀粉含量在兩年內(nèi)均表現(xiàn)出豐富的表型變異且趨勢(shì)一致，總體上，2020年各品種直鏈淀粉含量略高于2019年，兩年平均值分別為19.96%和20.37%，變異范圍分別為15.21%～25.34%和15.55%～25.68%，變異系數(shù)分別為12.12%和11.59%（見(jiàn)表2）。自然群體偏度值和峰度值絕對(duì)值均小于1，表明直鏈淀粉含量?jī)赡瓯硇头植汲式普龖B(tài)分布，符合典型數(shù)量性狀遺傳特征（見(jiàn)圖2）。

圖2 粳稻群體中直鏈淀粉含量頻率分布Fig.2 Frequency distribution of the amylose content in 295 japonica rice

表2 295份粳稻種質(zhì)直鏈淀粉含量表型值統(tǒng)計(jì)分析Table 2 Phenotypic analysis of amylose content in 295 japonica rice germplasms

2.2 稻米直鏈淀粉含量全基因組關(guān)聯(lián)分析

利用Tassel 5.0軟件混合線性模型（MLM）對(duì)295份粳稻品種直鏈淀粉含量作全基因組關(guān)聯(lián)分析，曼哈頓圖和QQ散點(diǎn)圖（見(jiàn)圖3）。在顯著性閾值P＜5.46×10-6條件下，2019～2020兩年共檢測(cè)到與直鏈淀粉含量相關(guān)QTL 12個(gè)，分布在水稻第3、4、11和12染色體上，貢獻(xiàn)率范圍為8.78%～11.62%。2019年和2020年均檢測(cè)到7個(gè)QTL，其中qAAC4-2和qAAC12-2在兩年中重復(fù)檢測(cè)到，qAAC4-2表型貢獻(xiàn)率兩年中分別為11.12%和9.15%，qAAC12-2表型貢獻(xiàn)率兩年中分別為10.62%和10.30%。根據(jù)全基因組LD衰減距離，最終將qAAC4-2和qAAC12-2分別定位于水稻第4和12染色體20.27～20.49 Mb和19.14～19.36 Mb（見(jiàn)表3）。

表3 粳稻淀粉相關(guān)性狀顯著相關(guān)位點(diǎn)Table 3 Significant correlation loci of starch related traits in japonica rice

圖3 粳稻直鏈淀粉含量全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果曼哈頓圖和QQ散點(diǎn)圖Fig.3 Manhattan plot and quantile-quantile(Q-Q)plots of genome-wide association studies for the amylose content in 295 japonica rice

2.3 稻米直鏈淀粉含量候選基因單倍型分析

針對(duì)兩年中同時(shí)檢測(cè)到的2個(gè)QTL（qAAC4-2和qAAC12-2）區(qū)間內(nèi)所有基因分析單倍型。qAAC4-2位于水稻第4染色體20.27～20.49 Mb區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間包含32個(gè)基因，單倍型分析結(jié)果表明，共有6個(gè)基因不同單倍型直鏈淀粉含量存在顯著差異（見(jiàn)圖4a～f）。

圖4 候選基因不同單倍型之間直鏈淀粉含量箱線圖Fig.4 Boxplots of amylose content between different haplotypes of candidate genes

LOC_Os04g33520非同義突變SNP分為兩種單倍型，Hap2（CA）顯著大于Hap1（TG）（見(jiàn)圖4a）；LOC_Os04g33590被非同義突變SNP分為兩種單倍型，Hap2（A）顯 著 大 于Hap1（G）（見(jiàn) 圖4b）；LOC_Os04g33640非同義突變SNP分為兩種單倍型，Hap2（T）極顯著大于Hap1（G）（見(jiàn)圖4c）；LOC_Os04g33660被非同義突變SNP分為兩種單倍型，Hap2（G）顯著大于Hap1（A）；LOC_Os04g33700被非同義突變SNP分為兩種單倍型，Hap2（CCTACC）顯著大于Hap1（TACGTG）；LOC_Os04g33710非同義突變SNP共分為兩種單倍型，Hap2（CT）顯著大于Hap1（AG）（見(jiàn)表4）。

表4 候選基因單倍型分組及每種單倍型SNP組成Table 4 Candidate gene haplotype group and the composition of each haplotype SNP

根據(jù)基因功能注釋（見(jiàn)表5），LOC_Os04g33640編碼糖苷水解酶，即一種水解糖苷鍵的酶[22]，該酶對(duì)糖和糖綴合物水解與合成具有調(diào)節(jié)作用[23]，推測(cè)其可能影響淀粉鏈長(zhǎng)度和分支[24]，進(jìn)而影響直鏈淀粉及支鏈淀粉含量。因此，推測(cè)LOC_Os04g33640最可能為qAAC4-2候選基因。另外一個(gè)QTL，qAAC12-2位于水稻第12染色體19.14～19.36 Mb區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間包含27個(gè)基因，單倍型分析結(jié)果表明，該QTL區(qū)間內(nèi)所有基因不同單倍型直鏈淀粉含量差異不顯著。

