陳露珠，施文正,2，汪之和,2,3*

(1.上海海洋大學 食品學院，上海 201306；2.國家淡水水產品加工技術研發(fā)分中心(上海)，上海 201306；3.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306)

南極磷蝦Euphausiasuperba作為一種豐富的海洋生物資源，殼體中含有大量的甲殼素。殼聚糖(chitosan,CS)是甲殼素脫乙酰化后的產物，是天然存在的唯一堿性多糖。目前，商品化CS的來源主要是蝦蟹殼。南極磷蝦殼薄柔軟，處理方便，相比從其他蝦類中提取甲殼素所需的時間更短，效率更高[1-3]。因此，南極磷蝦殼可以作為CS制備的有效來源。

由于CS在中性pH條件下基本不溶于水，限制了其應用，因此，水溶性CS成為國內外學者的研究熱點。孟祥君[4]以CS為原料，氯乙酸為羧甲基試劑，油酸為?；噭?，制備出羧甲基油酸殼聚糖，兩者在pH中性及堿性條件下都是可溶的。Wang等[5]也制備出了比CS具有更好水溶性的O-季銨化殼聚糖。羧甲基殼聚糖(carboxymethyl chitosan，CMC)是CS醚化改性后的重要產品之一，具有比CS更好的生物活性(抗氧化性等)和性能(阻氧、保濕、透氣和成膜性等)[6-8]。目前，國內外對CMC的研究非常廣泛。郭睿等[9]以CS和氯乙酸為原料，合成了CMC，但所需制備時間為7 h，耗時較長。鄭絲柳等[10]利用廢棄淡水龍蝦殼，采用兩步加堿法制備CMC，以二甲亞砜代替異丙醇作為反應溶劑，雖然產物取代度有所提高，但是耗時較長，操作繁瑣。Muzzarelli等[11]以乙醛酸為羧甲基化試劑制得了N-CMC，但乙醛酸成本較高，且其后處理條件苛刻。CMC制備的方法較多，但是存在制備時間長、操作繁瑣等缺點。

利用微波輔助法制備CS衍生物近年來備受學者關注，與常規(guī)加熱相比，該方法不僅可以將反應速率提高幾個數(shù)量級，而且可以顯著減少所需的試劑量，從而減少產生的廢液量[12]。Liu等[13]用微波輔助法在水溶液中制備了季銨鹽CMC，其羧甲基基團和季銨鹽基因分別為0.82和0.48，合成過程減少了有機溶劑的使用，表明微波輔助法是一種快速合成水溶性CS衍生物的方法。本研究中，以南極磷蝦蝦殼作為試驗原料，采用微波輔助法代替?zhèn)鹘y(tǒng)水浴加熱方法制備CMC，并通過單因素和正交試驗對羧甲基化過程進行工藝優(yōu)化，分析反應過程中各因素對產物取代度的影響，通過紅外光譜(FTIR)和掃描電鏡(SEM)對南極磷蝦CS和CMC進行了結構表征分析，并對其水溶性和抗氧化能力進行比較，以期為進一步研究南極磷蝦CMC的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：試驗用冷凍南極磷蝦購自遼寧省大連海洋漁業(yè)集團公司，貯存在超低溫冰箱(-80 ℃)中。

試劑：NaOH、鹽酸、異丙醇、無水乙醇、甲醇、硫酸亞鐵、水楊酸、氯乙酸、30%過氧化氫、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)均為分析純；總抗氧化能力檢查試劑盒(FRAP法)為上海碧云天生物技術有限公司產品。

儀器：MM721NG1-P1150美的微波爐(中國美的集團)、H2050R 臺式高速冷凍離心機(湘儀離心機儀器有限公司)、JB-1A 型磁力攪拌器(上海精密科學儀器有限公司)、雙列四孔恒溫水浴鍋(上?；厶﹥x器制造有限公司)、pH計(梅特勒-托利多儀器有限公司)、DZF-6050型真空干燥箱(上?；厶﹥x器制造有限公司)、Nicolet 6700傅立葉紅外光譜儀和Hitachi S-3400N掃描電子顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 殼聚糖的制備

