梅思鈺 余珂,? 陳保衛(wèi)

1. 北京大學(xué)深圳研究生院, 環(huán)境與能源學(xué)院, 深圳 518055; 2. 中山大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院, 珠海 519082;

河口生態(tài)系統(tǒng)屬于海洋生態(tài)系統(tǒng), 是陸地和海洋的過渡帶, 地球四大圈層的交匯處[1]。由于其特殊的位置, 河口生態(tài)系統(tǒng)具有環(huán)境復(fù)雜多變、較高的生物多樣性和生產(chǎn)力以及受人類擾動程度大等特征, 因此河口生態(tài)系統(tǒng)是最特殊的海洋生態(tài)系統(tǒng)[2]。浮游細菌是水體中營浮游生活的原核微生物類群,它們在水生生態(tài)系統(tǒng)中具有極其重要的作用。浮游細菌是河口生態(tài)系統(tǒng)中多樣性最高、生物量最大的生命形態(tài)[3], 也是生物地球化學(xué)循環(huán)、物質(zhì)合成和分解以及能量流動的最重要的基礎(chǔ)[4–5]。浮游細菌提供了最重要的河口生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能。

目前, 珠江口區(qū)域的主要浮游細菌有放線菌門(Actinobacteria)、藍細菌門(Cyanobacteria)、浮霉菌門(Planctomycete)、厚壁菌門(Firmicute)、綠菌門(Chlorobi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、脫鐵菌門(Deferribacteres)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、綠彎菌門(Chloroflexi)、變形菌門(Proteobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)[6]。Wu 等[7]發(fā)現(xiàn), 珠江河口表層水的優(yōu)勢類群為變形菌門的 γ-Proteobacteria 和厚壁菌門的芽孢菌屬(Bacillus Clostridium), 而不動桿菌(Acinetobacter)作為優(yōu)勢物種分布相當廣泛[8]。Zhang 等[9]比較研究珠江河口總?cè)郝?基于 DNA 分析)和活性群落(基于 RNA 分析), 發(fā)現(xiàn)變形菌門和藍細菌門是優(yōu)勢類群。由微生物驅(qū)動的各種生態(tài)過程并非個體所能完成, 而是密切依賴于群落內(nèi)部復(fù)雜交織的相互作用, 并受到環(huán)境條件的強烈影響,會造成浮游細菌種群結(jié)構(gòu)和代謝功能的變化, 最終影響其生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能。

生態(tài)位(ecological niche)又稱生態(tài)龕, 表示生態(tài)系統(tǒng)中每種生物生存所必需的生境最小閾值。生物對食物和空間的競爭, 適應(yīng)環(huán)境的物理因子限度,大體上決定了其地理的或生境的規(guī)模范圍。生態(tài)位的概念于 1924 年由 Grinnell[10]首創(chuàng), 主要強調(diào)時間和空間上的意義。1927 年, Elton[11]將其意義進一步拓展, 強調(diào)生態(tài)位概念中功能與營養(yǎng)的關(guān)系。在自然環(huán)境里, 每一個特定位置都有不同種類的生物,其活動以及與其他生物的關(guān)系取決于它所處的環(huán)境、特殊結(jié)構(gòu)、生理和習(xí)性行為, 故形成自己獨特的生態(tài)位[12]。生態(tài)中的重合生態(tài)位會導(dǎo)致趨同演化, 即兩個物種雖然不是同一物種, 卻各自獨立地進化出相似的結(jié)果和功能[13], 因此同一生態(tài)位內(nèi)部具有親緣關(guān)系復(fù)雜的特征。河口中浮游細菌群落特征不僅具有顯著的時空差異, 而且易受環(huán)境參數(shù)變化的影響, 形成特殊的共生網(wǎng)絡(luò)。因此, 了解浮游細菌的群落特征對正確理解生態(tài)系統(tǒng)的狀態(tài)有著十分重要的意義[14]。