表5 候選基因基因注釋Table 5 Candidate gene of gene annotation

3 討論與結(jié)論

稻米直鏈淀粉含量除受遺傳因素控制外，溫度、光照、海拔等環(huán)境因素及施肥、收獲時(shí)期、貯藏時(shí)間、碾磨精度等農(nóng)藝措施均對(duì)直鏈淀粉含量有影響[25]。本研究以295份粳稻種質(zhì)為試驗(yàn)材料，于2019年和2020年種植于阿城基地，從測(cè)定的稻米直鏈淀粉含量看，2019年直鏈淀粉含量平均值為19.96%，變異范圍為15.21%～25.34%，2020年直鏈淀粉含量平均值為20.37%，變異范圍為15.55%～25.68%，其海拔、施肥、收獲時(shí)期、貯藏時(shí)間、碾磨精度等均不存在差異，而溫度和光照在年際間有較大差異，根據(jù)試驗(yàn)地氣象數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019年和2020年4～9月份≥10℃活動(dòng)積溫和日照時(shí)數(shù)分別為2 764℃、1 272.3 h和2 922℃、1 301.3 h，可知2020年活動(dòng)積溫和日照時(shí)數(shù)比2019年分別增加158℃和29 h。說(shuō)明溫度和光照對(duì)稻米直鏈淀粉含量略有影響，且稻米直鏈淀粉含量隨活動(dòng)積溫和日照時(shí)數(shù)增加而有所提高。

長(zhǎng)期以來(lái)針對(duì)稻米直鏈淀粉含量遺傳基礎(chǔ)解析開(kāi)展大量研究，除已克隆主效基因Wx外，近年來(lái)通過(guò)遺傳群體和自然群體鑒定到眾多QTLs/基因。根據(jù)國(guó)家水稻數(shù)據(jù)中心基因數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ricedata.cn/gene/）和水稻QTL數(shù)據(jù)庫(kù)（https://archive.gramene.org/qtl/）公布信息，將本研究檢測(cè)到的12個(gè)與直鏈淀粉相關(guān)QTL與前人結(jié)果作比較，發(fā)現(xiàn)部分QTL與前人已定位QTL位于相同、相近區(qū)間或包含已克隆淀粉相關(guān)基因。如Fan等通過(guò)秈稻品種珍汕97和H94雜交得到的F1構(gòu)建雙倍單倍體（DH）群體為試驗(yàn)材料[20]，利用水稻218個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)，檢測(cè)到兩個(gè)與直鏈淀粉含量相關(guān)QTL（AQGA007,AQGA017），分別與本研究2019年檢測(cè)到的qAAC3和2020年檢測(cè)到的qAAC12-3位于相同區(qū)間。另外，本研究2020年檢測(cè)到與直鏈淀粉含量相關(guān)QTL（qAAC4-1）區(qū)間內(nèi)包含可溶性淀粉合酶Ⅲ基因OsSSIIIb，與Zhao等研究結(jié)果一致[21]。表明本研究全基因組關(guān)聯(lián)分析的檢測(cè)結(jié)果具有較高準(zhǔn)確性，同時(shí)也縮小已定位QTL區(qū)間。

由于傳統(tǒng)基因圖位克隆需耗費(fèi)大量人力和時(shí)間，因此克隆影響復(fù)雜性狀QTL一直是植物遺傳學(xué)家和分子生物學(xué)家面臨的重大挑戰(zhàn)。采用GWAS方法作QTL分析，并針對(duì)QTL區(qū)間內(nèi)所有基因作單倍型分析，篩選出不同單倍型表型值之間存在顯著性差異候選基因，再結(jié)合基因注釋和前人研究結(jié)果挖掘候選基因，可提高候選基因篩選效率及準(zhǔn)確性[26]。本研究針對(duì)兩年共同檢測(cè)到且不含已知基因的兩個(gè)重要QTL（qAAC4-2、qAAC12-2）分析候選基因單倍型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)qAAC12-2區(qū)間內(nèi)所有基因不同單倍型直鏈淀粉含量差異不顯著，而qAAC4-2區(qū)間內(nèi)共有6個(gè)基因不同單倍型直鏈淀粉含量存在顯著差異，其中編碼糖苷水解酶的LOC_Os04g33640，對(duì)糖和糖綴合物水解與合成具有調(diào)節(jié)作用。研究表明，α-淀粉酶和β-葡萄糖苷酶均含有這種糖基水解酶結(jié)構(gòu)域，可水解淀粉產(chǎn)生糊精、低聚糖和單糖，從而降低淀粉積累[23-24]。因此，推測(cè)LOC_Os04g33640可能具有類似α-淀粉酶功能。下一步將重點(diǎn)針對(duì)LOC_Os04g33640開(kāi)展轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證和分子育種利用，為粳稻品質(zhì)改良提供理論依據(jù)。