甲殼素提取：將貯存在-80 ℃冰箱內的南極磷蝦流水解凍，通過碾壓法人工剔除蝦肉，將蝦殼于60 ℃下烘干，用豆?jié){機粉碎2 min，得到蝦殼粉。稱取10.00 g南極磷蝦蝦殼粉，加入100 mL 5% HCl溶液(均為體積分數(shù)，下同)，在室溫下反應1 h后用蒸餾水洗滌至中性。然后加入100 mL 4% NaOH溶液(均為質量分數(shù)，下同)，在100 ℃下反應1 h后用蒸餾水洗滌至中性。將得到的甲殼素于60 ℃下烘干。

CS制備：稱取5.00 g甲殼素于坩堝中，加入50 mL的45% NaOH溶液，放置在電加熱板上加熱，加熱溫度為110 ℃，時間為3 h。反應完畢后將所得CS用蒸餾水洗滌至中性，于60 ℃下真空干燥烘干。采用烏氏黏度計法測定CS分子量，采用酸堿滴定法測定脫乙酰度[14]。得到的CS黏均相對分子質量約為3 63 200，脫乙酰度為90%以上。

1.2.2 微波輔助法制備羧甲基殼聚糖的單因素試驗 CMC的制備過程：采用兩步加堿法制備CMC。稱取5.00 g CS后加入60 mL異丙醇，在室溫下溶脹1 h后加入一定量的40% NaOH溶液于30 ℃下攪拌1 h,然后再加入一定量的50%氯乙酸-異丙醇溶液(均為體積分數(shù)，下同)，設定一定的微波功率和微波時間，待微波加熱后再次加入相同量的40% NaOH溶液，在50 ℃條件下反應1 h后，用鹽酸溶液調節(jié)pH至7.0，以10 000 r/min離心5 min，取上清液后用無水乙醇使CMC沉淀析出，然后用甲醇多次洗滌后于60 ℃下真空干燥，即得南極磷蝦CMC。

微波功率和微波時間單因素試驗：以5.00 g CS為原料，在微波功率540 W、微波時間20 min、40% NaOH溶液總用量87.5 mL(每次加入43.25 mL)、50%氯乙酸-異丙醇溶液用量40 mL條件下，固定其中3個因素，分別進行不同微波功率、微波時間對所制備的南極磷蝦CMC取代度的影響試驗，其中，微波功率設置為120、230、385、540、700 W，微波時間設置為10、15、20、25、30 min。

NaOH溶液、氯乙酸-異丙醇溶液用量單因素試驗：以5.00 g CS為原料，在微波功率540 W、微波時間25 min、40% NaOH溶液總用量100.0 mL(每次加入50.0 mL)、50%氯乙酸-異丙醇溶液用量40 mL條件下，固定其中3個因素，分別進行不同40% NaOH溶液用量、50%氯乙酸-異丙醇溶液用量對所制備的南極磷蝦CMC取代度的影響試驗，其中，40% NaOH溶液總用量設置為62.5、75.0、87.5、100.0、112.5 mL(分兩次加入)，50%氯乙酸-異丙醇溶液用量設置為20、30、40、50、60 mL。

1.2.3 制備CMC的正交試驗 根據(jù)單因素試驗結果，采用4因素3水平正交試驗。以正交試驗優(yōu)化后的最佳微波輔助工藝條件制備CMC進行驗證試驗，并以傳統(tǒng)水浴加熱輔助工藝(60 ℃、3 h)作為對照。

1.2.4 CMC取代度(DS)的測定 采用電位滴定法進行測定[15]，即用0.1 mol/L HCl標準溶液溶解CMC，配制成質量分數(shù)為1%的CMC-HCl溶液，再用0.1 mol/L NaOH標準溶液進行滴定，在滴定的同時測定溶液pH，根據(jù)下式計算CMC取代度：

