尤紅俊，趙倩倩，任淑婷，壽錫凌，刁佳宇，董夢雅

（1.陜西省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西西安 710068；2.空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院臨床免疫科，陜西西安 710032；3.西安交通大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院，陜西西安 710061）

炎癥性心肌病是與心力衰竭密切相關(guān)的心肌炎癥性病變[1]。大量研究表明，其發(fā)病機制涉及病毒感染、免疫、遺傳和環(huán)境等多個方面，且預后不佳[2]。因此，研究其發(fā)病機制，尋找疾病發(fā)生發(fā)展過程中的生物標志物，仍然是提高診治水平、改善預后的重要手段。

基因芯片及測序技術(shù)的成熟產(chǎn)生了生物大數(shù)據(jù)，使人們對疾病的認識實現(xiàn)了從傳統(tǒng)病理到基因水平的進一步飛躍，促進了精準醫(yī)療的誕生和發(fā)展。本研究基于基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（gene expression omni?bus,GEO）中的炎癥性心肌病表達譜芯片數(shù)據(jù)，應用生物信息學手段尋找差異表達基因（differentially ex?pressed genes,DEGs）和核心（hub）基因，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡，標記基因功能，探索發(fā)病機制，并對hub基因進行靶向作用藥物篩查，為臨床精準治療提供思路。

1 數(shù)據(jù)與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載在GEO數(shù)據(jù)庫（www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO）[3-4]中搜索“inflammatory cardiomyopathy”，得到一個探究人類炎癥性心肌病基因表達譜的芯片數(shù)據(jù)集GSE4172。該數(shù)據(jù)集以細小病毒B19相關(guān)的、心肌炎癥為特點的擴張型心肌病亞型為切入點，通過心內(nèi)膜下心肌活檢獲得8名病例和4名健康對照的心肌組織樣本，提取RNA，進行基因表達譜分析，采用Affymetrix Human Genome U 133 Plus 2.0 arrays實驗平臺，探索炎癥性心肌病的基因表達譜。對得到的芯片數(shù)據(jù)進行預處理，包括對缺失值自動補全或基因?qū)鄠€探針取均值等，以及背景校正、標準化等。

1.2 差異表達分析采用統(tǒng)計軟件R 3.5.0進行基因差異表達分析。以|log fold change|（|log FC|）>0，P<0.05為DEGs的篩選條件，并以R語言繪制可視化熱圖。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡分析將DEGs導入STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes,http://string-db.org/cgi/input.pl)，進行蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction,PPI）分析，得到PPI網(wǎng)絡[5]。設定可信度confidence為0.7，輸出TSV格式文件，用于后續(xù)Cytoscape分析[6]。

1.4 Hub基因篩選使用Cytoscape 3.7.3軟件插件CytoHubba(http://hub.iis.sinica.edu.tw/cytohubba/)篩選出PPI網(wǎng)絡中的hub基因。CytoHubba利用12種評分策略剖析PPI網(wǎng)絡，包括Degree等[7]。Degree代表基因/蛋白質(zhì)間相互作用關(guān)系連通度。本研究以Degree值排序前16位的基因作為PPI網(wǎng)絡中的hub基因。

1.5 GO和KEGG富集分析使用R語言對hub基因進行基因本體論（gene ontology,GO,http://www.geneontology.org）和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析[8-9]。GO分析包括在生物學過程（biologi?cal process,BP）、細胞組分（cellular component,CC）和分子功能（molecular function,MF）三個方面進行功能注釋[10]，并利用R語言ggplot2包將結(jié)果可視化。P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。

1.6 候選靶向藥物的篩選在線富集分析平臺Enrichr(https://maayanlab.cloud/Enrichr/)[11]提供藥物反應基因特征數(shù)據(jù)庫(DSigDB,http://biotechlab.fudan.edu.cn/database/drugsig/)訪問權(quán)限。DSigDB通過篩選前500個上調(diào)和下調(diào)的基因作為藥物特征，將公共數(shù)據(jù)庫和科學文獻中的藥物反應微陣列數(shù)據(jù)以及藥物和靶標信息進行整合，建立藥物反應基因特征數(shù)據(jù)庫[12]。目前的DrugSig包括超過1 300種藥物、7 000個微陣列和800個靶點，使計算藥物重新定位來開發(fā)針對核心基因的新型藥物成為可能。本研究利用DSigDB來篩選與炎癥性心肌病hub基因相互作用的候選靶向藥物，為疾病的靶向治療提供參考依據(jù)。P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 差異基因表達分析炎癥性心肌組織有149個基因差異表達，其中44個上調(diào)，105個下調(diào)。差異基因表達譜的火山圖見圖1。按P值升序排序，對差異表達的前50位基因繪制熱圖以可視化（圖2）。

