張 悅 張朋朋 孟慶金 董 鵬 楊彩玲 王學南 張 鵬 田世民,

瑪咖是十字花科獨行菜屬一年生或兩年生草本植物，原產(chǎn)于秘魯，是南美洲安第斯山地區(qū)常用的藥食兩用植物之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，瑪咖中存在多種活性物質，包括嗎卡多糖、瑪咖生物堿、瑪咖芥子油苷、瑪咖黃酮等，具有增強免疫力、緩解體力疲勞、抗氧化、抗腫瘤、抗骨質疏松、降血糖及神經(jīng)保護等功效[2]。黃芪屬植物在我國超過200余種，是我國傳統(tǒng)的中藥材，主要活性成分有黃酮、三萜及生物堿等，具有抗菌、炎癥抑制、抗氧化、降脂、免疫調節(jié)、抑制腫瘤細胞增殖等功效[3]。沙苑子是豆科植物扁莖黃芪干燥成熟的種子，也是我國傳統(tǒng)的中藥材，主要含有有黃酮、三萜、氨基酸等活性成分，具有護肝降脂、提高免疫力、抗氧化、耐疲勞等作用[4，5]。女貞子是女貞屬植物的果實，最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中有記載，女貞屬植物主要含有主要含有萜類、苯乙醇類、黃酮類等成分，具有抗氧化、免疫調節(jié)、降血糖、降血脂、抗病毒、抗炎及保肝等功效[6]。黃精為百合科黃精屬多年生草本植物的干燥根莖，是我國傳統(tǒng)中藥材，含有黃精多糖、皂苷、生物堿、黃酮、蒽醌類化合物、氨基酸、微量元素等多種活性物質，具有免疫調節(jié)、抗疲勞、降血糖、降血脂、抗氧化、改善記憶、抗腫瘤等多種功效[7，8]。

復合瑪咖片以瑪咖粉、黃芪提取物、沙苑子提取物、女貞子提取物、黃精提取物為主要原料制備的片劑保健食品，具有緩解體力疲勞功效。本研究按照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》對復合瑪咖片進行安全性評價，為其作為保健食品的食用安全性提供實驗依據(jù)。

1.實驗材料

1.1 受試物 復合瑪咖片，規(guī)格：0.5g/片×60片/瓶，人體推薦食用方法及食用量：口服，每日2次，每次3片。

1.2 實驗動物及菌株 SPF級ICR小鼠、SD大鼠均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016—0011。動物飼養(yǎng)管理條件：溫度20～26℃，濕度40%～70%，光照12h明暗交替。動物飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，許可證號：SCXK(京)2014—0010。本單位實驗動物使用許可證號：SYXK(京)2016—0011。鼠傷寒沙門菌株TA100購買自廣東省微生物菌種保藏中心，TA97a、TA98、TA102購買自MOLTOX公司。

1.3 主要儀器與試劑 血液分析儀(雅培CELL-DYN3700)，全自動生化儀(東芝TBA-120FR)，電子天平(Sartorius BS 223S，Sartorius BSA2202s-cw，METTLER ME203E/02)，離心機，顯微鏡(奧林巴斯CX31)，石蠟切片機，脫水機等。

肝S9購買自MOLTOX公司，批號：3745；敵克松(Dexon)購自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，批號：40709；疊氮鈉(SA)購自Amresco公司，批號0639；2-氨基芴(2-AF)購自Sigma公司，批號：AG310001；1,8-二羥基蒽醌(1,8-DHQ)購自ACROS公司，批號：A0248756；環(huán)磷酰胺(CP)購自Sigma公司，批號：WXBC4021V。

2.實驗方法

2.1 急性毒性實驗 選用20只健康小鼠，雌雄各半，體重18～22g，采用最大耐受劑量法(MTD)進行實驗。實驗前禁食不禁水16h，給受試物當日標記、稱重，稱取受試物7.5g，加適量去離子水充分混懸后定容至25ml，采用24h內(nèi)兩次經(jīng)口灌胃，灌胃間隔4h，單次灌胃體積為30ml/(kg·BW)，合計灌胃劑量為18.0g/(kg·BW)。末次灌胃2h后給予飼料；灌胃后0.5h、2h觀察，其后每天觀察1次、連續(xù)觀察14天，記錄動物中毒表現(xiàn)和死亡情況。

