文沛瑤,游佳欣,徐 勇,張軍華*

(1.南京林業(yè)大學 化學工程學院,江蘇 南京210037;2.西北農(nóng)林科技大學 林學院,陜西 楊凌712100)

楊樹具有生長快、分布廣、易栽培的特點,故而常用于制備生物基化學品[1]。楊木中含有大量的木聚糖和纖維素組分,可通過化學法或生物法降解來制備低聚木糖(XOS)和單糖[2-3]。XOS具有益生元活性,在醫(yī)藥、食品及衛(wèi)生領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用前景[2]。乙酸(AC)水解是一種較為綠色的生物質(zhì)預(yù)處理方法,被廣泛用于制備XOS[3-5]。Wen等[3]使用5%乙酸在170℃下對楊木處理了30 min,低聚木糖得率為55.8%。Zhang等[4]采用pH值2.7的乙酸在150℃下處理玉米芯30 min,XOS得率達45.91%?？莶菅挎邨U菌是常見飼料添加劑之一,它可以提高飼料轉(zhuǎn)化率,促進動物消化并增強動物免疫力[6]。乙酸水解楊木后得到的固形物中仍含有較多纖維素和木聚糖,經(jīng)纖維素酶水解后可以得到可發(fā)酵糖如葡萄糖、木糖,它們可以作為枯草芽孢桿菌生長的碳源,這樣既可以提高楊木的利用價值,又可以減少枯草芽孢桿菌的生產(chǎn)成本。然而,楊木在經(jīng)過乙酸水解后,其固形物酶水解的可發(fā)酵糖(葡萄糖和木糖)得率均低于30%。乙酸水解楊木后固形物中較高的木質(zhì)素質(zhì)量分數(shù)(超過30%)是可發(fā)酵糖得率較低的主要原因[3,5]。因此,尋找一種高效的預(yù)處理方式移除乙酸水解楊木后固形物中的木質(zhì)素,改善楊木酶水解效率是后續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的關(guān)鍵之所在。本研究以楊木屑為原料,乙酸水解制備低聚木糖后,采用不同的預(yù)處理方式對乙酸水解楊木后的固形物進行二次預(yù)處理,對比二次預(yù)處理對楊木化學組成、結(jié)構(gòu)及酶水解特性的影響,最后利用獲得的酶水解液發(fā)酵培養(yǎng)枯草芽孢桿菌,以期為后續(xù)楊木聯(lián)產(chǎn)低聚木糖和枯草芽孢桿菌研究提供新方向,同時為楊木的高效轉(zhuǎn)化和利用提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

楊木屑收集于江蘇省宿遷市,粉碎過0.25 mm篩,備用。乙酸、氫氧化鈉、雙氧水(質(zhì)量分數(shù)30%)、氨水(質(zhì)量分數(shù)26%)、γ-戊內(nèi)酯(GVL)、硫酸(質(zhì)量分數(shù)98%),均為市售分析純。

纖維素酶CTec2,濾紙酶活[7]為123.0 FPU/mL,購于丹麥Novozymes公司?？莶菅挎邨U菌(Bacillus subtilis)YS01,由南京林業(yè)大學生物工程系生物化工研究所保藏。自制活化培養(yǎng)基:1%葡萄糖,1%魚粉蛋白胨,0.5%酵母膏,1%NaCl,pH值7.0。瓊脂固體培養(yǎng)基:0.5%魚粉蛋白胨,0.25%酵母膏,0.1%葡萄糖,1.5%瓊脂,pH值7.0,用于平板計數(shù)法計算枯草芽孢桿菌菌體濃度。自制發(fā)酵培養(yǎng)基:1%魚粉蛋白胨,0.15%K2HPO4,0.01%MnSO4,0.05%MgSO4,0.02%CaCl2。

ATY224型電子天平;YXQ-LS-50A型立式壓力蒸汽滅菌器;HH-SB型超級恒溫油浴鍋;L550型臺式高速離心機;ZWY-240型恒溫培養(yǎng)振蕩器,上海智城分析儀器制造有限公司;Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司;Dionex ICS-5000高效液相離子色譜,賽默飛世爾科技有限公司;SBA-40C型生物傳感分析儀,山東省科學院生物研究所。

