顧姍姍 鄧紅霞 沈志森

頭頸鱗癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）占頭頸部腫瘤的90%以上，是第六大常見的惡性腫瘤，全球每年的新發(fā)病例和死亡病例分別超過89萬和45萬[1-2]。盡管近年來外科手術(shù)及放化療等多種治療手段有了很大進(jìn)步，但HNSCC的5年生存率仍僅約50%，超過70%的患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的復(fù)發(fā)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[3-4]。HNSCC是一種異質(zhì)性上皮腫瘤，與抽煙、飲酒有密切相關(guān)性[5]。HNSCC的發(fā)病過程較為復(fù)雜，涉及到多個(gè)分子與細(xì)胞的相互作用；且由于其涉及部位多，目前尚缺乏理想的特異性生物標(biāo)志物。篩選HNSCC相關(guān)基因有望為其診治提供新思路，為其診斷和預(yù)后提供候選的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)下調(diào)因子8（neural precursor cellexpressed developmentally down regulated 8，NEDD8）是一種類泛素蛋白，最早發(fā)現(xiàn)于小鼠大腦中，其含有81個(gè)氨基酸，與泛素分子結(jié)構(gòu)最為接近，同源性達(dá)到60%[6-7]。NEDD8參與蛋白類泛素化修飾，在調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子活性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和腫瘤發(fā)生等生命活動(dòng)中起重要作用。既往研究表明，NEDD8在肺癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤中異常表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后判斷密切相關(guān)[8]。但NEDD8基因在HNSCC中的潛在生物標(biāo)志物價(jià)值尚不明確。微陣列和RNA測序技術(shù)的進(jìn)步為生物醫(yī)學(xué)研究提供了大量數(shù)據(jù)。本研究通過癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和多種公共數(shù)據(jù)庫探索HNSCC患者NEDD8基因的表達(dá)、突變和生物學(xué)功能情況，預(yù)測其在HNSCC中的預(yù)后價(jià)值，以期為HNSCC預(yù)后判斷和治療新靶點(diǎn)選擇提供參考。

1 材料和方法

1.1 檢索Oncomine數(shù)據(jù)庫 Oncomine（www.oncomine.org）數(shù)據(jù)庫包含715個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集和86 733個(gè)樣本，是全球最大的癌基因芯片數(shù)據(jù)庫和數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)[9]。本研究利用該數(shù)據(jù)庫比較NEDD8在HNSCC組織和正常組織中的表達(dá)；以改變倍數(shù)閾值＞1.5，基因排序?yàn)榍?0%，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 檢索UALCAN數(shù)據(jù)庫 UALCAN數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu/）是一個(gè)TCGA數(shù)據(jù)庫在線分析和挖掘的網(wǎng)站，其基于TCGA基因表達(dá)數(shù)據(jù)提供基因在不同腫瘤亞群中的表達(dá)，如性別、年齡、腫瘤分期等，也提供基因生存分析、相關(guān)性分析和DNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化數(shù)據(jù)分析[10]。本研究通過UALCAN數(shù)據(jù)庫分析HNSCC中NEDD8的表達(dá)及其與HNSCC臨床病理參數(shù)的關(guān)系，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫 基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析GEPIA 數(shù)據(jù)庫（http://gepia.cancer-pku.cn/）是北京大學(xué)開發(fā)的用于癌癥和正?；虮磉_(dá)譜分析的公共數(shù)據(jù)庫，包括9 736個(gè)腫瘤樣本和8 587個(gè)正常樣本的RNA測序表達(dá)數(shù)據(jù)[11]。本研究通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析NEDD8在HNSCC中的生存預(yù)后評估價(jià)值。

1.4 Kaplan-Meier Plotter分析 采用Kaplan-Meier Plotter（http://kmplot.com/analysis/）在線分析不同NEDD8基因表達(dá)水平HNSCC患者的總生存期（overall survival，OS）和無復(fù)發(fā)生存期（relapse-free survival，RFS）[12]。分別根據(jù)NEDD8基因中位表達(dá)水平將HNSCC患者分為高表達(dá)和低表達(dá)兩組，采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線評估OS和RFS。

1.5 檢索cBioPortal數(shù)據(jù)庫 cBioPortal數(shù)據(jù)庫（http://www.cbioportal.org）是一個(gè)可視化和分析多維癌癥基因組數(shù)據(jù)的綜合性開放平臺(tái)，目前包含245項(xiàng)癌癥研究[13]。本研究利用該平臺(tái)中488例HNSCC患者的基因表達(dá)信息，分析NEDD8基因突變率和患者生存預(yù)后情況。

