駱 晨，周 軍，付 雪，李智博，覃艷麗，韋 力

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 宜昌市中心人民醫(yī)院超聲科，湖北 宜昌 443003)

聚桂醇是療效好且安全性高的硬化劑[1-2]，可用于有效治療靜脈曲張等血管類疾病[3]；隨著微創(chuàng)治療的普及和對(duì)藥物本身作用機(jī)制的探索，其臨床應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)展。介入技術(shù)的引入為應(yīng)用聚桂醇拓寬了途徑，并在囊腫性疾病中展示出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。肝囊腫與膽囊壁具有共同的胚胎組織來源、囊壁上皮細(xì)胞及分泌特點(diǎn)，故既往常選取兔膽囊進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究[4-5]。在前期研究[6]基礎(chǔ)上，本研究以兔膽囊模擬肝囊腫，通過析因設(shè)計(jì)篩選聚桂醇在體硬化治療肝囊腫兔模型的最佳藥物濃度與作用時(shí)間組合方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2～3月齡新西蘭大白兔58只，雌雄不限，體質(zhì)量(1.99±0.18)kg，購(gòu)自湖北逸摯誠(chéng)生物科技有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：42817300000548；飼養(yǎng)于三峽大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物許可證編號(hào)：SYXK(鄂)2017-0061。飼養(yǎng)條件：室溫22℃，12 h晝夜交替，自由飲食飼養(yǎng)1周。

1.2 儀器與方法

1.2.1 制備肝囊腫在體模型 以10%水合氯醛麻醉實(shí)驗(yàn)兔并常規(guī)保定后，于右上腹肋緣下作長(zhǎng)約7～8 cm斜切口，充分暴露肝臟及膽囊。觀察膽囊管與膽囊血管的解剖關(guān)系，結(jié)扎膽囊管(避開膽囊動(dòng)、靜脈)，測(cè)量膽囊最大橫徑，之后抽盡膽汁記錄膽囊容積。58只兔造模過程中死亡1只，3只因血管變異結(jié)扎失敗導(dǎo)致膽囊缺血壞死被排除，最終54只造模成功(圖1)。

圖1 建立肝囊腫兔模型解剖圖 A.兔膽囊三角區(qū)，黃箭指膽囊管，位于紅色膽囊血管(綠箭)上方； B.結(jié)扎膽囊管，建成肝囊腫兔模型

1.2.2 分組及硬化治療 采用兩因素三水平析因設(shè)計(jì)方法，將54只造模成功兔隨機(jī)分為9組，每組6只，以0.25%、0.50%、1.00%聚桂醇分別作用5、10、20 min。具體方法：根據(jù)分組原則，分別給予兔相應(yīng)濃度聚桂醇，使膽囊呈充盈狀態(tài)；達(dá)到對(duì)應(yīng)作用時(shí)間后抽出硬化劑，曠置膽囊，并以生理鹽水沖洗腹腔，用無菌紗布吸盡鹽水，之后用3-0非吸收性縫線逐層關(guān)閉腹腔。繼續(xù)標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)1周。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察 1周后以空氣栓塞法處死實(shí)驗(yàn)兔，沿原手術(shù)切口再次打開腹腔，測(cè)量膽囊最大橫徑，評(píng)估硬化效果。取出膽囊，剪去周圍肝臟組織，觀察膽囊大小、顏色、硬度及血管網(wǎng)等一般情況。以10%甲醛溶液固定膽囊組織，行脫水、石蠟包埋，制成切片用于HE染色。光鏡下觀察各組膽囊壁全層切片病理改變及各層組織破壞程度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料以±s表示。以單因素方差分析比較各組動(dòng)物體質(zhì)量、膽囊最大橫徑及膽囊容積。采用兩因素析因設(shè)計(jì)方差分析，按照正交實(shí)驗(yàn)有交互作用兩因素最優(yōu)水平取決于其交互作用最優(yōu)水平的原則[7]，計(jì)算聚桂醇濃度與作用時(shí)間不同水平組合時(shí)交互作用的K值，確定兩因素交互最優(yōu)水平。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組一般資料比較 各組兔硬化治療前體質(zhì)量、膽囊最大橫徑及膽囊容積差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，治療后1周膽囊最大橫徑差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.033)。見表1。

表1 各組兔一般資料比較(±s，n=6)

表1 各組兔一般資料比較(±s，n=6)

