吳 鵬，劉 永，李純厚*，肖雅元，王 騰，林 琳，謝雨芳

(1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東 廣州，510300；2. 國家海洋局南海環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，廣東 廣州，510300；3. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(廣州)，廣東 廣州，511458；4.廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510300)

引 言

珠江口是粵港澳大灣區(qū)的核心區(qū)域，也是我國最重要的河口之一。珠江口自然條件優(yōu)越，水產(chǎn)資源十分豐富，對(duì)廣東省的經(jīng)濟(jì)發(fā)展起著重要作用。近40 a隨著珠江沿岸經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，珠江口海域不僅接納了大量毗鄰沿岸地區(qū)直接排放的污水，還接納了各種大小徑流攜帶和珠江口周邊大規(guī)模的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)排放的污染物。此外，珠江口各類船只較多，航運(yùn)繁忙，也是污染物的重要來源[1]。《2018年中國海洋生態(tài)環(huán)境狀況報(bào)告》顯示，珠江口生態(tài)系統(tǒng)近年來處于亞健康狀態(tài)，水體呈富營養(yǎng)化[2]。目前多種持久性有機(jī)污染物和重金屬在珠江口不同環(huán)境介質(zhì)中也被檢測(cè)到，而沉積物是持久性有機(jī)污染物和重金屬主要的“匯”[3-6]。珠江口生態(tài)環(huán)境區(qū)域性差異明顯，從珠江口上游的廣州河段到下游的外伶仃海域的水環(huán)境狀況、沉積物污染物含量、浮游生物和漁業(yè)資源等生物群落結(jié)構(gòu)具有區(qū)域分布的特征[3, 7-10]。在珠江口淡水和海水相互混合作用下，珠江口上游到下游水環(huán)境梯度變化下沉積物微生物分布特征還有待進(jìn)一步研究。

2004年，Wu等[11]利用末端限制性片段長度多態(tài)性分析方法(Terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)發(fā)現(xiàn)珠江口沉積物微生物有9個(gè)類群，并且主要以δ變形菌(Deltaproteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)為主。而后，Sun等[12]基于16S rRNA基因的變形梯度凝膠電泳方法(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)發(fā)現(xiàn)珠江口沉積物優(yōu)勢(shì)菌群為α變形菌(Alphaproteobacteria)，γ變形菌(Gammaproteobacteria)，酸桿菌門(Acidobacteria)和放線細(xì)菌門(Actinobacteria)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，16S rRNA基因擴(kuò)增子的高通量測(cè)序方法被認(rèn)為能更加全面而快捷地反映微生物組成[13]。然而，目前缺乏利用該技術(shù)探討珠江口沉積物微生物群落研究。微生物群落結(jié)構(gòu)也受外界環(huán)境因素的影響，環(huán)境的異質(zhì)性能形成微生物的區(qū)域-分類群單元[14]。針對(duì)珠江口沉積物環(huán)境，研究發(fā)現(xiàn)地理區(qū)域是影響珠江口厭氧氨氧化菌分布的關(guān)鍵因素，而季節(jié)性變化影響不大[15]。對(duì)于珠江口沉積物中的古菌，鹽度、氨氮和有機(jī)碳則發(fā)現(xiàn)是主要影響因素[16]。然而，Sun等[12]采用16S rRNA-DGGE方法發(fā)現(xiàn)總磷、銨鹽、pH和海水鹽度是影響珠江口沉積物微生物分布的主要因素。因此，沉積物營養(yǎng)鹽等環(huán)境因子可影響微生物組成。但是，珠江口沉積物中重金屬和石油類污染廣泛存在，并且這兩類污染物含量在珠江口上游相對(duì)高于下游，重金屬和石油類污染在珠江口也有明顯的區(qū)域差異分布特征[17, 18]。然而，重金屬和石油類等污染物對(duì)珠江口沉積物微生物變化的影響研究還少見報(bào)道。