2.2 Ames實驗 采用經(jīng)鑒定符合要求的組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102四個菌株進行實驗。實驗設置5個劑量組，終劑量濃度依次為62μg/皿、185μg/皿、556μg/皿、1667μg/皿、5000μg/皿。采用平板摻入法：在頂層瓊脂(2ml，45℃)中依次加入0.1ml供試菌液、0.1ml受試物溶液，需代謝活化時另加入0.5mlS9混合液，充分混勻后迅速傾入底層培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48h后計數(shù)每皿回變菌落數(shù)。每個劑量設置3個平行皿，整個實驗在相同條件下開展2次。

2.3 骨髓細胞微核實驗 選用50只健康小鼠，體重25～30g，隨機分為5組，雌雄各半。實驗設置3個劑量組，按照一次最大灌胃劑量設置高劑量為6.0g/(kg·BW)，中劑量為3.0g/(kg·BW)，低劑量為1.5g/(kg·BW)，受試物以去離子水為溶劑，按20ml/(kg·BW)灌胃。采用30h兩次給予受試物法，即間隔24h兩次經(jīng)口灌胃，第二次給予受試物后6h，脫頸處死動物，取股骨骨髓用小牛血清稀釋后涂片，甲醇固定，Giemsa染色。顯微鏡檢，計數(shù)每只動物200個紅細胞(RBC)中嗜多染紅細胞數(shù)(PCE)，計算所占比例；每只動物計數(shù)1000個嗜多染紅細胞中微核細胞數(shù)，其微核發(fā)生率以千分率計。實驗同時設置溶劑對照組、環(huán)磷酰胺陽性對照組[60mg/(kg·BW)]。

2.4 小鼠精子畸形實驗 選用25只健康雄性小鼠，體重25～35g，隨機分為5組。實驗設置3個劑量組，按照一次最大灌胃劑量設置高劑量為6.0g/(kg·BW)，中劑量為3.0g/(kg·BW)，低劑量為1.5g/(kg·BW)，受試物以去離子水為溶劑。按20ml/(kg·BW)灌胃，連續(xù)5天經(jīng)口灌胃，首次給予受試物后第35天，脫頸處死動物，取雙側附睪放入生理鹽水中，剪碎，四層擦鏡紙過濾，取濾液涂片，甲醇固定，2%伊紅染色。顯微鏡檢，每只動物計數(shù)1000個精子，并計算精子畸形發(fā)生率，以千分率計。

2.5 30天喂養(yǎng)實驗 選用SD大鼠80只，體重60～80g，隨機分為4組，每組20只，雌雄各半，1.25g/(kg·BW)、2.5g/(kg·BW)、5.0g/(kg·BW)，相當于人體推薦劑量的25倍、50倍、100倍，另設溶劑對照組，連續(xù)經(jīng)口灌胃30天喂養(yǎng)。實驗期間每周稱量動物體重1次，攝食2次，并計算動物增重及食物利用率。連續(xù)喂養(yǎng)30天后，過夜禁食16h后稱重、麻醉，腹主動脈采血，進行血常規(guī)和血生化測定，并對動物進行大體解剖及組織病理學檢查。

2.6 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。微核率和精子畸形率使用χ2檢驗進行分析，其他各指標均使用單因素方差分析(ANOVA)進行分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3.結果

3.1 急性毒性實驗 受試物以18.0g/(kg·BW)的劑量經(jīng)口灌胃給予雌、雄性ICR小鼠，連續(xù)觀察14d，動物糞便、體毛、活動正常，動物體重變化未見異常，實驗期間未見其他明顯的動物中毒癥狀和死亡。結果表明該受試物對雌、雄性ICR的急性經(jīng)口毒性最大耐受劑量(MTD)大于18.0g/(kg·BW)。

3.2 遺傳毒性實驗

3.2.1 Ames實驗：各處理組平板背景菌苔未見異常。受試物各劑量組回變菌落數(shù)均未超過未處理對照菌落數(shù)2倍，不同劑量組間無劑量-反應關系，兩次結果一致；在加和不加S9條件下，均未見受試物對TA97a、TA98、TA100、TA102四株菌有致突變作用。

3.2.2 骨髓細胞微核實驗：由表1可見，受試物各劑量嗜多染紅細胞(PCE)與紅細胞百分比未少于溶劑對照組的20%，表明受試物在實驗劑量下無明顯細胞毒性；受試物各劑量組的微核發(fā)生率與溶劑對照組相比，均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；提示該受試物對小鼠骨髓細胞無致微核作用。

表1 受試物對小鼠骨髓微核發(fā)生率的影響

3.2.3 小鼠精子畸形實驗：由表2可見，與溶劑對照組相比，受試物各劑量組均未見精子畸形發(fā)生率有統(tǒng)計學差異(P>0.05)，提示受試物對小鼠無致精子畸形作用。