1.2 楊木屑的兩步預(yù)處理

1.2.1乙酸水解將楊木原料2.5 g和體積分數(shù)5%的乙酸溶液按照料液比1∶10(g∶mL,下同)充分混合,浸泡1 h后從25℃油浴升溫至170℃,分別預(yù)處理30和50 min。反應(yīng)完畢后,立即冷卻,離心機10 000 r/min離心5 min,回收預(yù)處理液,測定低聚木糖(XOS)含量。水解后固形物用蒸餾水洗滌至中性,置于-19℃冰箱中,備用于第二步預(yù)處理。預(yù)處理液中木糖和XOS得率基于預(yù)處理液中木聚糖含量計算。

1.2.2第二步預(yù)處理

1.2.2.1NaOH預(yù)處理 取乙酸水解楊木后的固形物2.5 g,將配制的質(zhì)量分數(shù)1%NaOH溶液和固形物按液料比10∶1混合后,于120℃下預(yù)處理1 h。

1.2.2.2NaOH-H2O2預(yù)處理 取乙酸水解楊木后的固形物2.5 g,將含有質(zhì)量分數(shù)1%NaOH和質(zhì)量分數(shù)1%H2O2的混合液和固形物按液料比10∶1混合后,于120℃下預(yù)處理1 h[8]。

1.2.2.3NH3·H2O預(yù)處理 取乙酸水解楊木后的固形物2.5 g,將質(zhì)量分數(shù)26%氨水和固形物按液料比10∶1混合后,于70℃下預(yù)處理24 h[9]。

1.2.2.4γ-戊內(nèi)酯預(yù)處理 將戊內(nèi)酯和水按體積比8∶2混合,加入100 mmol濃硫酸,作為預(yù)處理液。取乙酸水解楊木后的固形物2.5 g,按液料比10∶1加入預(yù)處理液[10],混合后于140℃下預(yù)處理1 h。

1.2.2.5乙酸-雙氧水(HPAC)預(yù)處理 將乙酸-雙氧水按照體積比1∶1混合,蒸餾水稀釋乙酸-雙氧水溶液至體積分數(shù)80%作為預(yù)處理液。取乙酸水解楊木后的固形物2.5 g,加入100 mmol濃硫酸[3]后,按液料比10∶1加入預(yù)處理液,和固形物混合后于60℃下預(yù)處理2 h。

第二步預(yù)處理后,分別抽濾使固液分離,液體冷凍于-20℃冰箱中,固體用于后續(xù)組分測定和酶水解實驗。

1.3 楊木酶水解

稱取兩步預(yù)處理后的樣品0.04 g于離心管中,加入纖維素酶和pH值5.0的檸檬酸鈉緩沖液,配制成底物質(zhì)量分數(shù)2%(以體系的總質(zhì)量計)的水解液2 mL。分別按5、10、15和20 FPU/g(以干物質(zhì)計,下同)添加纖維素酶CTec2,將離心管置于恒溫培養(yǎng)振蕩器中在50℃、200 r/min條件下水解72 h。水解完成后,將樣品煮沸10 min滅活,冷卻后,離心10 min(10 000 r/min),取上清液測定葡萄糖和木糖,根據(jù)文獻[3]的公式計算酶水解的葡萄糖和木糖得率。

1.4 酶解液培養(yǎng)枯草芽孢桿菌

1.4.1菌種活化 將保存于-18℃的枯草芽孢桿菌菌粉接種于活化培養(yǎng)基中,在37℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h;使用滅菌后的接種環(huán)蘸取少許菌液,在瓊脂培養(yǎng)基上進行平板劃線操作,將劃線后的培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;挑取單菌落接種至滅菌后的活化培養(yǎng)基中,在37℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h即得到活化后的菌種?；罨蟮木N用于后續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)枯草芽孢桿菌。

1.4.2發(fā)酵培養(yǎng)枯草芽孢桿菌以二次預(yù)處理后的楊木酶水解液為碳源,加入乙酸和乙酸-雙氧水(AC-HPAC)兩步預(yù)處理楊木酶水解液使發(fā)酵液體系中葡萄糖質(zhì)量分數(shù)為1%。然后加入1.1節(jié)配制的發(fā)酵培養(yǎng)基,在37℃、150 r/min、接種量5%、裝液量為20/50 mL(在50 mL三角瓶中裝入20 mL發(fā)酵液)的條件下發(fā)酵培養(yǎng)枯草芽孢桿菌。同時,以葡萄糖(初始質(zhì)量濃度6.77 g/L)為碳源作對照。發(fā)酵過程中在不同時間點檢測pH值、OD值、葡萄糖濃度和木糖濃度,考察其對枯草芽孢桿菌生長曲線的影響。

