張?zhí)鞄?，?坤，王偉明

(黑龍江省中醫(yī)藥科學院·黑龍江 哈爾濱 150036)

變應性鼻炎(allergic rhinitis, AR)又稱過敏性鼻炎，是IgE介導的、由多種免疫細胞及相關細胞因子參與的鼻黏膜慢性炎癥反應性疾病，以反復發(fā)作的鼻癢、噴嚏、流清涕、鼻塞為主要癥狀[1]。在中醫(yī)學中，變應性鼻炎被稱為“鼻鼽”，是由于人體的肺、脾、腎三臟虧虛，使正氣不足、腠理開泄、營衛(wèi)不固，此時風寒之邪更加容易侵襲人體，使得寒氣壅滯，陽氣不疏而致[2]。研究表明Th1/Th2/Th17細胞免疫失衡是AR發(fā)病的重要機制[3-5]。芪風固表顆粒是黑龍江省中醫(yī)藥科學院自主研發(fā)的中藥新藥，由黃芪、防風、炒白術、刺五加、麥冬和五味子6味中藥組成，臨床用于治療肺、脾、腎虛弱所致的慢性咳嗽，是治療表虛不固易感病癥的有效藥物。本研究旨在探究芪風固表顆粒對AR大鼠Th1/Th2/Th17細胞免疫平衡的影響，以進一步明確芪風固表顆粒治療AR的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級健康成年雄性SD大鼠60 只，6～8 周齡，體質量200～220 g，購于哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物學部，實驗動物飼養(yǎng)于SPF級鼠房中，飼養(yǎng)環(huán)境光照適度，潔凈度及通風良好，溫度為(23±2)℃，濕度50%～70%。

1.2 實驗藥物 芪風固表顆粒：由本院制劑室提供，發(fā)明專利號：CN1325098，批準文號：國藥準字B20020410，批號：20200377；地氯雷他定干混懸劑：海南普利制藥股份有限公司，生產批號：2002070。

1.3 試劑 卵清白蛋白：合肥博美生物科技有限責任公司；氫氧化鋁：天津市天力化學試劑有限公司；IFN-γ ELISA試劑盒：南京建成生物工程研究所；IL-4試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；IL-17試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司。

1.4 儀器 BP211D型精密分析天平：Sartorius公司；DH5000型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒儀器有限公司；Thermo Fisher Scientific型冷凍高速離心機：賽默飛世爾科技有限公司；KQ-300DB型數控超聲儀：昆山市超聲儀器有限公司；MS3型旋渦混勻器：德國IKA公司；MDF-382E9(N)型超低溫冰箱：日本SANYO公司；iMark酶標儀：美國Bio-rad；光學顯微鏡：北京普瑞賽司儀器有限公司。

2 方法

2.1 模型建立及分組給藥 50 只大鼠用0.3 mg卵清白蛋白加30 mg Al(OH)3混于1 mL生理鹽水中，在兩周內隔日1 次腹腔注射進行基礎致敏；從第15 天開始進行鼻腔激發(fā)，強化致敏，每側鼻孔各滴入50 μL濃度為100 mg/L的卵白蛋白溶液，每天滴鼻，連續(xù)7 d。造模大鼠末次鼻腔致敏后30 min內觀察大鼠打噴嚏、撓鼻、抓臉、鼻溢等癥狀，通過計分進行模型成功與否判定，總分>5 分表示模型建立成功[6]。將模型建立成功的大鼠隨機分為模型組、陽性對照組和芪風固表顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10 只。另取10 只健康大鼠為正常對照組，腹腔注射和鼻腔滴入等量生理鹽水。陽性對照組予地氯雷他定(0.45 mg/kg)灌胃；芪風固表顆粒低劑量組、中劑量組、高劑量組予2.5、5.0、10.0 g/kg芪風固表顆粒灌胃，每日1 次，連續(xù)灌胃14 d；正常組、模型組大鼠灌胃等體積蒸餾水。

2.2 觀察指標

2.2.1 鼻黏膜組織病理學觀察 末次給藥治療24 h后，切取鼻黏膜，置于10%甲醛溶液中固定保存24 h后，蒸餾水沖洗，用乙醇梯度脫水處理，2 次二甲苯透明處理，浸蠟，石蠟包埋，切片機切片，置于清潔載玻片上，60 ℃恒溫箱烘片，隨后脫蠟、HE染色、脫水，中性樹膠封片。光學顯微鏡觀察鼻黏膜組織病理變化，并收集病理圖片。