16S rRNA 基因擴增子測序技術(shù)廣泛應(yīng)用于海洋[15]、湖泊[16]、水庫[17]及河流[18]浮游細菌群落結(jié)構(gòu)的研究中, 如豐度統(tǒng)計、組成變化、區(qū)域環(huán)境物種數(shù)目(Alpha 多樣性)及沿地理、環(huán)境梯度基于物種有無和豐度的群落組成相異性(Beta 多樣性), 能夠表明時間、空間與環(huán)境參數(shù)對浮游細菌群落結(jié)構(gòu)均有影響[19]。已有研究關(guān)注河口微生物多樣性在空間和時間[20]尺度上的變化特征。在環(huán)境參數(shù)方面, 研究者闡述了鹽度[21]、溶解氧[22]和營養(yǎng)鹽[23–24]等環(huán)境因子的影響。其中, 在河口地區(qū), 有研究表明, 鹽度的變化對細菌的分布有直接影響[21]。鹽度變化也是海灣和沿海等地區(qū)細菌群落結(jié)構(gòu)變化較大的原因之一[25]。范艷君等[26]在研究珠江河口顆粒附著微生物群落沿環(huán)境梯度的空間分布特征時, 通過典范分析發(fā)現(xiàn), 鹽度和氮素相關(guān)營養(yǎng)鹽水平是影響水體顆粒附著微生物群落分布格局的兩個主要因素。

調(diào)查河口浮游細菌群落因環(huán)境參數(shù)而分化的生態(tài)位特征, 能夠反映浮游細菌對環(huán)境變化的適應(yīng)性, 對河口生態(tài)系統(tǒng)優(yōu)化管理、生態(tài)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展具有重要的科學(xué)意義。以往對珠江口環(huán)境因子和微生物群落的調(diào)查研究沒有結(jié)合生態(tài)位理論和群落共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)情況, 對一定的環(huán)境限度內(nèi)珠江口浮游細菌群落內(nèi)部是否形成和形成怎樣的生態(tài)位缺乏深入的探討。因此, 本研究基于高通量測序技術(shù),針對珠江口浮游細菌的 16S rRNA 基因序列進行多樣性分析、共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)分析以及代謝功能預(yù)測分析。我們首先調(diào)查確定了珠江口區(qū)域?qū)Ω∮渭毦绊懗潭茸畲蟮膯我画h(huán)境參數(shù)為鹽度, 并探究在不同鹽度下, 各組間是否具有明顯的多樣性差異, 是否因此形成具有特殊的結(jié)構(gòu)和生態(tài)功能的生態(tài)位群落, 從物種組成以及共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)方面, 對浮游細菌受環(huán)境干擾而在珠江口水體中形成的生態(tài)特征和模式提出新的見解。

1 研究區(qū)域與方法

1.1 研究區(qū)域基本情況

珠江口是典型的河口生態(tài)系統(tǒng), 位于我國華南地區(qū), 為我國華南人口最為集中的河口區(qū)域, 在我國的社會經(jīng)濟發(fā)展中具有重要的戰(zhàn)略地位。該地區(qū)與香港和澳門共同構(gòu)筑環(huán)珠江三角洲城市帶, 組成粵港澳大灣區(qū)[27], 是一個典型的復(fù)合型的具有區(qū)域特性的生態(tài)與經(jīng)濟共繁榮系統(tǒng)[28]。在地理位置上,珠江口位于中國廣東省海岸線的中部, 經(jīng)緯度坐標范圍在 21.50—22.45°N, 112.5—114.5°E 之間。珠江的河口區(qū)東起香港, 西達上川島, 北起珠江各分流河口, 南至大壕島和上川島一線, 總面積約為 2600 km2。珠江三角洲地貌以發(fā)育河口放射狀漢道為基本特征, 整個珠江三角洲由多個河口三角洲組合而成, 這種復(fù)合三角洲的地貌發(fā)育模式在我國各大河口中獨具特色。珠江三角洲河網(wǎng)水系在出海處形成八大口門, 分別匯入伶仃洋、磨刀門施和崖門海區(qū)。

1.2 樣品和環(huán)境參數(shù)的采集

本研究組于 2016 年 9 月在珠江口水域自上而下至海洋采取水樣, 每個點取 3～4 個平行樣, 分布于該區(qū)域各個方位的 9 個位置(圖 1 中 P1～P9), 共 34個水樣。每個樣品就地取 15 L 水樣, 取樣時設(shè)置兩個分組: 1) 水下 0.5 m 代表表層水(Surface), 水與沉積物交界處之上 1 m 代表底層水(Bottom); 2) 使用 PVDF 濾膜(Osmonics, 美國)過濾, 0.22 μm 濾膜過濾的樣品代表自由生活態(tài)(free-living, FL)的細菌,3 μm 濾膜過濾的樣品代表顆粒附著態(tài)(particleattached, PA)的細菌。水樣用濾膜過濾后, 立即用錫箔紙包裹, 4°C 保存, 運至實驗室, 放入?80°C 冰箱避光儲存, 用于 DNA 提取。