A=(V2-V1)c/m,

(1)

DS=0.203A/(1-0.058A)。

(2)

其中：m為樣品質量(g)；c為NaOH標準溶液濃度(mol/L)；V1、V2分別為pH為2.1和4.3時滴定所消耗的NaOH標準溶液的體積(mL)；A為樣品中羧甲基物質的量(mmol/g)；每個乙酰氨基葡萄糖殘基的物質的量為0.203 mmol，每毫克當量的羧甲基質量為0.058 g。

1.2.5 南極磷蝦CMC結構表征分析

1) 傅立葉紅外光譜的測定。采用KBr壓片法，對CS和CMC進行測定。將KBr與樣品按1∶100進行混合并研磨均勻，光譜掃描在波數(shù)4000～400-1內，分辨率為4 cm-1，掃描32次。

2) 掃描電鏡觀察。采用掃描電子顯微鏡觀察CS和CMC的表面結構。將樣品放入真空干燥箱烘干(105 ℃，8 h)后噴金，低真空模式下分別在100倍、1 000倍和2 000倍的全景下觀察。

1.2.6 南極磷蝦CMC性能分析

1)水溶性能測定。用0.1 mol/L的HCl和NaOH溶液調整水溶液pH為3～12，將樣品溶解在不同pH的水溶液中制成5 mg/mL的樣品。用紫外可見分光光度計測定溶液在600 nm處的透射率[16]。對于每個測試樣品，構建透射率隨pH的變化曲線。以蒸餾水的透射率為對照，當透射率小于90%時，認為樣品是不溶的。

2)抗氧化能力測定。

清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的測定：參考Brand-Williams等[17]的方法測定南極磷蝦CS和CMC清除DPPH自由基的能力。

清除羥基(·OH)自由基能力的測定：通過Fenton反應，測定南極磷蝦CS和CMC清除羥基自由基的能力。具體步驟參考劉紅莉[18]的方法。

總抗氧化能力的測定：采用總抗氧化能力試劑盒(FRAP法)測定南極磷蝦CS和CMC的總抗氧化能力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個試驗重復3次，試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(mean±S.D.)表示。采用 Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)，采用SPSS 23軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Duncan法進行組間多重比較，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 微波輔助制備南極磷蝦CMC工藝優(yōu)化試驗

2.1.1 單因素試驗結果 從圖1(a)可見：隨著微波功率的增加，CMC的取代度隨之上升；當微波功率為700 W時，CMC的取代度達到最大，為0.80，而微波功率為540 W時CMC取代度為0.79，且與微波功率為700 W時CMC取代度變化無顯著性差異(P>0.05)。故本試驗條件下，微波功率為540 W時較佳。

標有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。

從圖1(b)可見：CMC的取代度隨著微波時間的增加呈先升高后下降趨勢(P<0.05)；當微波時間為25 min時CMC取代度最大(0.78)。故本試驗條件下，微波時間為25 min時最佳。

從圖1(c)可見：隨著40% NaOH溶液總用量的增加，CMC的取代度呈先上升后下降的趨勢；當40% NaOH溶液總用量為100 mL時，CMC的取代度最高(0.77)。故本試驗條件下，40% NaOH溶液總用量為100 mL時最佳。

從圖1(d)可見：隨著50%氯乙酸-異丙醇溶液用量的增加，CMC的取代度呈先升高后下降的趨勢；當50%氯乙酸-異丙醇溶液用量為50 mL時，CMC取代度達到最大(0.84)，且與50%氯乙酸-異丙醇溶液用量為40 mL的CMC取代度(0.79)無顯著性變化(P>0.05)。故本試驗條件下，50%氯乙酸-異丙醇溶液用量為40 mL時較佳。