2.2.2 血清IFN-γ、IL-4、IL-17含量測定 ELISA測定。在末次灌胃24 h后，將大鼠稱重，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥固定，暴露腹腔，進行腹主動脈采血，靜置2 h后3 000 r/min離心10 min，取上清液，分裝后于-80 ℃冰箱凍存。ELISA測定血清IFN-γ、IL-4、IL-17含量，按試劑盒說明書依次配置試劑標準品、清洗孔板、加樣、覆膜、洗板、加顯色劑終止液、酶標儀讀取吸光度(OD)值，代入標準曲線，乘以稀釋倍數，即得大鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-17含量。

2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件進行數據分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠鼻黏膜組織病理學觀察 模型組大鼠鼻黏膜細胞可見明顯腫脹及大量嗜酸性粒細胞浸潤。與模型組比較，陽性對照組、芪風固表顆粒中劑量組及高劑量組大鼠鼻黏膜細胞腫脹減輕，嗜酸性粒細胞浸潤減少；芪風固表顆粒低劑量組大鼠鼻黏膜細胞腫脹及嗜酸性粒細胞浸潤與模型組無異。正常組未見黏膜細胞腫脹及嗜酸性粒細胞浸潤，見圖1。

圖1 各組大鼠鼻黏膜組織病理學觀察(HE，×200)

3.2 各組大鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-17含量比較 見表1。

表1 各組大鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-17含量比較

4 討論

中醫(yī)將過敏性鼻炎稱之為“鼻鼽”，是由于肺、脾、腎三臟虧虛使人體正氣不足，腠理開泄，此時風寒之邪更易侵入人體，使得寒氣壅滯，陽氣不疏而導致的。芪風固表顆粒具有益氣固表、健脾補肺益腎之功效，這與中醫(yī)對過敏性鼻炎病因病機認識高度契合。芪風固表顆粒中黃芪甘微溫，補中氣以益肺氣，實衛(wèi)氣而固表，白術甘溫，益氣健脾，二藥相須為用益肺健脾固表；麥冬甘微寒，養(yǎng)陰清熱，潤肺生津，五味子酸甘，配黃芪則補固正氣，伍麥冬則養(yǎng)陰、斂肺止咳；防風辛甘微溫，走表而祛風邪；刺五加甘溫，補腎益肺，納氣平喘。諸藥合用，氣陰同治，有潤有斂，補斂合法，補中兼疏，散中兼收，共奏益氣固表、滋陰益肺、健脾益腎之功。本文觀察結果表明，AR模型組大鼠鼻黏膜細胞出現(xiàn)明顯的病理損傷，且較正常大鼠血清IFN-γ含量顯著降低，IL-4、IL-17含量顯著增高，表明Th1/Th2/Th17細胞免疫失衡可能是AR發(fā)病的重要因素，且該發(fā)現(xiàn)與Song ZY等[13]發(fā)現(xiàn)的IFN-γ水平降低，IL-4、IL-17水平增高現(xiàn)象相一致。與AR模型組大鼠比較，陽性對照組、芪風固表顆粒中劑量組及芪風固表顆粒高劑量組大鼠病理損傷情況均減輕，且陽性對照組大鼠血清IFN-γ含量顯著增高，IL-4、IL-17含量顯著降低，芪風固表顆粒高劑量組大鼠血清IFN-γ含量顯著增高、IL-4、IL-17含量顯著降低，芪風固表顆粒中劑量組大鼠血清僅IL-4、IL-17含量顯著降低，芪風固表顆粒低劑量組無顯著變化；芪風固表顆粒高劑量的調節(jié)作用與陽對藥地氯雷他定相當。表明芪風固表顆粒能夠調節(jié)AR大鼠的Th1/Th2/Th17細胞免疫紊亂，恢復免疫平衡，其作用與其劑量相關，且在一定劑量范圍內，呈劑量依賴性。

綜上所述，芪風固表顆粒可通過調節(jié)Th1/Th2/Th17細胞免疫平衡以減輕AR大鼠病理損傷;芪風固表顆?？捎行е委熥儜员茄祝{節(jié)Th1、Th2、Th17細胞分化是其部分作用機制。