圖1 采樣點位置分布Fig. 1 Locations and distribution of sampling sites

使用便攜式鹽度計 Thermo Eutech A301729,就地對樣品鹽度進行測量。使用 Vario EL cube 元素分析儀, 獲取樣品中總 C 和總 N 的含量(μg/g)。使用 pH 計, 實地獲取樣品的 pH 值。圖 2 展示 C 和N 含量、pH 值和鹽度等環(huán)境參數(shù)在各采樣點的變化情況。

圖2 采樣點環(huán)境參數(shù)Fig.2 Numerical environmental factors of sampling sites

1.3 DNA 的提取

將濾膜剪碎, 置于 1.5 mL 離心管中, 加入研磨珠及 Buffer, 在高速研磨儀上進行研磨。反復(fù)操作過濾后, 收集上清液, 作為待提取溶液。使用OMEGA Bacterial DNA Kit (OMEGA, 美國)和 Fast DNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals, 法國)兩種試劑盒進行 DNA 提取, 每個樣品提取 4 個離心管的DNA, 分別溶于 90 μL DES 溶液中。在提取 DNA時, 通常伴隨多種腐植酸類、多酚等 PCR 抑制物的殘留, 可能對后續(xù)測序產(chǎn)生偏向性影響, 并夾雜擾亂 PCR 擴增的抑制因子, 因此需對提取的 DNA 樣品進行純化。由于純化步驟會使所提取的 DNA 產(chǎn)生部分損失, 所以將所有 DNA 提取液收集起來, 分裝于 200 μL 離心管中, 每個離心管再用于純化。使用 PowerClean DNA Clean-Up Kit (MoBio, 美國)試劑盒, 對上述步驟得到的 DNA 進行純化后, 溶解于90 μL DES 溶液中。保證樣品的 DNA 濃度達到 100 ng, 在振蕩器上微微震蕩后放置, 使 DNA 沉淀在離心管底部, 再用新的干凈離心管取 50 μL 保存, 用封口膠密封。

1.4 高通量測序及數(shù)據(jù)處理

取用 10 μg DNA 模板量, 對測序區(qū)域為 V3～V4區(qū)的目的區(qū)域進行擴增: 選擇 V3～V4 區(qū)域?qū)?yīng)的特異擴增引物(引物為 341F-805R), 繼而對擴增出的目的片段進行富集, 同時加入特異 index 序列, 構(gòu)建基因文庫。使用 Qubit2.0 進行初步定量, 稀釋文庫至 1 ng/μL。使用 Agilent 2100 對文庫的 insert size進行檢測。insert size 符合預(yù)期后, 使用 Bio-RAD CFX 96 熒光定量 PCR 儀和 Bio-RAD KIT iQ SYBR GRN 進行 qPCR[29], 對文庫的有效濃度進行準確的定量, 以保證文庫的質(zhì)量。選擇測序策略 PE250,使用 Hiseq 對上述步驟的文庫進行測序, 得到 16s 序列測序結(jié)果, 平均每個樣品得到 47317 條高質(zhì)量序列(范圍為 36631 ～ 55226), 總計 1608797 條。

原始 16S rDNA 測序得到的序列數(shù)據(jù)長度為150 bp, 質(zhì)量分數(shù)為 30 的序列占每組數(shù)據(jù)的 90%以上, 清潔率大于 90%。使用 FastQC 軟件[30]進行質(zhì)量查看后, 使用腳本對序列進行過濾。在 Linux 系統(tǒng)中使用 Qiime 2 軟件[31], 對測序得到的 16S rRNA基因序列進行 OTUs (operational taxonomic units,操作分類單元)的過濾, 用收集得到的較高質(zhì)量的OTUs 計算得到 OTU 豐度表以及物種分類信息表(Taxonomy)。