2.1.2 正交試驗結果 根據(jù)單因素試驗結果，設置正交試驗的4因素3水平如表1所示，正交試驗結果和方差結果如表2、3所示。

從表2可見，微波功率、微波時間、40% NaOH溶液用量和50%氯乙酸-異丙醇溶液用量4因素對CMC取代度的影響大小依次為C(40% NaOH溶液用量)>D(50%氯乙酸-異丙醇溶液用量)>B(微波時間)>A(微波功率)，正交優(yōu)化后的最優(yōu)提取條件為 A2B3C2D2， 即微波功率540 W，微波時間30 min，40% NaOH溶液總用量100 mL，50%氯乙酸-異丙醇溶液用量為40 mL。從表3可見，4個因素的P值均為0.000，說明微波功率、微波時間、40% NaOH溶液用量和50%氯乙酸-異丙醇溶液用量對CMC取代度均具有極顯著影響(P<0.01)。

表2 CMC正交試驗結果

表3 CMC的方差分析表

為驗證正交試驗結果的準確性，在最佳提取條件下進行3次微波輔助制備CMC試驗，結果顯示，CMC平均取代度為0.95。而在相同40% NaOH溶液用量和50%氯乙酸-異丙醇溶液用量條件下，采用傳統(tǒng)水浴加熱(對照)制備的CMC取代度僅為0.68。相比傳統(tǒng)的水浴加熱，微波輔助制備CMC的方法效率更高，制備的CMC的取代度也更高。

2.2 南極磷蝦CMC的結構表征分析

2.2.1 紅外光譜分析 從圖2可見：在南極磷蝦CS圖譜中，3 440 cm-1處具有強吸收峰，這個峰是-OH和-NH2的特征吸收峰，可以反映出-OH和-NH2分子內和分子間氫鍵[19]；南極磷蝦CS在1 660 cm-1處有吸收峰，這與α-CS的酰胺Ⅰ的特征峰一致；南極磷蝦CS的酰胺譜帶Ⅱ和Ⅲ分別在1 616、1 328 cm-1處，說明從南極磷蝦殼中提取的CS是α-CS[20]。

從圖2還可見：與南極磷蝦CS的紅外光譜相比，南極磷蝦CMC在3 450 cm-1處的吸收峰變尖銳，說明南極磷蝦CS分子的羥基和氨基上發(fā)生了羧甲基化反應[21]；南極磷蝦CMC分別在1 602、1 427 cm-1處的峰分別對應于羧基的不對稱和對稱的伸縮振動；南極磷蝦CS在1 592 cm-1的氨基吸收帶，羧甲基化以后消失，出現(xiàn)了新的1 602 cm-1的酰胺振動峰，這是羧基的不對稱伸縮振動，這說明取代反應發(fā)生在氨基上[20]；位于1 025 cm-1處的CS的C6-OH吸收帶消失，而位于1 086 cm-1的C3-OH沒有發(fā)生變化，說明O-位取代主要發(fā)生在C6-OH上[22]。以上結果說明，微波輔助法制備的南極磷蝦CMC為N，O-CMC。

圖2 南極磷蝦CS和CMC的紅外光譜圖

2.2.2 掃描電鏡分析 圖3顯示了不同電鏡放大倍數(shù)下南極磷蝦CS和CMC的表面形貌，當放大100倍時，南極磷蝦CS呈現(xiàn)片狀(圖3A)，當放大2 000倍時，發(fā)現(xiàn)CS表面光滑，但是有明顯的層狀和微纖維結構(圖3C)；當放大100倍時，南極磷蝦CMC呈現(xiàn)粒狀，與CS的片狀結構不同(圖3D)，當放大倍數(shù)增加時，發(fā)現(xiàn)CMC的表面呈現(xiàn)疏松多孔的形態(tài)，孔隙很多，孔徑更小(圖3E、F)。說明南極磷蝦CS在羧甲基化的過程中晶體結構發(fā)生變化[23]，因此，南極磷蝦CMC能更好地溶于水，并且也賦予其更多的性能。