本研究從珠江口上游到下游選取了梯度環(huán)境變化下的調(diào)查站位14個(gè)，采用16S rRNA基因擴(kuò)增子的高通量測(cè)序方法闡述了珠江口區(qū)域環(huán)境特征差異下微生物群落分布特征，著重探討了重金屬和石油類等理化因子對(duì)沉積物微生物分布的影響。研究結(jié)果為了解珠江口沉積物微生物的區(qū)域分布特征和生態(tài)功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2015年8月從珠江口上游到下游布設(shè)了14個(gè)研究站點(diǎn)(圖1),采集了表層(0～5 cm)沉積物樣品。每個(gè)站點(diǎn)采集沉積物樣品3份，混勻后分裝成2份，于-20℃保存，分別用于沉積物理化因子和微生物群落分析。根據(jù)底層海水鹽度和站位區(qū)域位置，以S1—S4為珠江口上游區(qū)域(鹽度小于2‰)，以S5—S9為珠江口中游區(qū)域(鹽度介于2‰和10‰)，而珠江口下游區(qū)域以S10—S14站(鹽度大于12‰)。

圖1 珠江口沉積物采樣站位

1.2 沉積物理化因子分析

參照海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第5部分：沉積物分析方法(GB17378.5-2007)[19]，有機(jī)碳(TOC)含量采用重鉻酸鉀氧化-還原容量法測(cè)定；石油類(Oil)含量采用紫外分光光度法測(cè)定；重金屬總汞(Hg)和砷(As)含量采用原子熒光法測(cè)定，銅(Cu)、鉛(Pb)、鎘(Cd)、鋅(Zn)和總鉻(Cr)含量采用火焰原子吸收分光光度法測(cè)定；沉積物pH通過PHS-3C型精密pH計(jì)現(xiàn)場測(cè)定。

1.3 宏基因組DNA提取與PCR擴(kuò)增

取1.0 g采集的沉積物按照PowerSoil?DNA Isolation Kit試劑盒(MOBIO，USA)操作方法提取沉積物宏基因組DNA。以提取的沉積物宏基因組DNA為模板，采用微生物16S rRNA基因V4～V5區(qū)的特異性引物515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和907R(5'-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增[20]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)建庫檢測(cè)，將合格的文庫在Illumina HiSeq2500 PE250平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序(北京諾禾致源生物信息科技有限公司)。

1.4 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析

樣品下機(jī)測(cè)序序列截去Barcode和引物序列后，使用FLASH(V1.2.7)對(duì)樣品中的Reads進(jìn)行拼接，得到Raw Tags[21]。拼接得到的Raw Tags經(jīng)過嚴(yán)格的過濾處理[22]得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)(Clean Tags)。Clean Tags按照QIIME(V1.7.0)對(duì)Tags的質(zhì)量控制要求[23]，進(jìn)一步進(jìn)行如下操作：a)Tags截?。簩aw Tags從連續(xù)低質(zhì)量值(默認(rèn)質(zhì)量閾值為≤19)堿基數(shù)達(dá)到設(shè)定長度(默認(rèn)長度值為3)的第一個(gè)低質(zhì)量堿基位點(diǎn)截?cái)啵籦)Tags長度過濾：Tags經(jīng)過截取后得到的Tags數(shù)據(jù)集，進(jìn)一步過濾掉其中連續(xù)高質(zhì)量堿基長度小于Tags長度75%的Tags。經(jīng)過以上處理的Tags通過UCHIME Algorithm(http://www.drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.html)與數(shù)據(jù)庫(Gold database，http://drive5.com/uchime/uchime_download.html)去除其中的嵌合體序，得到Effective Tags。Effective Tags利用Uparse(V7.0.1001)在97%水平上進(jìn)行操作分類單元(Operational taxonomic unit，OTU)聚類分析[24]。選取代表性O(shè)TUs序列，用RDP Classifier方法[25]與SILVA數(shù)據(jù)庫[26]進(jìn)行物種系統(tǒng)進(jìn)化注釋分析。樣品數(shù)據(jù)均一化處理后，使用QIIME軟件(V1.7.0)計(jì)算樣品的香農(nóng)指數(shù)(Shannon)，辛普森指數(shù)(Simpson)，Chao1指數(shù)和覆蓋度(Coverage)[23]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)所有樣品的OTU序列，將相同分類的OTUs信息合并處理后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過R軟件GUniFrac包來計(jì)算樣本間的Unweighted Unifrac距離，再結(jié)合OTU的豐度信息，進(jìn)行主坐標(biāo)分析(Principal coordinate analysis，PCoA)探討珠江口沉積物微生物組成差異。根據(jù)珠江口沉積物各屬微生物的相對(duì)豐度，選取相對(duì)豐度高的前30屬的微生物通過STAMP軟件繪制熱圖，而微生物在珠江口三個(gè)區(qū)域中的組成差異通過One-way ANOVA和Tukey-Kramer方法檢驗(yàn)。通過R軟件采用典范對(duì)應(yīng)分析(Canonical correlation analysis，CCA)珠江口沉積物微生物組成與沉積物理化因子的關(guān)系。所有檢驗(yàn)中，差異顯著為p≤0.05，差異極為顯著為p≤0.01。