1.5 16s rRNA 基因分析

使用 Qiime2 獲取 Alpha 多樣性指數(shù)表, 在對數(shù)據(jù)進行 Shapiro-Wilk 正態(tài)性和 Bartlett 方差齊性檢驗后, 使用 R 軟件中的 Phyloseq 包[32]對 Alpha 多樣性指數(shù)進行可視化, 包括 Shannon 指數(shù)(代表豐富度)、Simpson 指數(shù)(代表均勻度, 值越接近 1 代表豐度分布越不均勻)和 PD_whole_tree 指數(shù)(代表遺傳多樣性, 值越大說明該分組下遺傳的多樣性越高)?；谟袇⒎治龅?Beta 多樣性排序分析的變量解釋度[33], 在 R 軟件中查找引起微生物群落組成差異的關(guān)鍵環(huán)境因素, 再使用不同的 Beta 多樣性分析聚類方法在環(huán)境參數(shù)上進行聚類。保留豐度大于0.01%的 OTUs 和對應(yīng)的分類信息, 進行物種組成展示。

共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建過程分為 5 個步驟: 基礎(chǔ)參數(shù)設(shè)置、相關(guān)系數(shù)標準化處理、網(wǎng)絡(luò)獲取、可視化及模塊化分析?；A(chǔ)參數(shù)設(shè)置時, 不同 OTUs 之間的相關(guān)性選用 Pearson 和 Spearson 檢驗, 相似性選用Mutual information 方法, 距離矩陣選擇 Bray Curtis和 Kullback-Leibler dissimlarity 度量法[34]。為了減少低豐度 OTUs 的影響, 使用 R 語言的 igraph 包對OTU 進行共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)參數(shù)計算, 過濾一些低豐度或低頻的類群, 過濾條件如下: 1) 選擇至少同時出現(xiàn)在 50%樣品中的 OTUs[35]; 2) 將 Spearman 相關(guān)系數(shù)低于 0.7 的類群剔除, 即r≥0.7; 3) 保留相對豐度總和高于 0.005 的屬。在進行相關(guān)系數(shù)標準化處理的時候, 對每一個交互和連線進行 100 次重新標準化和引導(dǎo)。以上步驟在 R 軟件中使用 R 包 Hmisc[36]和igraph[37]進行操作和數(shù)據(jù)文件導(dǎo)出?？梢暬糠质褂密浖?Gephi 0.9.2[38]進行物種信息、交點、邊和度等值的注釋并導(dǎo)出。

2 結(jié)果與討論

2.1 環(huán)境參數(shù)與微生物多樣性關(guān)聯(lián)分析

圖 3(a)展示基于典范對應(yīng)分析得到的珠江口浮游細菌 Beta 多樣性的環(huán)境參數(shù)解釋度比例, 為保證環(huán)境參數(shù)的豐富性, 將經(jīng)緯度也納入計算。非限制性排序只使用物種組成數(shù)據(jù)的排序, 代表生物因素的影響; 限制性排序同時使用物種和環(huán)境因子組成數(shù)據(jù)進行排序, 代表生物因素和非生物因素的共同影響。使用生物因素能夠解釋 78.2%的細菌多樣性,生物因素和非生物因素共同作用能夠解釋的比例為21.8%。在非生物的單一環(huán)境參數(shù)中, 鹽度能夠解釋 5.1%生物多樣性, 其次是 pH (3.4%)、緯度(2.9%)、碳氮比(2.7%)、碳含量(2.7%)和氮含量(2.4%)?！胺巧锫?lián)合”表示本研究使用的非生物因素變量聯(lián)合解釋度。圖 3(a)表明, 珠江口樣品中, 單一變量對細菌的組成不構(gòu)成主要影響, 但鹽度是主要的單一環(huán)境因素。非生物因素變量聯(lián)合的解釋度反而最低, 說明本實驗環(huán)境參數(shù)對樣品的影響不在同一方向上。這一結(jié)果表明在水體的復(fù)雜環(huán)境下, 微生物群落的多樣性是受多因素環(huán)境因子影響的, 但仍有個別單一因素具有重要影響。

圖3 Beta 多樣性變量解釋度Fig. 3 Explanable degree of the variables on the Beta diversity

為進一步探究鹽度的影響, 我們對鹽度梯度進行分組。對河口鹽度梯度的分組方法有以下兩種:第一種, 按照淡水區(qū)(0.2‰～0.3‰)、混合區(qū)(0.7‰～17.7‰)及海水中的高鹽度區(qū)(25.7‰～31.6‰)進行劃分[39], 第二種, 根據(jù)淡水(0～1‰)、咸水(1～10‰)和鹽水(10～100‰)進行劃分[40]。本文結(jié)合已有的分組依據(jù)與本研究的樣品數(shù)量和分布情況, 將鹽度分為低鹽度(0～10‰)、中鹽度(10‰～20‰)以及高鹽度(>20‰) 3 組(低、中、高是對于本文數(shù)據(jù)而言)。

