李維政，寧忠雄，梁 赫，路 偉

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/棉花教育部工程研究中心/自治區(qū)農(nóng)林有害生物監(jiān)測與安全防控重點實驗室，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】丁布是玉米、小麥等禾本科作物中特有的次生代謝物質(zhì)(DIMBOA、2,4-二羥基-7-甲氧基-1,4-苯并噁嗪-3-酮)[1，2]。棉鈴蟲是一種雜食性的害蟲，玉米是新疆地區(qū)棉鈴蟲的重要寄主植物之一，運用丁布作為標(biāo)記物，通過分析蟲體內(nèi)丁布的含量，對判斷棉鈴蟲取食的寄主植物來源有實際意義。【前人研究進展】劉小紅等[3]采取HPLC-MS方法測定多個玉米品種幼苗中丁布含量，丁布回收率大約為99.97%。宋鵬飛等[4]利用HPLC方法對多種在生產(chǎn)上已經(jīng)推廣使用的玉米品種檢測丁布含量，11個玉米品種葉片中都含有丁布，但不同玉米品種之間丁布含量存在顯著性差異。李曉輝等[5]利用高效液相色譜方法對各種玉米品類黃化苗進行了丁布含量檢測，所有玉米品類黃化苗的丁布含量均顯著?！颈狙芯壳腥朦c】目前丁布殘留分析的文獻報道較少。目前丁布在蟲體內(nèi)的殘留分析報道較少，多集中于玉米等禾本科植物樣本中丁布的分析，新疆地區(qū)棉鈴蟲寄主植物主要有棉花、玉米、小麥等，小麥只有部分生長期與棉花重合，其作為庇護所的作用較為有限[6]。而玉米能夠在時間和空間上為棉鈴蟲提供有效的產(chǎn)卵場所，能誘集棉鈴蟲成蟲產(chǎn)大量的卵，成為最適宜的庇護所作物[7]。目前丁布殘留分析的前處理步驟較為繁瑣復(fù)雜，大多采用液相色譜法檢測，檢測蟲體內(nèi)的丁布含量需要靈敏度更高的儀器才能實現(xiàn)。研究對比2種前處理方法對丁布含量的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】比較2種不同的前處理方式，用Waters UPLC-MS/MS (Xevo TQS質(zhì)譜)檢測丁布的含量，建立一種UPLC-MS/MS測定棉鈴蟲體內(nèi)丁布含量的分析方法，為丁布在快速殘留分析提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

Waters的UPLC-MS/MS(Waters Xevo TQS質(zhì)譜)，Xinyi-2020樣品快速研磨儀(浙江寧波市新藝超聲設(shè)備有限公司)、小型冷凍離心機、AL204型電子天平(德國梅特勒)、KQ5200DE型超聲波儀(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)。

丁布標(biāo)準(zhǔn)品(98%，上海市吉至生化科技有限公司)；甲醇、甲酸、冰乙酸均為色譜純(賽默飛世爾科技公司)，超純水用Milli-Q IQ 7010超純水儀(上海默克化工技術(shù)有限公司)制備，液氮。

供試棉鈴蟲飼養(yǎng)于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所養(yǎng)蟲室，每頭棉鈴蟲樣品分別裝入1 mL離心管中，-20℃保存。

1.2 方 法

1.2.1 提取

采取2種前處理方法提取，方法1參考Glauser等[8]，方法2參考張曉影等[9]。

方法1：將棉鈴蟲樣品去除翅膀，在盛有液氮研缽中將蟲體研磨成粉末，研磨期間要保證研缽中有液氮，研缽需提前預(yù)冷。將棉鈴蟲粉末轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，加入2 mL含有0.5%甲酸的甲醇-水(50∶49.5，v/v)提取液，充分渦旋震蕩，每個離心管中放入10個直徑為1 mm的鋼珠，使用數(shù)字研磨儀30 Hz下提取2 min。樣品在4℃條件下14 000 r/min離心4 min，移液槍將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管，用甲醇定容至2 mL，過0.22 μm濾膜，貯存于HPLC棕色進樣瓶中，-20℃保存。

方法2：將棉鈴蟲樣品去除翅膀，在盛有液氮的研缽中將蟲體研磨成粉末，研磨期間要保證研缽中有液氮，研缽需提前預(yù)冷。將棉鈴蟲粉末轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，每管加入500 μL甲醇，室溫下超聲提取30 min后，樣品在4℃條件下14 000 r/min離心4 min，移液槍將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管，在殘渣中再加入500 μL提取液，4℃條件下14 000 r/min離心4 min，合并2次離心的上清液，用甲醇定容至2 mL，過0.22 μm濾膜，貯存于HPLC棕色進樣瓶中，-20℃保存。