1.5 表征分析

1.5.1組分測定楊木樣品的組分參照美國可再生能源實驗室(NREL)的方法[11]測定。

1.5.2糖含量測定葡萄糖、木糖和低聚木糖均參考文獻[3]中的方法測試。葡萄糖和木糖的濃度采用Agilent 1260高效液相色譜分析,分析柱為Aminex HPX-87H,檢測器為示差折光檢測器,色譜柱溫度45℃,流動相是5 mmol/L的H2SO4,流速為0.5 mL/min。低聚木糖濃度采用Dionex ICS-5000高效液相離子色譜測定,色譜柱為Carbon Pac PA200,采用100 mmol/L NaOH和500 mmol/L NaAc進行梯度洗脫,流速為0.3 mL/min,柱溫為30℃,四電位脈沖安倍檢測器(PAD)檢測。

1.5.3光密度值的測定采用比濁法,取1.0 mL發(fā)酵液于1.5 mL離心管中離心(10 000 r/min,5 min),沉淀中每次加入1.0 mL 0.9%的生理鹽水潤洗,最后將其溶于1.0 mL的蒸餾水中,稀釋適當倍數(shù)后在600 nm處用1.0 cm光徑的比色皿測定吸光度(A600),A600乘以稀釋倍數(shù)即為600 nm處的光密度(OD600)值。

1.5.4菌體濃度的計算將菌液逐級稀釋,振蕩混勻,取100μL涂布平板,37℃于瓊脂固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后,按平板計數(shù)法選取菌落數(shù)30～300為有效計數(shù)平板,按菌落形成單位(CFU)進行計數(shù)。依照下式計算菌體濃度(CCFU,CFU/mL):

式中:C—某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù),CFU;V—涂平板時所用稀釋液的體積,mL;M—稀釋倍數(shù)。

1.5.5生長曲線的繪制[12]取若干個150 mL已滅菌的錐形瓶,各裝入20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,pH值為7.0,接種量為5%,37℃,150 r/min培養(yǎng)0～36 h,每個時間點進行pH值、OD600、糖含量、菌體濃度的測定,以時間為橫坐標,pH值、OD600、糖含量和菌體濃度為縱坐標繪制菌的生長曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 乙酸水解制備低聚木糖

當乙酸水解時間為30和50 min時,預(yù)處理液中的XOS得率分別為55.8%和39.0%[3],較高的得率表明乙酸水解是一種高效制備XOS的方法[13]。然而,經(jīng)過乙酸水解后,楊木在進一步的酶水解中葡萄糖得率低于25%。這一結(jié)果是由于乙酸水解使底物中的木質(zhì)素質(zhì)量分數(shù)(大于35%)增加,降低了纖維素酶對楊木纖維素的可及性及水解效率[2-3,13]。因此,為實現(xiàn)乙酸水解楊木中的多糖更高效地轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵單糖,探討高效的預(yù)處理方法脫除木質(zhì)素組分是改善楊木酶水解效率的必要手段[14]。

2.2 第二步預(yù)處理方法的影響

2.2.1楊木化學組分 以乙酸水解楊木30 min后的固形物為底物,研究了NaOH、NaOH-H2O2、NH3·H2O、γ-戊內(nèi)酯(GVL)、HPAC等預(yù)處理方法對底物化學組成的影響(表1)。經(jīng)過不同方式預(yù)處理后,底物中的木聚糖和木質(zhì)素含量均有所降低,經(jīng)NaOH和HPAC預(yù)處理的底物中木聚糖質(zhì)量分數(shù)甚至降到3%以下,表明這2種預(yù)處理方式均對固形物中殘留的木聚糖有著較強的脫除作用。經(jīng)HPAC預(yù)處理后總木質(zhì)素質(zhì)量分數(shù)最低(4.4%),這就表明這幾種預(yù)處理方式中HPAC最適合用于楊木木質(zhì)素的移除[15-16]。

表1 不同預(yù)處理對乙酸水解楊木(30 min)化學組成的影響Table 1 Effects of different pretreatments on the composition of AC-pretreated poplar(30 min)