典范對應(yīng)分析聚類(CCA)結(jié)果表明, CCA 算法選取的最大影響程度的排序軸 CCA1 和 CCA2 分別能解釋 7.11%和 4.46%的多樣性變化。根據(jù)本文的鹽度分組, 34 個樣品在排序軸上具有明顯的聚類效果, 低、中、高鹽度樣品在排序軸上能夠完全地區(qū)分開。由于解釋度過低, 圖 3(b)中 R 語言可視化算法將 C 和 N 含量剔除, 由圖可知, 鹽度是排序軸上解釋度最大的環(huán)境參數(shù), 緯度也與鹽度息息相關(guān),且與排序軸的夾角為銳角, 與排序軸正相關(guān)。由于數(shù)據(jù)均符合有參和無參分析的要求(具有正態(tài)性和方差齊性), 因此選用非限制排序算法(只使用物種組成數(shù)據(jù)排序, 包括去趨勢對應(yīng)分析(DCA)、主坐標分析(PCoA)、非度量多維尺度分析(NMDS)、去趨勢主成分分析(DPCoA)和多維尺度分析(MDS))以及限制性排序算法(同時使用物種和環(huán)境因子組成數(shù)據(jù)的排序, 包括主成分分析(RDA)、典范對應(yīng)分析(CCA) 和等多重排序算法)進行聯(lián)合比較(圖 3(c))?？梢园l(fā)現(xiàn), 珠江口數(shù)據(jù)在鹽度分組上有很好的聚類效果和區(qū)分度, 且所有算法的聚類結(jié)果均為低鹽度或中高鹽度的數(shù)據(jù)具有明顯的區(qū)分度, 說明無論是無參算法, 還是有參算法, 低鹽度與中高鹽度的微生物群落結(jié)構(gòu)均具有明顯的差異。

選取 Shannon, Simpson 和 PD_whole_tree 指數(shù)進行 Alpha 多樣性分析, 統(tǒng)計顯著性檢驗結(jié)果p值(p< 0.05 表示顯著)。將鹽度分組作為數(shù)據(jù)分組, 與采樣時的浮游細菌狀態(tài)(自由生活菌 FL 和顆粒附著菌 PA)和采樣水層(底層和表層)兩種設(shè)置進行 Alpha多樣性及其組間顯著性對比。圖 4 顯示, 浮游細菌狀態(tài)和采樣水層在 3 個 Alpha 多樣性指數(shù)上的組間差異均不顯著(p>0.05), 而鹽度分組 3 個指數(shù)的p值均小于 0.05, 差異最明顯(p值最小)的為遺傳多樣性, 且低鹽度浮游細菌的遺傳多樣性顯著高于中高鹽度。

圖4 組間Alpha 多樣性差異比較Fig. 4 Comparison of Alpha diversity between groups

2.2 珠江口浮游細菌物種組成

本實驗中 16s OTU 原始數(shù)據(jù)的細菌分類學(xué)組成絕大多數(shù)是細菌(Bacteria), 包括 23 個門(Phylum),54 個綱(Class), 94 個目(Order), 160 個科(Family),250 個屬(Genus), 269 個種(Species)。

在門水平上, 檢出 9 個門類(圖 5(a)), 包括變形桿菌門(Proteobacteria)(相對豐度為 16.2%～62.9%)、酸性桿菌門(Actinobacteria)(3.1%～46.7%)、擬桿菌門(Bacteroidetes)(5.2%～50.6%)、藍菌門(Cyanobacteria) (0%～28.8%)、扁平菌門(Planctomycetes)(0%～11.2%)、疣微菌門(Verrucomicrobia)(0%～13.42%)、SAR406 菌門(0%～0.9%)、Qiime2 未識別菌門(0%～22.8%)以及其他相對豐度過低的門類(0%～10.8%)。

變形桿菌門(Proteobacteria)是本珠江口樣品中豐度最大的菌門, 與 Zhang 等[41]的研究結(jié)果相符。變形桿菌門(Proteobacteria)包括 5 個綱(Class), 1 個未知菌綱, 占變形桿菌門(Proteobacteria)的相對豐度從大到小排序為γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria) (38.3%)、α-變形菌綱(α-Proteobacteria)(36.1%)、β-變形菌綱(β-Proteobacteria)(22.4%)、ε-變形菌綱(ε-Proteobacteria)(1.3%)、δ-變形菌綱(δ-Proteobacteria)(0.97%), 其他未知菌綱占 0.98% (圖5(b))。