圖3 南極磷蝦CS和CMC的掃描電鏡圖

2.3 南極磷蝦CMC的性能測試

2.3.1 水溶性能 從圖4可見：當pH≤6時，南極磷蝦CS的透射率接近100%，說明南極磷蝦CS在酸性條件下具有較好的溶解性能；但當pH≥6.5時，CS溶液開始渾濁，此時透射率也逐漸下降，尤其當pH為7～12時，CS溶液開始出現(xiàn)絮狀沉淀，此階段的透射率在20%左右，說明南極磷蝦CS在中性和堿性溶液中不溶解。

從圖4還可見：當pH為3時，南極磷蝦CMC的透射率僅為0.84%，說明此時CMC完全沉淀；當pH≥4時，CMC的透射率一直保持在90%以上，總體來說，南極磷蝦CMC具有良好的水溶性能。這說明，相比南極磷蝦CS，南極磷蝦CMC的溶解范圍更廣。

圖4 pH對CS和CMC溶液透射率的影響

2.3.2 抗氧化能力 從圖5(a)可見：隨著濃度的增加，CS和CMC對DPPH的清除能力都在增強，呈現(xiàn)正相關的趨勢；當CMC質量濃度為1 mg/mL時，對DPPH的清除能力比CS強，但是當質量濃度大于1 mg/mL后，CMC對DPPH的清除能力比CS弱。從圖5(b)可見：CMC對羥基自由基的清除能力比CS要好，兩者均隨著質量濃度的增加，清除率顯著提升(P<0.05)；樣品質量濃度由1 mg/mL增加到2 mg/mL時，CS和CMC的清除率均迅速增加，當質量濃度為2 mg/mL以后，兩者的清除率增加速率趨于平緩。從圖5(c)可見：CMC的總抗氧化能力遠遠高于CS；隨著質量濃度的升高，CMC的總抗氧化能力迅速增加(P<0.05)，而CS的總抗氧化能力始終較低。

3 討論

3.1 制備工藝對CMC取代度的影響

微波功率和時間是微波輔助方式的重要參數(shù)。

標有不同字母者表示不同濃度間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。

本研究表明，隨著微波功率的增大，CMC取代度逐步上升，至540 W后CMC取代度上升趨勢逐漸趨于平衡，這可能是因為隨著微波功率變大，加熱速率逐漸提高，使得反應物分子熱運動加劇，-OH和-NH2與羧甲基之間的反應速率亦增加，進而促使產物的取代度得以增加[24]。微波處理時間越長，CMC取代度逐漸增大，直到25 min后出現(xiàn)拐點并開始呈下降趨勢，這可能是因為隨著反應時間延長，使CS分子得到充分溶脹，其中-OH和-NH2能夠得到完全伸展，可以更全面地與羧甲基接觸，羧甲基化反應隨之增多，故產物的取代度增大。但是若繼續(xù)延長反應時間，CS可能會發(fā)生降解，同時副反應速度加快，反而會使取代度下降。這與王永娟等[25]的研究結果一致。Ge等[26]的研究也有相似結果，即微波時間在20 min后，繼續(xù)加熱并沒有使產物的取代度有顯著性的提高。

在微波輔助法制備南極磷蝦CMC的過程中，需要加入一定量的40% NaOH溶液和50%氯乙酸-異丙醇溶液進行反應。在反應體系中加入100 mL 40% NaOH溶液總用量時，CMC取代度達到最大值，而后逐漸下降，這是因為CS在堿化過程中，隨著40% NaOH溶液用量的增大，CS活性中心增多，產物取代度也相應提高。但是當40% NaOH溶液用量超過一定限度時，會促使副反應發(fā)生，使CMC的取代度有所降低。這與紀淑娟等[27]的研究結果一致，而在保持NaOH用量一定時，則CS在堿化過程中形成的活性中心一定，當50%氯乙酸-異丙醇溶液用量增加時，所提供的羧甲基增多，發(fā)生的羧甲基化反應也隨之增加，從而使CMC的取代度增加。但是，當50%氯乙酸-異丙醇溶液用量超過一定限度時，反應的堿性體系被破壞，發(fā)生副反應，反而使羧甲基化反應減少，亦導致CMC取代度隨之下降。洪燕平[28]和楊軍勝等[29]的研究也有類似結果。