2 結(jié)果與討論

2.1 珠江口沉積物理化因子狀況

沉積物pH值在S1站點(diǎn)最低為7.21，而S14站點(diǎn)的pH值最高為8.39，表現(xiàn)為珠江口從上游到下游呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢(shì)(表1)。相反，TOC含量在珠江口上游含量相對(duì)較高，其中S1站點(diǎn)的有機(jī)碳含量最高為1.10%，而靠近外海區(qū)域的S13站點(diǎn)有機(jī)碳含量最低為0.56%(表1)。珠江口沉積物中總汞、砷、銅、鉛、鎘、鋅和總鉻等七類重金屬平均含量分別為0.104，22.1，61.1，46.2，0.35，158和21.7 mg/kg；其分布規(guī)律總體表現(xiàn)為珠江口上游重金屬含量相對(duì)較高，而靠近外海區(qū)域中的重金屬含量較低。與劉解答等[18]的歷史調(diào)查相比較，本次調(diào)查的重金屬含量略低，但重金屬含量的區(qū)域變化一致，從珠江口上游到下游逐漸降低。珠江口沉積物石油類含量的變化范圍為25.9～541.0 mg/kg，平均值為183.8 mg/kg；珠江口上游S1—S4站點(diǎn)的石油類含量(379.0～541.0 mg/kg)相對(duì)高于下游的S10—S14站點(diǎn)(41.6～115.0 mg/kg)(表1)。吳玲玲等[17]調(diào)查發(fā)現(xiàn)2006年、2009年、2010年和2011年珠江口沉積物石油類平均含量分別為127.2，318.0，134.1和118.5 mg/kg。與以往調(diào)查結(jié)果相比較，本次調(diào)查珠江口沉積物中的石油類含量有一定程度的升高，但其分布規(guī)律基本一致，珠江口上游站點(diǎn)的石油類含量要高于珠江口下游。以往研究表明石油類和重金屬的污染水平受珠江口陸源輸入的影響比較大[17-18]。

表1 珠江口沉積物理化因子狀況

2.2 珠江口沉積物微生物群落組成

珠江口沉積物的14個(gè)樣品中獲得Effective reads范圍在52565到66691之間，其中S10站點(diǎn)最少，而S3站點(diǎn)獲得數(shù)量最多。在97%的相似性水平上，各站點(diǎn)獲得的OTUs數(shù)量變化在4181到6787之間，其中S12站點(diǎn)最少，而S3站點(diǎn)最多(表2)。每個(gè)樣品保留45092條Effective reads，在97%的相似性水平上對(duì)OTUs數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理后進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)各樣品Shannon指數(shù)介于9.22和10.58之間，Chao1介于4128和7346之間，而Simpson指數(shù)基本在0.99以上。珠江口中游的Shannon指數(shù)平均值(10.20)相對(duì)高于上游(10.08)和下游(10.05)的區(qū)域。各站點(diǎn)樣品的Chao1指數(shù)基本和OTU數(shù)目相當(dāng)，結(jié)合各樣品的Coverage均達(dá)到95%以上，表明本研究的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)能全面反映珠江口沉積物微生物種類(表2)。