圖5 珠江口浮游細菌的細菌組成Fig. 5 Bacteria composition of plankonbacteria of PRE

2.3 核心微生物物種組成

已有報道中對核心 OTU 的定義較為寬泛。Huse 等[42]將人體核心微生物群定義為出現(xiàn)在 95%樣本中的 OTU, Hernandez-Agreda 等[43]; 有研究將珊瑚核心微生物定義為出現(xiàn)在 30%以上樣本中的OTU; Shade 等[44]將在地下水輸送管道中平均豐度大于 1%的微生物屬定義為核心 OTU。結(jié)合已有研究和河口的環(huán)境微生物樣本實際狀況, 并嚴格保證篩選標準, 我們制定如下篩選原則: 總樣品中, 核心 OTU 篩選條件為平均豐度 ≥0.02%, 且樣品出現(xiàn)率≥70%(在 70%的樣品中有豐度值); 分組樣品中,核心 OTU 篩選條件為絕對豐度≥0.02%, 且樣品出現(xiàn)率≥80%。

總樣品中只有otu1,otu2,otu3,otu13和otu14符合標準, 屬于總樣本核心 OTU。核心 OTU 在總樣本中的豐度累計為 9.86%, 且主要分布在中鹽度(19.67%)和高鹽度(11.54%)的樣品中, 低鹽度樣品(0.82%)中幾乎沒有(圖 6(a))。5 種 OTU 均來自細菌中的酸性桿菌門(Actinobacteria)酸微菌綱(Acidimicrobiia)酸微菌目(Acidimicrobiales)的 OCS155 菌科類, 無法繼續(xù)分類(圖 6(b))。其中,otu1為總樣品核心菌科, 屬于未培養(yǎng)的放線菌門 OCS155 科克隆的IMS3D85 16S 核糖體 RNA 基因的部分序列, 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫的序列信息, 該菌可能具有與顆粒附著細菌和自由生活菌的組成相關(guān)的酶功能, 且大多出現(xiàn)在沿海或近海[45]。由圖 6(c)可知, 5 種總樣本核心 OTU 在 3 個鹽度分組中的分布情況較為類似。

在低鹽度 OTU 中, 篩選出 8 個核心 OTU, 均為細菌, 分屬于 3 個門, 5 個綱, OTU 的名字(ID)分別是otu7,otu12,otu24,otu25,otu32,otu38,otu45和otu55, 核心 OTU 在低鹽度總樣本中的豐度為11.67%。其中,otu7(22.41%),otu12(16.48%),otu25(9.93%),otu45(9.18%)和otu55(8.72%)屬于放線菌門,otu24屬于變形桿菌門,otu32和otu32屬于擬桿菌門。豐度最大的otu7屬于放線菌門酸性菌綱酸微菌目 C111 科發(fā)光桿菌屬fluminis種, 出現(xiàn)在所有低鹽度樣本中。

在中鹽度 OTU 中, 篩選出的核心 OTU 分屬 4個門, 比低鹽度多一個藍細菌門, 7 個綱, 5 個已知科。其中, 相對豐度最大的菌科來自酸性桿菌門(Actinobacteria)酸微菌綱(Acidimicrobia)的 OSC115 菌科(77.41%)。

在高鹽度 OTU 中, 篩選出的核心 OTU 分屬 4個門, 7 個綱, 5 個已知科, 相對豐度最大的同樣是OSC115 菌科(52.7%), 豐度比中鹽度組略低。屬于藍細菌的綠藻門(Cholorophyta)相對豐度排第二, 是中鹽度的 10 倍。這兩個科在低鹽度核心 OTU 中均未出現(xiàn)。并且, 在總體樣本上屬于核心 OTU 的菌屬(OSC115)在低鹽度樣本中均未出現(xiàn)(圖 6(d))。在 Beta 多樣性上, 聚類距離相對較近的中鹽度和高鹽度組(圖 3(b)和(c))的核心 OTU 也只有 3 個菌科重復(fù), 其余核心 OTU 均不重復(fù)。

圖6 鹽度分組下各分組核心OTU 的物種組成Fig. 6 Taxonomic composition of core OTUs on salinity groups