圖1 火山圖Fig.1 Volcano map

圖2 差異表達前50基因表達譜熱圖Fig.2 Heat map of differential gene expression profiles

2.2 PPI網(wǎng)絡構(gòu)建及hub基因鑒定對差異基因行PPI分析，平均節(jié)點度值為2.29，PPI富集P<6.66e-16。輸出TSV格式文件并導入Cytoscape軟件，以CytoHubba行拓撲計算，取Degree排名前16的基因作為hub基 因，即NDUFB7、POLR2L、NDUFS7、UQCR11、NDUFA13、NDUFA2、PHPT1、NDUFB10、UBA52、ATP5D、NDUFA3、COX6B1、POLR2J、COX4I2、AURKAIP1和MRPL41（圖3）。16個核心基因的差異分析檢驗數(shù)據(jù)見表1。

表1 核心基因差異表達分析Tab.1 Analysis of hub genes’differential expression

圖3 差異基因構(gòu)成的PPI網(wǎng)絡中鑒定核心基因Fig.3 Identification of hub genes from the PPIs network of DEGs

2.3 GO富集分析對hub基因行GO分析，最顯著富集的子集包括線粒體ATP合成耦聯(lián)的電子傳遞、呼吸電子傳遞鏈、氧化磷酸化、呼吸鏈、線粒體內(nèi)膜、NADH脫氫酶活性、氧化還原酶活性等（圖4，表2）。

表2 核心基因GO富集分析(各子集前10)Tab.2 GO enrichment analysis of hub genes(Top 10 for BP,CC and MF)

圖4 核心基因GO富集分析部分可視化（氣泡圖）Fig.4 Partial visualization for GO enrichment analysis of hub genes(bubble diagram)

2.4 KEGG富集分析對hub基因行KEGG富集分析，主要富集在氧化磷酸化、非酒精性脂肪性肝病、糖尿病心肌病和心肌收縮等（圖5，表3）。

表3 核心基因KEGG富集分析Tab.3 KEGG enrichment analysis of hub genes

圖5 核心基因KEGG富集分析可視化（氣泡圖）Fig.5 Visualization for KEGG enrichment analysis of hub genes(bubble diagram)

2.5 候選靶向藥物篩選針對疾病相關(guān)核心基因的部分候選靶向藥物信息展示（表4），即鹽酸二甲雙胍、克林霉素、肼苯噠嗪等可與大多數(shù)hub基因相互作用，表明它們可能作為治療炎癥性心肌病的候選藥物。

表4 核心基因的部分候選靶向藥物信息Tab.4 Partial candidate drugs targeting hub genes

3 討 論

炎癥性心肌病的病理特征是心肌炎癥細胞浸潤，易發(fā)展為心力衰竭。其病因具有異質(zhì)性，可由病毒等微生物感染及有毒物質(zhì)、全身免疫介導等引起[2]。其發(fā)病機制仍在研究，并缺乏有效的治療策略。本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫中炎癥性心肌病的芯片數(shù)據(jù)，尋找差異表達基因，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡，篩選核心基因，通過GO和KEGG分析，篩選疾病發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵基因，為疾病的精準靶向治療提供依據(jù)和方向。

富集分析發(fā)現(xiàn)，核心基因的功能主要集中在線粒體ATP合成耦聯(lián)的電子傳遞、呼吸電子傳遞鏈、氧化磷酸化、呼吸鏈、線粒體內(nèi)膜、NADH脫氫酶活性、氧化還原酶活性等；同時，核心基因主要富集在氧化磷酸化、非酒精性脂肪性肝病、糖尿病心肌病和心肌收縮等通路上。

線粒體復合物Ⅰ（NADH：泛醌氧化還原酶）是氧化磷酸化過程中最大的蛋白復合物，NDUFB7、NDUFS7、NDUFA13和NDUFB10都是其亞基[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，這些基因在炎癥性心肌病中是顯著下調(diào)的。CORREIA等[15]報道了一名患者由于NDUFB7基因內(nèi)含子發(fā)生了純合子突變，進而導致了復合物Ⅰ活性降低，從而表現(xiàn)出了嚴重的肥厚性心肌病。NDUFS7、NDUFA13和NDUFB10基因的突變同樣會引起心肌病的發(fā)生[16-19]。CHEN等[20]則發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注過程中，NDUFS7的蛋白水解增加，復合物Ⅰ的活性降低，從而導致心肌損傷加重。而NDUFA13基因的敲除則對缺血再灌注損傷有保護作用[21]。LIM等[22]則發(fā)現(xiàn)在肥厚性心肌病中NDUFB10的表達是增加的。

ATP是生物體內(nèi)最直接的能量來源，主要由線粒體內(nèi)的ATP合酶產(chǎn)生。ATP合酶由8個亞基組成，ATP5D就是其中之一[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，ATP5D在炎癥性心肌病中顯著下調(diào)。多篇文獻已經(jīng)報道了ATP5D的減少，ATP水平的下降可能通過能量調(diào)節(jié)機制參與了心肌缺血再灌注損傷[24-26]。