1.6 檢索LinkedOmics數(shù)據(jù)庫LinkedOmics（http://linkedomics.org）是一個(gè)含有TCGA 32種癌癥多組學(xué)數(shù)據(jù)的公共平臺(tái)，包括 LinkFinder、LinkInterpreter、LinkCompare 3個(gè)分析模塊[14]。本研究利用該平臺(tái)的LinkFinder模塊研究TCGA HNSC隊(duì)列（520例）中NEDD8相關(guān)的差異表達(dá)基因，使用Pearson相關(guān)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。然后使用LinkInterpreter模塊對差異基因進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 通路富集分析。假陽性發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05，模擬1 000次。

2 結(jié)果

2.1 NEDD8 mRNA在HNSCC組織中的表達(dá)情況 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，NEDD8 mRNA在乳腺癌、頭頸部腫瘤、淋巴瘤等腫瘤中高表達(dá)，而在前列腺癌和白血病等腫瘤中低表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1（插頁）。同時(shí)，在HNSCC 6個(gè)分析結(jié)果中，NEDD8 mRNA均是高表達(dá)（均P＜ 0.05），見表1。

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫常見腫瘤組織中神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)下調(diào)因子8（NEDD8）mRNA的表達(dá)情況

表1 Oncomine數(shù)據(jù)庫NEDD8 mRNA在HNSCC中表達(dá)的差異

通過UALCAN數(shù)據(jù)庫對520例TCGA中HNSCC樣本驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)NEDD8 mRNA的表達(dá)水平顯著高于正常組織（P＜0.05），見圖2a。在基于疾病分期、腫瘤分級、淋巴轉(zhuǎn)移分期、患者性別、年齡、種族的亞組分析中，HNSCC患者的NEDD8 mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），見圖2b-g。此外，TP53突變的HNSCC患者較TP53不突變患者有著較高的NEDD8 mRNA表達(dá)量（P＜0.05），見圖2h。因此，NEDD8可能是HNSCC潛在的生物標(biāo)志物。

圖2 神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)下調(diào)因子8（NEDD8）mRNA在頭頸鱗癌（HNSCC）組織中的差異表達(dá)

2.2 NEDD8 mRNA表達(dá)與HNSCC患者預(yù)后的關(guān)系分析 采用GEPIA數(shù)據(jù)庫和Kaplan-Meier Plotter雙重驗(yàn)證NEDD8 mRNA表達(dá)與HNSCC患者預(yù)后的關(guān)系。GEPIA數(shù)據(jù)庫顯示，高表達(dá)NEDD8 mRNA的HNSCC患者OS偏短[P＜0.05，見圖3a（插頁）]，無病生存期更短[P＜0.05，見圖 3b（插頁）]。Kaplan-Meier Plotter在線分析結(jié)果顯示，同樣NEDD8 mRNA高表達(dá)組的患者OS顯著短于低表達(dá)組[P＜0.05，見圖 3c（插頁）]，而 NEDD8 mRNA表達(dá)與HNSCC患者的RFS未見無明顯相關(guān)[P＜0.05，見圖 3d（插頁）]。這提示 NEDD8 mRNA 表達(dá)與HNSCC的預(yù)后相關(guān)，高表達(dá)的患者預(yù)后較差。

圖3 不同神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)下調(diào)因子8（NEDD8）mRNA表達(dá)水平頭頸鱗癌（HNSCC）患者生存曲線比較（a、b：GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析；c、d：Kaplan-Meier Plotter在線分析）

2.3 NEDD8突變與HNSCC預(yù)后的關(guān)系分析 基于cBioPortal數(shù)據(jù)庫分析HNSCC測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，488例HNSCC患者中NEDD8基因發(fā)生改變28例，突變率為6%，主要表現(xiàn)為mRNA上調(diào)、擴(kuò)增、深度缺失等，見圖4a（插頁）。然而，生存曲線圖和log-rank檢驗(yàn)顯示，NEDD8基因突變與HNSCC患者OS[見圖4b（插頁）]、無進(jìn)展生存期[見圖 4c（插頁）]或無病生存期[見圖 4d（插頁）]均無關(guān)（均P＞0.05）。

圖4 神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)下調(diào)因子8（NEDD8）在頭頸鱗癌（HNSCC）中的突變和生存分析