2.4 細分鹽度分組下的共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

根據(jù)核心 OTU 的細菌組成可以判斷, 珠江口微生物群落在鹽度分組上具有明顯的差異, 根據(jù)生態(tài)位理念, 我們猜測珠江口浮游細菌在鹽度這一環(huán)境因素的影響下形成特殊的生態(tài)位, 即微生物的“社區(qū)”。因此, 本節(jié)根據(jù) OTU 豐度表和分類學(xué)信息, 結(jié)合低中高鹽度分組, 通過取交、并、補集進一步細分鹽度組, 以便從微生物共存與否的角度觀察生態(tài)位獨立與否。

用隸屬于不同科的 OTUs 構(gòu)建浮游細菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò), 所有數(shù)據(jù)分為 3 個鹽度生態(tài)位組, 分別代表低鹽度、中鹽度和高鹽度樣品。使用 Venn 圖可視化結(jié)果獲得 7 個細分鹽度分組, 分別是 Shared (在低中高鹽度組均存在的 OTU, 75 個)、L/M/H-Only(僅在低、中、高鹽度組中單獨存在的 OTU, 分別有 415, 269 和 189 個)、L-M/H、M-H (僅存在于兩種鹽度中的 OTU, 低–中/高、中–高鹽度組分別有125, 27 和 109 個)(圖 7(a))。結(jié)果表明, Shared 中OTU 較少, 但相對豐度最高(25.59%), 高于其他OTU 數(shù)更大的組; L-H 的 OTU 只有 27 個, 且豐度最少(1.8%)(表 1), 說明低鹽度與高鹽度物種差異較大, 本實驗劃分的鹽度具有較好的區(qū)分性。共存的分組 L-M 和 M-H 的豐度分別為 16.36%和 16.10%,僅次于 Shared, 而 L-Only 不僅具有最多的 OTU 數(shù)(415 個), 還具有較高的相對豐度(12.44%), 表明珠江口水體中大多數(shù)細菌生活在鹽度環(huán)境相對寬泛的生態(tài)位中, 但有相當豐富的浮游細菌只生活在低鹽度環(huán)境下。

表1 細分鹽度分組及其OTU 信息Table 1 Sub-divided salinity groups and its OTU information

圖7 細分鹽度分組共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)分析Fig. 7 Co-occurrence network of Sub-divided salinity groups

共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)模塊可以反映棲息地的異質(zhì)性、系統(tǒng)發(fā)育上親緣關(guān)系較近物種的聚集、生態(tài)位的重疊和物種的共進化, 被認為是系統(tǒng)發(fā)育、進化或功能的獨立單元[34]。珠江口浮游細菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)被劃分成多個模塊, 模塊是網(wǎng)絡(luò)中高度連接的區(qū)域。圖7(b)是基于細分生態(tài)位進行著色; 圖 7(c)是對緊密度模擬計算出的微生物模塊進行著色; 圖 7(d)根據(jù)浮游細菌菌門進行著色, 平均豐度小于 0.22%的菌門歸類到其他組。網(wǎng)絡(luò)圖中每個節(jié)點代表一個 OTU,節(jié)點越大代表“度”越大, “度”是反映該 OTU 與其他 OTU 的連接數(shù)的指標; 網(wǎng)絡(luò)圖中的連線(邊)代表 OTU 之間的相互關(guān)系。圖 7(d)中對“邊”–OTU 的相互關(guān)系進行區(qū)分著色, 紅色表示積極聯(lián)系, 藍色表示消極聯(lián)系。積極聯(lián)系包括互惠互利的共處、互生和共生等促進關(guān)系, 消極聯(lián)系包括競爭、拮抗和捕食等抑制關(guān)系。通過 R 語言 igraph 包[37]和 Gephi軟件[38]構(gòu)建的珠江口浮游細菌網(wǎng)絡(luò)圖的基本參數(shù)如表 2 所示。

表2 細菌共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)參數(shù)Table 2 Topological parameters of co-occurrence network