表2 珠江口沉積物微生物的測(cè)序信息和多樣性分析

基于微生物門分類水平分析發(fā)現(xiàn)珠江口沉積物微生物均以變形菌門(Proteobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)兩類為主，該兩類群相對(duì)豐度之和均占總豐度的50%以上。綠彎菌門相對(duì)豐度在S1站點(diǎn)和S7站點(diǎn)要高于變形菌門，而其余站點(diǎn)的變形菌門相對(duì)豐度要高于綠彎菌門。浮霉菌門(Planctomycetes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)類群在各站點(diǎn)中的相對(duì)豐度也較高，分布范圍分別為2.8%～8.5%和1.5%～7.4%。另外，有些微生物類群在特定站點(diǎn)所占比例也較高，S2站點(diǎn)中藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)相對(duì)豐度較高為15.3%，S7站點(diǎn)中泉古菌門(Crenarchaeota)相對(duì)豐度為11.0%(圖2)。分析變形菌門類群中各綱微生物組成發(fā)現(xiàn)，沉積物中以δ變形菌(Deltaproteobacteria)的相對(duì)豐度較高，其次為γ變形菌(Gammaproteobacteria)，但β變形菌(Betaproteobacteria)相對(duì)豐度在珠江口上游的S2—S4站點(diǎn)要明顯高于其余站位(圖2)。本研究采用的高通量測(cè)序方法反映的珠江口沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)，與已報(bào)到的DGGE的測(cè)序方法結(jié)果有所不同。16S rRNA-DGGE方法發(fā)現(xiàn)珠江口沉積物微生物種類以酸桿菌門(Acidobacteria)和變形菌門占優(yōu)勢(shì)，而變形菌門類群中以γ變形菌和α變形菌為主，δ變形菌未檢出[12]。珠江口水體和沉積物中微生物群落也具有較大差別，盡管均采用高通量測(cè)序方法。Mai等[10]發(fā)現(xiàn)珠江口水體生物膜上的微生物以變形菌門類群為主(56.6%)，其中又以α變形菌和γ變形菌為主；隨著海水鹽度的增加，水體環(huán)境中α變形菌相對(duì)豐度增加，而γ變形菌減少。然而，本研究發(fā)現(xiàn)隨著海水鹽度的增加沉積物環(huán)境中γ變形菌相對(duì)豐度增加，而δ變形菌減少。

圖2 門和PROTEOBACTERIA綱分類水平下珠江口沉積物微生物類群相對(duì)豐度組成變化

Unweighted Unifrac PCoA分析發(fā)現(xiàn)位于珠江口上游S1—S4站點(diǎn)的沉積物微生物群落主要聚為一類，位于珠江口中游的S5—S9站點(diǎn)的沉積物微生物群落聚為另一類，其余位于珠江口下游站點(diǎn)的沉積物微生物聚為第三類，PCoA分析可以發(fā)現(xiàn)珠江口沉積物微生物群落分布具有明顯的區(qū)域性(圖3)。珠江口沉積物微生物具有區(qū)域性分布的特征，這與水環(huán)境狀況、沉積物污染物含量、浮游生物和漁業(yè)資源等生物群落結(jié)構(gòu)在珠江口分布呈現(xiàn)區(qū)域性差異的特征相類似[3, 7-10]。因此，有必要加強(qiáng)珠江口沉積物微生物組成的區(qū)域比較研究。