表2 受試物對小鼠精子畸形發(fā)生率的影響

3.3 30天喂養(yǎng)實驗

3.3.1 受試物對大鼠體重、攝食的影響：不同劑量連續(xù)經(jīng)口灌胃SD大鼠30天，雌、雄性大鼠的周體重和攝食量逐周增加，周體重增重與周食物利用率逐周減少(表3)，由此說明大鼠體重與攝食量成正相關，大鼠的體重與食物利用率成負相關。與對照組相比，雄性動物中劑量組第4周動物平均體重較輕，表現(xiàn)出統(tǒng)計學差異(P<0.05)。受試物各劑量組各周攝食量、周平均食物利用率與對照組相比，均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

表3 受試物對大鼠體重、攝食的影響

3.3.2 受試物對大鼠血液生化指標的影響：雌性動物低劑量組動物白細胞計數(shù)較對照組偏高，高劑量組白細胞其他分類較對照組偏低，均表現(xiàn)出統(tǒng)計學差異(P<0.05)；雄性動物低劑量組紅細胞計數(shù)及淋巴細胞較對照組有所升高，中性粒細胞較對照組偏低，均表現(xiàn)出統(tǒng)計學差異(P<0.05，P<0.01)，其他各指標在不同劑量組與對照組間比較，均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，結果見表4。雌性動物受試物低劑量組血糖較對照組偏低，并表現(xiàn)出統(tǒng)計學差異(P<0.05)，其他各指標在不同劑量組與對照組間比較，均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，結果見表5。

表4 受試物對大鼠血常規(guī)的影響

續(xù)表4

表5 受試物對大鼠血液生化學指標的影響

3.3.3 大體解剖及組織學病理檢查：大鼠大體解剖肉眼觀察，高劑量組雄性1例動物可見睪丸萎縮，其余各劑量組肝、腎、脾、胃腸、睪丸或卵巢臟器未見明顯異常，取對照組和高劑量組雌性及雄性動物相關組織進行病理學檢查。對照組有雌性1例、雄性2例，高劑量組有雌性2例、雄性2例肝細胞索之間和(或)匯管區(qū)偶見輕微的灶性單核細胞浸潤，該病變屬SD大鼠常見的自發(fā)性改變；另外對照組雌性1例，高劑量組雌性2例發(fā)生輕微脂肪性變。高劑量組1例動物睪丸萎縮，鏡檢可見生精上皮層次減少，生精小管未見成熟精子，間質細胞增生，被膜增厚。腎臟、脾臟、胃、十二指腸、卵巢均未見異常。

4.結論

本研究對以瑪咖粉、黃芪提取物、沙苑子提取物、女貞子提取物、黃精提取物為主要原料制備的保健食品復合瑪咖片進行了毒理學研究，急性毒性實驗結果顯示該受試物對ICR小鼠的急性經(jīng)口毒性最大耐受劑量(MTD)大于18.0g/(kg·BW)，屬于實際無毒級。Ames實驗、骨髓細胞微核實驗、小鼠精子畸形實驗結果均為陰性，顯示本實驗條件下該受試物無遺傳毒性。30天喂養(yǎng)實驗結果表明，受試物復合瑪咖片各劑量組實驗期間雌、雄性動物生長狀況良好，未見受試物對動物體重、增重及食物利用率產(chǎn)生不良影響，個別指標差異無劑量-反應關系，結合臨床觀察及病理診斷結果綜合分析，不認為有生物學意義。未見受試物對動物血液學、血生化相關指標產(chǎn)生不良影響，個別指標差異無劑量-反應關系，指標檢測結果均在本實驗室歷史對照范圍內(nèi)，結合臨床觀察及病理診斷結果綜合分析，不認為有生物學意義。大體解剖檢查，各劑量組動物均未見臟器明顯異常，不認為受試物對被檢臟器濕重、臟體比產(chǎn)生不良影響，個別指標差異無劑量-反應關系，指標檢測結果均在本實驗室歷史對照范圍內(nèi)，結合臨床觀察及病理診斷結果綜合分析，不認為有生物學意義。組織病理學檢查，未見被檢臟器存在與受試物相關的組織病理學改變。本研究結果顯示，復合瑪咖片在本實驗條件下未見明顯的毒性作用，為復合瑪咖片作為保健食品的進一步開發(fā)提供毒性實驗依據(jù)。