2.4 HNSCC中NEDD8共表達(dá)基因的GO和KEGG通路分析 使用LinkedOmics數(shù)據(jù)庫分析TCGA中520例HNSCC患者的mRNA測序數(shù)據(jù)?；鹕綀D中用t檢驗(yàn)分析NEDD8與HNSCC差異表達(dá)基因之間的聯(lián)系，見圖5a（插頁）。熱圖分別顯示50個(gè)與NEDD8顯著正相關(guān)或負(fù)相關(guān)的基因（P＜0.05），見圖 5b、c（插頁）。其中NEDD8 表達(dá)與 MRPL52（r=0.8666）、RPL36AL（r=0.8184）、DAD1（r=0.8041）表達(dá)均呈正相關(guān)（均 P＜0.05），見圖5d、e、f（插頁）。GO通路分析顯示與NEDD8相關(guān)的差異表達(dá)基因主要參與翻譯延伸、線粒體呼吸鏈復(fù)合體組裝和蛋白折疊等，見圖5g（插頁）；KEGG通路分析顯示，其在核糖體、蛋白運(yùn)輸和嘧啶代謝等方面富集，見圖5h（插頁）。此外，GO和KEGG通路分析得出了與NEDD8相關(guān)且最重要的前4個(gè)激酶、miRNA和轉(zhuǎn)錄因子靶網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果表明對激酶靶點(diǎn)、miRNA靶點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄因子靶點(diǎn)基因集富集得分貢獻(xiàn)最大的基因成員數(shù)分別是絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、GTGCCTT、MIR-506、TTGTTT_V$FOXO4_01，見表2。

圖5 LinkOmics數(shù)據(jù)庫分析頭頸鱗癌（HNSCC）中神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)下調(diào)因子8（NEDD8）共表達(dá)基因（GO為基因本體論；KEGG為京都基因與基因組百科全書）

表2 HNSCC中NEDD8的激酶、miRNA和轉(zhuǎn)錄因子靶點(diǎn)

3 討論

NEDD8最早于1992年在小鼠腦組織中被發(fā)現(xiàn)，通過類泛素化過程與底物蛋白共價(jià)結(jié)合，調(diào)控其生物性質(zhì)。類泛素化修飾最具特征的底物是cullin家族蛋白，它是CRLs E3泛素復(fù)合體的骨架蛋白[19]。NEDD8也可與許多非 cullin 蛋白底物結(jié)合，如 p53、p73、BCA3、VHL，趨化因子受體CXCR5等[20-21]。因此，NEDD8在細(xì)胞定位、調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子活性和增加蛋白穩(wěn)定性等方面起重要作用。研究表明NEDD8的過表達(dá)及類泛素化的異常激活與人類多種腫瘤、炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。值得注意的是，在肺腺癌和鱗狀細(xì)胞癌中，NEDD8通路的大多數(shù)酶都被過度激活，且與患者不良預(yù)后呈顯著相關(guān)[22]。但是，目前關(guān)于NEDD8在HNSCC中的作用還未明確。因此，本研究利用生物信息學(xué)分析NEDD8在HNSCC中的表達(dá)、患者臨床病理特征和預(yù)后價(jià)值，以期為今后HNSCC的調(diào)控機(jī)制和精準(zhǔn)治療研究提供指導(dǎo)。

本研究通過Oncomine數(shù)據(jù)庫挖掘NEDD8在常見腫瘤中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在HNSCC中高表達(dá)。再次用UALCAN數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)NEDD8的表達(dá)量顯著高于正常組織，且與患者臨床腫瘤分期、病理腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期等顯著相關(guān)。生存曲線結(jié)果表明高表達(dá)NEDD8的HNSCC患者OS顯著縮短，HNSCC患者預(yù)后不良，提示NEDD8可能是一個(gè)促癌基因。此外，進(jìn)一步檢索488例HNSCC組織RNA測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NEDD8基因在HNSCC中的變異率較低，且變異類型以mRNA上調(diào)為主，但其變異與否與患者預(yù)后無明顯相關(guān)性。通過LinkedOmics數(shù)據(jù)庫探索頭頸鱗癌中NEDD8共表達(dá)基因，并用GSEA進(jìn)行富集分析，GO分析顯示與NEDD8相關(guān)的差異表達(dá)基因主要參與翻譯延伸、線粒體呼吸鏈復(fù)合體組裝和蛋白折疊等；KEGG通路分析顯示，其在核糖體、蛋白運(yùn)輸和嘧啶代謝等方面富集。隨后，本研究用富集分析目標(biāo)基因集，確定了重要的目標(biāo)激酶、miRNAs和轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)NEDD8在HNSCC中與MAPK1、HCK、MAPK3和ATM激酶相關(guān)，這些激酶調(diào)控腫瘤信號(hào)通路、細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期。研究表明，過表達(dá)miR-506通過下調(diào)轉(zhuǎn)錄抑制因子SNAI2來抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移[23]，這為臨床了解癌癥的發(fā)生、發(fā)展提供了思路。

綜上所述，本研究通過挖掘常見數(shù)據(jù)庫，初步明確了NEDD8基因在HNSCC的表達(dá)、變異情況及其預(yù)后診斷價(jià)值。本研究的結(jié)論基于轉(zhuǎn)錄水平得出，后續(xù)筆者團(tuán)隊(duì)將進(jìn)一步在蛋白水平上對NEDD8的表達(dá)及功能進(jìn)行驗(yàn)證，探究NEDD8調(diào)控頭頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展的作用機(jī)制，為頭頸鱗癌的預(yù)后判斷和治療新靶點(diǎn)提供理論參考。