裴 亮 ，王振興 ，周儒奎 ，楊李旺 ，儲開博 ，武 赟 ，翟曉艷

（1.山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院泌尿外科，山西太原030001； 2.山西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學系，山西晉中030619）

在世界范圍內，前列腺癌發(fā)病率在男性癌癥中排名第二，死亡率排名第六，嚴重威脅男性的生命健康，隨著世界人口老齡化日益嚴重，發(fā)病率和死亡率會持續(xù)增長［1］。對于前列腺癌的治療方式有手術、放射、內分泌和化學治療等方法。對于晚期的前列腺癌患者主要以改善臨床癥狀和延長生存期為主，基因治療為前列腺癌的治療提供了一個新的思路［2］。

SIRT6 屬于 SIRT 家族（SIRT1-7）成員之一，主要位于細胞核異染色質中，具有NAD 依賴的組蛋白去乙?；富钚院虯DP 核糖基轉移酶活性。在遺傳變異和氧化應激時具有維持基因組穩(wěn)定性、堿基切除修復和DNA 雙鏈斷裂修復的作用，參與細胞的凋亡、炎癥、代謝和衰老等過程［3］。

癌癥以持續(xù)的細胞增殖、能量代謝改變、炎癥反應為特點，被認為是一種衰老相關的疾病，SIRT6近年來被認為是一種抗衰老因子，同時對多種腫瘤具有抑制作用。有研究發(fā)現在某些腫瘤中SIRT6 的表達下降，同時SIRT6 缺失可引起糖酵解增加和腫瘤生長［3］。然而SIRT6 對前列腺癌的作用如何目前研究很少，本研究擬探討SIRT6 對前列腺細胞增殖能力和凋亡水平的影響。

1 材料與方法

1.1 主要細胞與試劑

細胞：本實驗中所用的前列腺癌細胞株（LNCAP、PC-3、DU145）和前列腺上皮細胞系（RWPE-1）均于上海中國科學院細胞庫購買。

主要試劑：CCK-8 試劑盒購買于日本同仁化學研究所，Annexin V-PI 凋亡試劑盒購買于美國Invitrogen 公司，兔抗人SIRT6 多克隆抗體購買于英國 Abcam 公司，鼠抗人 β 肌動蛋白（ACTB）單克隆抗體購買于美國Santacruz 公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG 抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司，高靈敏度化學發(fā)光檢測試劑盒購買于上海漢恒生物科技有限公司，DUB00 型核酸蛋白分析儀購買于美國Beckman Coulter 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Western 印跡法檢測細胞中SIRT6 蛋白表達 分別收集前列腺癌細胞株（LNCAP、PC-3、DU145）和前列腺上皮細胞系（RWPE-1）后，用預冷的PBS 沖洗3 次，加入RIPA 裂解液提取總蛋白，冰上孵育 30 min，期間每 10 min 混勻 1 次。4 ℃，12 000 g，離心15 min，用BCA 法檢測蛋白濃度。取 30 μg 蛋白加入，經 10% SDS-PAGE 凝膠電泳后，轉移至PVDF 膜上，加5%脫脂牛奶常溫封閉2 h。加入一抗兔抗人 SIRT6 抗體（1∶1000）和鼠抗人 ACTB 抗體（1∶500），4 ℃過夜，TBST 清洗 3 次，加入1∶2000 辣根過氧化物酶標記的IgG 二抗，室溫孵育2 h，加入顯影液用圖像分析系統采集圖像，Image J 軟件以ACTB 為參照分析相對灰度值。SIRT6 蛋白相對表達水平=SIRT6 灰度值/ACTB 灰度值。

1.2.2 SIRT6 基因轉染 將前列腺癌細胞株PC-3 分為對照組和SIRT6 轉染組，委托廣州賽業(yè)生物科技有限公司構建過表達SIRT6 的質粒。SIRT6 轉染組加入SIRT6-過表達質粒轉染，使其SIRT6 的表達增高，對照組加入空質粒轉染。取對數生長期的PC-3 細胞，按照1×106細胞/孔濃度接種到6 孔板中，當細胞培養(yǎng)至40%~50%融合度時，按照質粒轉染說明書，分別加入SIRT6 過表達質粒和空白質粒后，加入Lipofectamine 2000 助染劑，轉染72 h后，用Western 印跡法檢測轉染是否成功（方法同上）。

1.2.3 CCK-8 法檢測細胞的增殖能力 將轉染72 h 后的PC-3 細胞（對照組和SIRT6 轉染組）制備成1×104/mL 的細胞懸液，按照100 μL/孔接種入 96孔板中，置入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng) 0、12、24、36、48 h 后，每孔加入 10 μL CCK-8 試劑，在 37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育 2 h，在酶標儀測定450 nm 波長處的吸光值（OD450），每組細胞的每個時間點3 個復孔，取各孔平均值，繪制生長曲線。

1.2.4 Annexin V-PI 染色法檢測細胞的凋亡水平將轉染72 h 后的PC-3 細胞（對照組和SIRT6 轉染組），采用細胞刮輕刮細胞，離心收集所有貼壁及死亡后未貼壁的細胞，PBS 清洗3 遍，調整細胞為 5×106/mL，按照說明書，取 100 μL 細胞，分別加入 5 μL 的 Annexin V 工作液和 1 μL PI 工作液，輕輕混勻后，室溫避光孵育15 min，流式細胞術檢測細胞凋亡水平，凋亡細胞為Annexin-V 陽性細胞。