1.2.2 丁布系列濃度溶液的配制

準(zhǔn)確稱取丁布標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜純甲醇配制成10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，用色譜純甲醇逐級稀釋為5、10、20、50、100 μg/L 5個梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

將5、10、20、50、100 μg/L 5個梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液按照色譜質(zhì)譜條件檢測，以儀器響應(yīng)值的峰面積為縱坐標(biāo)，丁布的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算丁布的線性回歸方程。

采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在不含丁布的棉鈴蟲空白樣品中，添加5、50 μg/L兩種濃度的丁布標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度重復(fù)5次，測定丁布添加回收率。

1.2.3 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1×50 mm、1.7 μm)。采用Waters UPLC-MS/MS (Waters Xevo TQS質(zhì)譜)，電噴霧離子化源(ESI)、多重反應(yīng)模式(MRM)，正噴霧模式進行測定。流動相A為純水(含0.5%冰乙酸)，B為甲醇。脫溶劑氣溫度和流速為650℃和800 L/Hr；毛細管電壓為3.0 kV。表1，表2

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure of mobile phase

表2 丁布多重反應(yīng)監(jiān)測條件(MRM)Table 2 Multiple reaction monitoring conditions of DIMBOA

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系

研究表明，在5～100 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，丁布的峰面積(y)與濃度(x)線性關(guān)系，回歸方程為y=283.435x+121.274，相關(guān)系數(shù)r為0.999 1。表3，圖1

2.2 準(zhǔn)確度和精密度比較

研究表明，在5 μg/L添加水平下，2種方法棉鈴蟲樣品中丁布的平均添加回收率分別為52.32%±7.67%、84.26%±2.70%。在50 μg/L添加水平下，2種方法的平均添加回收率分別為29.38%±4.65%、96.78%±9.12%。方法2準(zhǔn)確度和精密度優(yōu)于方法1，丁布峰型及響應(yīng)值均較好，最低檢測濃度為5 μg/L。圖2，表3

表3 棉鈴蟲體內(nèi)丁布添加回收率Table 3 Recovery rate of DIMBOA in Helicoverpa armigera

3 討 論

Larsen等[10]采用丙酮提取玉米幼苗中的丁布，樣品需低溫冷凍、勻漿混合，再添加Amberlite XAD-7非離子聚合吸附劑，再用大量丙酮淋洗，洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后用二氯甲烷定容，該方法的提取步驟繁瑣、時間較長。劉保川等[11]用乙醚萃取法提取玉米苗中的丁布，3次萃取后還需要用氯仿-甲醇(95∶5，v/v)、純氯仿等多步重結(jié)晶來分離丁布，純化步驟較多。劉小紅等[3]用勻漿機將玉米苗搗碎，用無水乙醚將提取液萃取3次，再分別用無水硫酸鈉和和無水氯化鈣除去丁布提取液中殘余水分，濃縮蒸干后用甲醇定容。李曉輝等[5]在玉米苗樣品中加少許蒸餾水勻漿，用0.1 mol/L磷酸溶液酸化，將酸化液12 000 r/min離心15 min，上清液用乙醚萃取多次后旋蒸，甲醇定容。Li等[12]簡化了前人的提取步驟，將玉米苗冷凍磨碎，用乙酸乙酯溶液直接萃取，將有機箱蒸干，殘余物用丙酮-己烷混合溶液重結(jié)晶后，即可得到丁布。

Glauser等[8]和張曉影等[9]2種前處理方法提取丁布，添加回收率實驗表明，發(fā)現(xiàn)方法2(甲醇超聲提取)優(yōu)于方法1(甲醇-水混合溶液振蕩提取)，在5、50 μg/L 2個添加水平下，方法1的添加回收率均小于70%，方法2在2個水平下的添加回收率分別為在50 μg/L添加水平下，甲醇超聲提取法的平均添加回收率分別為84.26%、96.78%，符合化合物殘留分析的要求。方法2丁布峰型及響應(yīng)值均較好，靈敏度優(yōu)于HPLC的最低檢測濃度。

4 結(jié) 論

對比甲醇超聲提取和甲醇-水混合溶液振蕩提取丁布的方法，甲醇超聲提取法的添加回收率均介于80.42%～110.13%，滿足化合物殘留分析的要求。棉鈴蟲樣品在低濃度5 μg/L、高濃度50 μg/L 2個添加水平下，甲醇超聲提取法的添加回收率最佳，平均添加回收率分別為84.26%、96.78%，最低檢測質(zhì)量濃度為5 μg/L。前處理方法安全、便捷、快速，檢測方法穩(wěn)定、分離效果高。