圖3 Unweighted Unifrac PCoA分析珠江口沉積物微生物群落

將珠江口沉積物微生物分為三組(上游、中游和下游)，選取相對(duì)豐度高的前30屬微生物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)三個(gè)區(qū)域中硝化螺旋菌(Nitrospira)、脫硫球菌(Desulfococcus)、厭氧粘細(xì)菌(Anaeromyxobacter)、厭氧繩菌(Anaerolinea)、4-29和LCP-26組成差異極為顯著(p<0.01)，而CandidatusPortiera、BD2-6、脫氯單胞菌(Dechloromonas)、GOUTA19、HTCC、Nitrosopumilus和硫桿菌(Thiobacillus)微生物組成差異有顯著性(p<0.05)。此外，珠江口上游沉積物中硝化螺旋菌、厭氧繩菌、4-29和厭氧粘細(xì)菌相對(duì)豐度較高，而珠江口中游沉積物中LCP-26相對(duì)豐度較高，珠江口下游以脫硫球菌相對(duì)豐度較高。硝化螺旋菌是硝化作用/反硝化作用過程中的關(guān)鍵菌群，厭氧粘細(xì)菌在沉積物Fe和S循環(huán)中發(fā)揮重要作用，在厭氧條件下厭氧繩菌能降解大量的碳水化合物[27-28]。脫硫球菌是硫酸鹽還原菌的重要類群，并介導(dǎo)有機(jī)污染物的降解[29-30]?？梢姡榻诔练e物微生物在沉積物營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)和污染物降解等方面發(fā)揮重要作用。

圖4 珠江口沉積物中前30屬微生物組成

2.3 珠江口沉積物狀況對(duì)微生物群落的影響

典范對(duì)應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)沉積物中Cd和TOC含量對(duì)沉積物微生物影響不明顯(p≥0.05)，珠江口上游沉積物微生物受重金屬(Zn、Hg、Cr、Pb和As等)和石油類含量的影響較大(p<0.05)，而珠江口中游和下游受pH的影響尤為明顯(p<0.05)(圖5)。Sun等[12]也發(fā)現(xiàn)pH是影響珠江口沉積物微生物分布的重要因素之一。pH可直接影響微生物組成，或者通過影響沉積物中重金屬溶解性、有機(jī)碳含量和電導(dǎo)率等理化因子從而間接影響微生物組成[12, 31, 32]。珠江口上游沉積物微生物受重金屬和石油類的影響較大，可能由于沉積物環(huán)境中重金屬和石油類污染程度相對(duì)較高，造成參與相應(yīng)污染物代謝的微生物種類增多有關(guān)。筆者曾發(fā)現(xiàn)多環(huán)芳烴污染在珠江口上游相對(duì)較高，導(dǎo)致相應(yīng)的微生物代謝功能基因也增高[34]。進(jìn)一步分析珠江口沉積物中微生物代謝基因的分布情況，可更好地闡述重金屬和石油類污染物對(duì)微生物群落結(jié)果的影響。

圖5 珠江口沉積物微生物與沉積物理化因子的變化關(guān)系

3 結(jié)論

(1)珠江口上游沉積物重金屬和石油類污染相對(duì)較高。珠江口上游沉積物重金屬(總汞、砷、銅、鉛、鎘、鋅和總鉻)含量要高于珠江口下游和中游，石油類含量在珠江口的分布規(guī)律與重金屬分布趨勢(shì)相一致；石油類和重金屬的污染水平受陸源輸入的影響比較大。

(2)珠江口沉積物微生物多樣性豐富。珠江口沉積物中微生物Effective reads變化范圍為52565～66691，而Shannon指數(shù)為9.22～10.58；珠江口沉積物微生物以變形菌門和綠彎菌門兩類為主，其次為浮霉菌門和擬桿菌門；在變形菌門類群中，沉積物以δ變形菌相對(duì)豐度最高，γ變形菌次之；沉積物中存在大量的微生物參與營養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)和污染物降解等過程。

(3)珠江口沉積物微生物區(qū)域分布具有差異性。珠江口中游沉積物微生物Shannon指數(shù)相對(duì)高于珠江口其余兩區(qū)域；珠江口上游的β變形菌相對(duì)豐度要高于珠江口下游區(qū)域，而γ變形菌相對(duì)豐度反之；珠江口上游沉積物中硝化螺旋菌屬、厭氧繩菌屬、4-29和厭氧粘細(xì)菌屬相對(duì)豐度較高，而珠江口中游沉積物中LCP-26相對(duì)豐度較高，珠江口下游以脫硫球菌屬相對(duì)豐度較高。

(4)珠江口上游沉積物微生物群落受重金屬(鋅、總汞、總鉻、鉛和砷)和石油類的影響較大，而下游的微生物受pH影響更明顯。