以乙酸水解楊木50 min后的固形物為底物時,γ-戊內(nèi)酯預(yù)處理后底物的酸不溶木質(zhì)素質(zhì)量分數(shù)從36.1%降至10.3%(表2),這表明γ-戊內(nèi)酯預(yù)處理對底物有著較好的木質(zhì)素移除效果。經(jīng)HPAC預(yù)處理后,底物中的木質(zhì)素質(zhì)量分數(shù)低于0.5%,證實了HPAC預(yù)處理也對楊木有著很強的木質(zhì)素移除能力[15-16]。需要注意的是,經(jīng)過HPAC預(yù)處理后底物中木聚糖質(zhì)量分數(shù)僅為3.0%,這說明該預(yù)處理方法在移除木質(zhì)素的同時移除了較多木聚糖。綜上,HPAC預(yù)處理是脫除酸解楊木中木質(zhì)素最優(yōu)的預(yù)處理方法。

表2 不同預(yù)處理對乙酸水解楊木(50 min)化學組成的影響Table 2 Effects of different pretreatments on the composition of AC-pretreated poplar(50 min)

2.2.2楊木酶解結(jié)果楊木經(jīng)乙酸水解30 min后再經(jīng)第二步預(yù)處理,然后經(jīng)纖維素酶水解,所得葡萄糖和木糖得率均有所提升(表3)。其中,NH3·H2O預(yù)處理后樣品的葡萄糖和木糖的得率均較低(不到20%)。在酶水解過程中,無定型纖維素相對結(jié)晶纖維素更容易水解[2]。因此,NH3·H2O預(yù)處理中溶解部分無定型纖維素會導(dǎo)致結(jié)晶纖維素含量相對升高,這可能是導(dǎo)致NH3·H2O預(yù)處理后底物水解葡萄糖得率較低的原因[9,17]。從表3中水解得率的數(shù)據(jù)可以看出,預(yù)處理效果大小的順序依次是:HPAC、NaOH、NaOH-H2O2、GVL、NH3·H2O預(yù)處理。

表3 不同預(yù)處理對乙酸水解楊木(30 min)酶水解的影響Table 3 Effects of different pretreatments on the enzymatic hydrolysis of AC-pretreated poplar(30 min)

以乙酸水解楊木50 min的固形物為原料時,分別采用NaOH、NaOH-H2O2、NH3·H2O預(yù)處理后,酶水解所得葡萄糖得率均低于35.0%(表4),但是略高于以乙酸水解楊木30 min的底物(得率＜30%)。經(jīng)HPAC預(yù)處理后底物的葡萄糖得率為62.3%,高于其他4種預(yù)處理后底物的葡萄糖得率。

表4 不同預(yù)處理對乙酸楊木(50 min)酶水解的影響Table 4 Effects of different pretreatments on the hydrolysis of AC-pretreated poplar(50 min)

當纖維素酶添加量為20 FPU/g時,加入1.0 g/L吐溫80后,經(jīng)乙酸水解50 min及乙酸-雙氧水兩步預(yù)處理后楊木酶解的葡萄糖和木糖得率分別從62.3%和71.0%提升至97.1%和98.1%(圖1)。表明吐溫80對楊木的酶水解性能有著較強的促進作用。這可能是因為吐溫80減少了酶在底物表面的非生產(chǎn)性吸附,提高了纖維素酶穩(wěn)定性[18]。當纖維素酶添加量減少至10 FPU/g時,葡萄糖得率仍高達96.1%。在相同酶水解條件下,30 min乙酸水解楊木經(jīng)二次預(yù)處理后的酶水解葡萄糖得率為93.8%,二者葡萄糖得率較為接近。由于30 min乙酸水解楊木已能獲得更高的低聚木糖(得率55.8%),水解更長時間,50 min低聚木糖得率(39.0%)反而降低,故采用乙酸水解楊木30 min的底物作為后續(xù)制備酶水解液的底物。

圖1 吐溫80對AC-HPAC預(yù)處理后楊木酶水解的影響Fig.1 Effect of Tween 80 on the hydrolysis of AC-HPAC-pretreated poplar by cellulase

2.3 酶水解液培養(yǎng)枯草芽孢桿菌

枯草芽孢桿菌是一種多功能的微生物,不僅可用于植物生物防護以及動物飼料的添加菌劑,而且在污水處理及生物肥發(fā)酵中應(yīng)用也相當廣泛[6]。葡萄糖可以作為培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的主要碳源。當以葡萄糖為碳源時,在發(fā)酵的前12 h,隨著發(fā)酵時間延長,酶水解液中的葡萄糖濃度逐漸降低、枯草芽孢桿菌菌體濃度逐漸增加(圖2(a))。經(jīng)過12 h發(fā)酵后,葡萄糖質(zhì)量濃度由6.8 g/L降低至0.1 g/L,葡萄糖利用率為99.3%,此時的枯草芽孢桿菌的菌體濃度最高可達到2.1×109CFU/mL。當發(fā)酵時間大于12 h后,枯草芽孢桿菌的菌體濃度開始降低,這可能是發(fā)酵液中葡萄糖消耗完所致。經(jīng)過發(fā)酵3 h后,發(fā)酵液pH值降低,這可能是發(fā)酵中產(chǎn)生了部分有機酸所致。