1.3 統計學方法

使用SPSS 18.0 軟件進行統計分析，實驗數據均為計量資料，以均數±標準差（）表示，兩組資料比較采用t-test 分析法，兩組以上資料比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1 SIRT6 在前列腺癌細胞中的表達

本研究采用Western 印跡法檢測了3 種前列腺癌細胞株（LNCAP、PC-3、DU145）與正常前列腺上皮細胞系（RWPE-1）中SIRT6 蛋白的表達，結果發(fā)現，無論是哪種前列腺癌細胞，其SIRT6 的表達均低于正常前列腺上皮細胞（P<0.01）。其中PC-3 細胞SIRT6 表達相對較低，但3 種前列腺癌細胞SIRT6 的表達比較差異無統計學意義。本研究選擇PC-3 細胞作為SIRT6 過表達的目標細胞。結果見圖1。

圖1 SIRT6 在3 種前列腺癌細胞中的表達

2.2 過表達SIRT6 后前列腺癌細胞的增殖能力

為了驗證SIRT6 對前列腺癌細胞的作用，本研究通過質粒轉染使PC-3 細胞中SIRT6 的表達升高。SIRT6 過表達后，通過CCK-8 法我們可以看到，SIRT6 轉染組細胞與對照組相比，細胞培養(yǎng)12 h 和24 h 增殖活性比較差異無統計學意義，培養(yǎng)至36 h 和48 h 增殖活性下降，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見圖 2、圖 3。

圖2 轉染后PC-3 細胞中SIRT6 的表達量

圖3 SIRT6 過表達后PC-3 細胞增殖活性的改變

2.3 過表達SIRT6 后前列腺癌細胞的凋亡水平

PC-3 細胞過表達SIRT6 后，通過Annexin V-PI 雙染檢測細胞的凋亡率，結果發(fā)現對照組細胞的凋亡率為（5.72±1.28）%，SIRT6 轉染組細胞的凋亡率為（12.45±2.35）%，SIRT6 轉染組細胞的凋亡率顯著高于對照組細胞，差異有統計學意義（P<0.01）。結果見圖4。

圖4 SIRT6 過表達后PC-3 細胞凋亡水平的改變

3 討 論

腫瘤細胞與正常細胞最主要的區(qū)別就是細胞的無限增殖能力，為了滿足細胞生長的能量需求，腫瘤細胞的代謝與正常細胞有所不同，這種不同主要表現為糖代謝異常：腫瘤細胞即使在有氧條件下也優(yōu)先進行糖酵解，因此可以增加葡萄糖攝入量，腫瘤細胞與普通細胞在糖代謝上的差別被稱為“瓦博格效應”。SIRT6 在代謝方面參與葡萄糖的代謝，SIRT6 基因敲除使小鼠肌肉和棕色脂肪組織對葡萄糖的攝入大幅增加，出現嚴重的低血糖［3-4］；SIRT6 基因敲除后，引起細胞膜上葡萄糖載體-1 表達增加，小鼠葡萄糖攝入增加，糖酵解增加，同時線粒體呼吸收也受到抑制［5-6］。綜上所述，SIRT6 敲除后，小鼠體內葡萄糖代謝與腫瘤細胞的代謝方式一致。因此，SIRT6 可能是一個腫瘤抑制因子。

為了證明SIRT6 的表達與前列腺癌有關，本研究首先比較了3 種前列腺癌細胞與正常前列腺上皮細胞中SIRT6 的表達，結果發(fā)現SIRT6 在前列腺癌細胞中的表達較正常前列腺上皮細胞降低，這與本研究的假設一致。

為了進一步證實SIRT6 在前列腺癌細胞中表達的差異與其細胞的功能有關，本研究在前列腺癌細胞過表達SIRT6 后，觀察其增殖能力和凋亡水平的變化，結果證實過表達SIRT6 后，前列腺癌細胞的增殖能力下降，同時前列腺癌細胞的凋亡水平升高。提示SIRT6 參與前列腺癌細胞增殖和凋亡，可能是治療前列腺癌的一個有效靶點。

Sebastian C 等［7］研究發(fā)現：SIRT6 缺失后，小鼠胚胎成纖維細胞的增殖能力提高，注射入小鼠體內可成瘤，不僅如此，還增加細胞的葡萄糖攝入量，糖酵解相關的基因表達增高。抑制糖酵解后，SIRT6 缺失的小鼠胚胎成纖維細胞其成瘤性也受到抑制，因此，SIRT6 可能通過抑制癌細胞的有氧糖酵解從而達到抑制腫瘤生長的目的［7］。SIRT6 在多種腫瘤都有抑制腫瘤細胞生長的作用［3］，但是，SIRT6 對前列腺癌細胞的作用機制是否也是通過抑制糖酵解來完成的，其中哪些通路參與了抑制糖酵解的過程，這些都有待后續(xù)的研究進一步去證實和探索。