細胞色素氧化酶屬于細胞呼吸中的細胞色素系統(tǒng)，其作用是通過細胞色素系統(tǒng)將呼吸底物的電子直接轉(zhuǎn)移到氧分子上。COX6B1是細胞色素氧化酶第六亞基組分，COX6B1蛋白的主要作用是將兩個細胞色素氧化酶單體連接成二聚體。COX6B1的變異對細胞色素氧化酶的功能影響極大，從而可能導致某些疾病的發(fā)生[27]。在本研究中，COX6B1的水平是顯著下調(diào)的。之前有研究報道，COX6B1能夠減輕心肌缺血再灌注損傷，而它的突變則會導致心肌病的發(fā)生[28]。其余幾個核心基因暫未見文獻報道與心肌病有關(guān)聯(lián)，值得后期進一步探索。

從上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)，炎癥性心肌病中顯著下調(diào)的核心基因大部分參與了線粒體呼吸鏈以及ATP的產(chǎn)生，這與本次GO分析的結(jié)果及之前的研究結(jié)果是一致的，提示該疾病可能由心肌能量代謝障礙導致。臨床上可嘗試通過改善心肌能量供應來治療炎癥性心肌病，而這些顯著下調(diào)的基因可能成為治療的靶點。

KEGG分析發(fā)現(xiàn),hub基因富集在氧化磷酸化、非酒精性脂肪性肝病、糖尿病心肌病和心肌收縮等通路中。葡萄糖或脂肪酸的氧化磷酸化發(fā)生在真核細胞的線粒體中，以適應機體或器官的能量需求；參與氧化磷酸化的復合物分布在線粒體的內(nèi)膜上，形成呼吸鏈，也稱為電子傳遞鏈，傳遞電子和氫離子，產(chǎn)生水和ATP。Hub基因顯著富集于氧化磷酸化通路中，提示其參與心肌細胞能量代謝，這與GO富集分析結(jié)果是一致的。最新研究表明，心肌細胞功能降低是糖尿病心肌病心力衰竭的重要機制，而心肌細胞功能的下降可能與細胞質(zhì)和線粒體中鈣離子的調(diào)控障礙有關(guān)[29]，這提示改善心肌細胞鈣離子的調(diào)控能力可能是炎癥性心肌病治療的另一個方向。Hub基因還富集在非酒精性脂肪性肝病通路上，非酒精性脂肪性肝病患者心肌病的風險增加，這可能與患者心臟結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。有研究表明，該類患者存在左心室增厚、順應性減低等表現(xiàn)，其潛在機制涉及內(nèi)皮功能失調(diào)、炎癥、氧化應激等[30-33]。這些結(jié)果提示炎癥性心肌病可能與非酒精性脂肪性肝病類似，是代謝綜合征靶器官損傷的表現(xiàn)之一。而針對代謝綜合征的綜合治療措施可能在炎癥性心肌病的治療中占據(jù)一席之地。Hub基因也顯著富集于心肌收縮通路中，提示其在心臟泵血功能中扮演著重要角色，與心功能不全的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

為探究Hub基因靶向作用藥物可能在炎癥性心肌病中的作用，本研究使用DSigDB對Hub基因進行靶向藥物篩查。其中，鹽酸二甲雙胍作為一線降糖藥物，可增加組織細胞胰島素敏感性，改善血管內(nèi)皮細胞功能，降低促炎因子的分泌釋放，抑制單核細胞向巨噬細胞分化，調(diào)節(jié)腸道菌群，對糖尿病患者及心血管等系統(tǒng)疾病患者有保護作用[34-35]。二甲雙胍可通過增強自噬而減輕δ-肌聚糖缺乏引起的擴張型心肌病的心力衰竭癥狀[36]。二甲雙胍可通過活化AMPK來增強線粒體內(nèi)β氧化，提高NAD1/NADH比值，以產(chǎn)生更多的ATP[37]。本研究分析發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可與NADH的多個亞基靶向作用，推測其可能促進細胞ATP的產(chǎn)生，進而改善炎癥性心肌病的預后，這也為二甲雙胍可能作為炎癥性心肌病的治療藥物之一進一步奠定了理論基礎。另外，其余藥物如克林霉素、肼苯噠嗪也可與多個Hub基因靶向作用，可能作為后期疾病診治研究的切入點。

總之，上述hub基因及其參與的多個信號通路可能在炎癥性心肌病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而提高心肌細胞中這些基因的表達、改善心肌細胞的能量代謝可能成為炎癥性心肌病的治療靶點。然而，本研究仍存在一些不足。例如，未能構(gòu)建炎癥性心肌病動物模型及進行核心基因表達水平的體外驗證實驗。若能設計并實施動物試驗，給予二甲雙胍等靶向藥物干預，進行隨訪觀察療效，可進一步提升本研究的質(zhì)量，并對臨床診療提供更大的幫助。