生物質(zhì)酶水解液中含有大量的可發(fā)酵糖可為枯草芽孢桿菌的發(fā)酵提供豐富的碳源。李情敏等[6]使用玉米酶解液在pH值5、溫度37℃、接種量6%、轉(zhuǎn)速200 r/min條件下培養(yǎng)枯草芽孢菌19 h后,發(fā)酵液的OD600值可達7.38。在本研究中,當以經(jīng)過兩步預(yù)處理后的楊木酶水解液作為碳源時,在0～2 h為枯草芽孢桿菌生長的遲緩期,2～11.5 h菌體濃度急劇增加,11.5 h后枯草芽孢桿菌生長進入穩(wěn)定期(圖2(b))。在發(fā)酵的前11.5 h,隨著發(fā)酵時間延長,酶水解液中的葡萄糖濃度大幅度降低、木糖濃度緩慢降低、枯草芽孢桿菌菌體濃度明顯增加。經(jīng)過11.5 h的發(fā)酵,枯草芽孢桿菌的菌體濃度最高可達到2.1×109CFU/mL,此時酶水解的葡萄糖利用率為95.3%,木糖利用率為25.0%。在13 h后發(fā)酵液中的葡萄糖和木糖利用率分別可達99.1%和32.9%,26 h后木糖利用率也達到92.6%,這說明葡萄糖和木糖均可用于枯草芽孢桿菌的生長,但葡萄糖比木糖優(yōu)先被枯草芽孢桿菌利用。在發(fā)酵過程中,經(jīng)過13 h后,葡萄糖質(zhì)量濃度降低了9.7 g/L,而26 h后木糖質(zhì)量濃度僅降低了1.5 g/L,這表明枯草芽孢桿菌對木糖的利用速率遠低于葡萄糖。酶水解發(fā)酵液培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌菌體濃度接近葡萄糖為碳源培養(yǎng)的菌體濃度,這說明楊木酶水解液增殖枯草芽孢桿菌的效果和葡萄糖相近。除含有葡萄糖和木糖外,酶水解液中還含有0.36 g/L乙酸、0.07 g/L乙酰丙酸和0.04 g/L的5-羥甲基糠醛,上述物質(zhì)均會不同程度地影響枯草芽孢桿菌的生長。因此,在采用酶水解液進行發(fā)酵前可采用活性炭吸附或石灰中和的方法去除酶水解液中的抑制物[19],以進一步提高枯草芽孢桿菌的菌體濃度。

圖2 葡萄糖(a)和楊木酶水解液(b)分別培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的生長曲線Fig.2 The growth curves of the B.subtilis cultured by glucose(a)and enzymatic hydrolysates from poplar(b)

3 結(jié) 論

3.1乙酸水解楊木(2.5 g)制備低聚木糖的最適條件為:溫度170℃,乙酸體積分數(shù)5%,反應(yīng)時間30 min。該條件下低聚木糖得率為55.8%(基于預(yù)處理液,下同),預(yù)處理延長至50 min時,低聚木糖得率降為39.0%。

3.2比較了氫氧化鈉、氫氧化鈉-雙氧水、氨水、γ-戊內(nèi)酯和乙酸-雙氧水預(yù)處理對乙酸水解楊木化學組成和酶水解特性的影響,結(jié)果表明:乙酸-雙氧水預(yù)處理具有最好的脫木質(zhì)素效果,同時可獲得最高的酶水解效率。

3.3吐溫80可以降低纖維素酶的使用量至10 FPU/g DM,并提高乙酸和乙酸-雙氧水兩步預(yù)處理楊木的酶水解中葡萄糖得率至93.8%。

3.4以乙酸和乙酸-雙氧水兩步預(yù)處理楊木的酶水解液為碳源,經(jīng)11.5 h培養(yǎng)得到的枯草芽孢桿菌菌體濃度最高可達到2.1×109CFU/mL,此時酶水解的葡萄糖利用率為95.3%,木糖利用率為25.0%。