Shared 是豐度最大的微生物簇, 經(jīng)過低頻篩選,其比例減少至 11.86%, 且?guī)缀踉诰W(wǎng)絡(luò)關(guān)系中看不到緊密聯(lián)系 Shared 組的 OTU, 其在樣品中分布廣, 聯(lián)系松散。而 L-Only 與 Module2、M-Only 與 Module 4、H-Only 與 Module3、L-H 與 Module6 以及部分L-Only 與 Module7 等模塊完全重合, 說明這些物種形成獨立且緊密聯(lián)系的微生物簇。從圖 7(d)可知,每個模塊中, 物種組成復(fù)雜, 緊密的模塊不由單一分類的浮游細菌組成(如 L-Only 模塊中由 Actinobacteria, Cyanobacteria, Procteobacteria, Planctomytcete 及大量其他菌門組成), 這些浮游細菌因為低鹽度這一環(huán)境因素, 在珠江口河口生態(tài)系統(tǒng)中自發(fā)地形成一個多元的微生物“社區(qū)”, 這些物種并非親緣相似, 而是因為鹽度生態(tài)位形成獨立的功能單元。Module1 是豐度最大的模塊, 但由部分 LOnly、L-M 及少量其他細分鹽度組的 OTU 組成的緊密程度比 Module2 松散, 與其他模塊的邊界不清晰。一個共生網(wǎng)絡(luò)中, 積極和消極聯(lián)系應(yīng)該處于平衡狀態(tài)。從圖 7(d)可知, Module1 內(nèi)部的積極聯(lián)系占據(jù)主要地位, 因此 Module1 的度較小, 各個節(jié)點之間聯(lián)系松散(邊較長且邊數(shù)少), 該網(wǎng)絡(luò)不夠穩(wěn)定。由圖 7(b) 可知, Module1 內(nèi)部來自兩個細分鹽度生態(tài)位, 形成重合生態(tài)位, 推測該模塊會因為共生關(guān)系的單一而逐漸分化, 其他緊密聯(lián)系的模塊中積極和消極聯(lián)系的數(shù)量大致處于平衡狀態(tài), 形成具有相對穩(wěn)定生態(tài)位共生群落。珠江口浮游細菌的共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)表明, 本文對鹽度的細分具有科學(xué)意義,珠江口的浮游細菌群落在鹽度上形成內(nèi)部緊密聯(lián)系、親緣關(guān)系復(fù)雜的獨立生態(tài)位。其中, 僅存在低鹽度中的微生物群落形成的網(wǎng)絡(luò)最為緊密, 內(nèi)部共生關(guān)系最為平衡。

3 結(jié)論

本文利用 16s rRNA 基因序列分析, 研究珠江口水域(從珠江下游至入?？?水體中浮游細菌的微生物多樣性以及主要影響的單一環(huán)境參數(shù), 并據(jù)此進行優(yōu)勢菌和核心菌的物種組成分析和共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)分析, 得到如下結(jié)論。

1) 鹽度是影響珠江口浮游細菌多樣性的主要單一環(huán)境參數(shù)。根據(jù) Beta 多樣性聚類, 珠江口水體中浮游細菌在低(0～10‰)、中(10‰～20‰)、高(>20‰)鹽度聚類成 3 個群落, 在這 3 個群落中具有顯著的遺傳多樣性, 其中低鹽度浮游細菌的遺傳多樣性顯著高于中高鹽度。

2) 珠江口浮游細菌的優(yōu)勢菌門依次為變形桿菌 門(Proteobacteria) 、 酸 性 桿 菌 門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和藍菌門(Cyanobacteria)?？倶悠分泻诵木鸀樗釛U菌門的 OCS155, 是一種未培養(yǎng)的細菌。優(yōu)勢菌側(cè)重于數(shù)量多, 核心菌兼具數(shù)量多和分布廣。二者均與研究區(qū)域的主要生態(tài)功能息息相關(guān), 核心菌具有更加全面的意義。

3) 低鹽度中主要的核心菌是 C111, 中高鹽度的核心菌是 OCS11。3 種鹽度中的核心菌具有較少冗余的分類學(xué)特征, 尤其是低鹽度細菌與中高鹽度的核心菌完全不重合。據(jù)此, 本文假設(shè)珠江口浮游細菌因鹽度形成特殊的生態(tài)位, 并進行細分, 通過共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)圖得知, 珠江口浮游細菌在細分鹽度組上形成聯(lián)系緊密的共發(fā)生網(wǎng)絡(luò), 其中, 僅存在于低鹽度的 OTU 緊密度最高。

4) 各個共發(fā)生網(wǎng)絡(luò)模塊聯(lián)系緊密且親緣關(guān)系復(fù)雜, 不同物種分布于不同的模塊, 形成多元的特殊微生物簇, 與生態(tài)位理論中重合生態(tài)位的趨同演化行為相符, 驗證了珠江口浮游細菌在鹽度上形成特殊生態(tài)位的假設(shè)。