3.2 CMC的水溶性和抗氧化性

用微波輔助法制備南極磷蝦CMC與傳統(tǒng)加熱法制備的最大區(qū)別在于由微波加熱處理代替?zhèn)鹘y(tǒng)水浴加熱，在提高CMC制備效率的同時，也大大提高CMC取代度。本試驗中在最優(yōu)工藝條件下制得的CMC取代度為0.95，比傳統(tǒng)水浴加熱工藝制得的CMC取代度提高了30%左右，而微波輔助法的制備速率也比傳統(tǒng)水浴法提高了86%左右。

為了提高產品的適用性、實用性及操作性，往往希望所制備的CS和CMC在更大的酸堿范圍內均具有良好的水溶性。本試驗中所制備的南極磷蝦CMC在pH為4～12時均具有良好的水溶性，在pH低于4時CMC完全沉淀，表現(xiàn)出極差的水溶性，這可能是因為CMC為兩性電解質，具有等電點，在等電點附近時，CMC難溶解并形成白色絮狀沉淀[30]。本試驗中制備的N,O-CMC在中性和堿性的水溶液中溶解性明顯優(yōu)于CS。黃強等[31]的研究也有類似結論。

就實際應用而言，往往要求CS及其衍生物產品具有較強的抗氧化性。本試驗表明，CMC質量濃度與對DPPH自由基的清除能力呈正相關，這是因為CS和CMC中的活性氨基和羥基提供的氫可以與DPPH結合，從而達到清除DPPH的目的。因此，CS和CMC質量濃度越高提供的氫越多，對DPPH自由基清除率就越強。這與劉歡等[32]的研究結果相似。本研究中，CS及CMC隨著質量濃度的增加, 其抗氧化活性顯著增加，但是質量濃度大于1 mg/mL后，CMC對DPPH的清除能力比CS弱。有研究表明，CMC對DPPH的清除能力與其取代度成反比關系，取代度越大，對DPPH的清除率越低，這是因為CMC氨基和羥基位置引入羧甲基之后，其活性基團不易暴露出來[33]，因此，抗氧化活性變弱。本研究中，CMC對于羥基自由基清除能力比CS較好?？赡苁且驗镃S的 N2-O6和O3-O5分子內氫鍵鍵能很高，使CS分子結合相對緊密, 會降低氨基基團和羥基基團與外界反應的活性[34]，從而導致CS顯示出較弱的抗氧化性。本研究中，CMC的總抗氧化能力好于CS，可能是因為羧甲基基團的加入，使得活性氨基和羥基的電子云密度增大[35]，有利于CMC與自由基的反應，從而達到增強總抗氧化的作用。吳迪等[33]通過試驗，比較N,O-CMC和CS的體外抗氧化能力，結果表明，N,O-CMC對羥基自由基的清除能力和總抗氧化能力優(yōu)于CS，與本研究結果一致。

4 結論

1) 微波輔助法制備南極磷蝦CMC是一種省時高效的制備方法，比傳統(tǒng)水浴加熱工藝制得的CMC取代度提高30%，制備速率也大幅提高。

2) 南極磷蝦CMC具有良好的水溶性，而南極磷蝦CS僅在弱酸條件下有較好的水溶性。

3) 南極磷蝦CMC的羥基清除能力和總抗氧化能力均優(yōu)于南極磷蝦CS，但DPPH自由基的清除能力CMC略差。

綜合表明，本試驗制備的南極磷蝦CMC是一種具有良好水溶性的抗氧化劑，具有一定的實際應用價值。