組別體質(zhì)量(kg)膽囊最大橫徑(mm)治療前治療后1周膽囊容積(ml)0.25%聚桂醇組 5 min亞組2.06±0.209.65±1.236.68±0.791.45±0.22 10 min亞組2.02±0.12 9.73±1.076.03±1.131.37±0.19 20 min亞組2.22±0.198.53±1.805.52±0.581.40±0.270.50%聚桂醇組 5 min亞組1.93±0.189.08±1.505.82±1.271.46±0.30 10 min亞組2.03±0.159.60±1.084.51±0.761.46±0.20 20 min亞組2.09±0.158.70±2.074.62±1.141.43±0.251.00%聚桂醇組 5 min亞組1.94±0.248.41±1.784.85±0.98 1.35±0.33 10 min亞組2.06±0.2110.16±1.495.27±0.571.51±0.23 20 min亞組1.94±0.279.19±1.735.18±0.671.42±0.25F值0.7750.806 2.8860.231P值0.6270.6010.0330.983

2.2 聚桂醇注入前后膽囊變化

2.2.1 大體觀 治療前膽囊充盈良好，壁上血管走行清晰可見。硬化治療后1周，自肝臟剝離的膽囊組織質(zhì)地稍硬，膽囊體積較硬化前縮小，囊壁輪廓尚正常、形態(tài)欠飽滿，色灰白，彈性差，未見血管網(wǎng)，部分囊內(nèi)可見少量分泌物。見圖2。

圖2 1.00%聚桂醇10 min亞組膽囊大體觀 A.聚桂醇硬化治療前，膽囊充盈良好，壁上可見血管走行(箭)； B.硬化治療后1周，離體膽囊壁灰白，觸之稍硬，未見血管網(wǎng)

2.2.2 病理表現(xiàn)

2.2.2.1 0.25%聚桂醇 硬化治療后1周，5、10 min亞組膽囊黏膜仍可見單層柱狀上皮，上皮結(jié)構(gòu)輪廓清晰、皺襞完整，排列尚整齊，僅見少量上皮細(xì)胞倒伏、紊亂、脫落，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肌層未受影響；20 min亞組少量黏膜皺襞紊亂，黏膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死、脫落。見圖3。

圖3 0.25%聚桂醇各亞組細(xì)胞硬化情況(HE，×200) A.5 min亞組，黏膜上皮細(xì)胞紊亂、尚未明顯脫落(箭)； B.10 min亞組，上皮細(xì)胞崩解，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(箭)； C.20 min亞組，上皮細(xì)胞脫落、壞死(箭)

2.2.2.2 0.50%聚桂醇 硬化治療后1周，5 min亞組膽囊黏膜輪廓尚存，上皮細(xì)胞大部分仍完整，僅少量上皮細(xì)胞壞死脫落；10 min亞組大部分上皮細(xì)胞全層破壞，黏膜部分輪廓尚可見；20 min亞組絕大部分黏膜結(jié)構(gòu)破壞，上皮細(xì)胞全層壞死、脫落，硬化累及肌層清晰可見。見圖4。

圖4 0.50%聚桂醇各亞組細(xì)胞硬化情況(HE，×100) A.5 min亞組，黏膜輪廓尚存，上皮細(xì)胞大部分仍完整，僅少量上皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死脫落； B.10 min亞組，黏膜上皮細(xì)胞全層壞死、脫落(箭)； C.20 min亞組，黏膜層結(jié)構(gòu)被破壞(箭)，肌層硬化

2.2.2.3 1.00%聚桂醇 硬化治療1周后，各亞組均出現(xiàn)不同程度囊壁變性壞死。5 min亞組局部黏膜上皮細(xì)胞全層崩解，殘留少數(shù)黏膜上皮細(xì)胞殘影；10 min亞組黏膜上皮結(jié)構(gòu)基本消失，黏膜下肌層見少量出血；20 min亞組上皮細(xì)胞完全脫落、壞死，未見正常黏膜結(jié)構(gòu)，黏膜下肌層大量紅細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖5。

圖5 1.00%聚桂醇各亞組細(xì)胞硬化情況(HE，×100) A.5 min亞組，邊緣局部上皮細(xì)胞裂解(箭)； B.10 min亞組，黏膜層輪廓消失(箭)，黏膜下肌層部分見少量紅細(xì)胞浸潤(rùn)； C.20 min亞組，黏膜下肌層大量出血(箭)

2.3 濃度與時(shí)間交互作用 以各組治療后膽囊最大橫徑作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行析因設(shè)計(jì)，結(jié)果顯示聚桂醇濃度與作用時(shí)間對(duì)硬化治療效果的影響存在交互作用(P=0.019)；分析作用時(shí)間的單獨(dú)效應(yīng)，不同作用時(shí)間膽囊最大橫徑差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)；分析聚桂醇濃度的單獨(dú)效應(yīng)，不同藥物濃度間膽囊最大橫徑差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.317)。見表2。兩因素析因設(shè)計(jì)組合中，0.50%聚桂醇濃度作用10 min時(shí)K值最大(6.19)，即硬化治療效果最好，見表3。

表2 兩因素析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果

表3 兩因素析因設(shè)計(jì)組合K值

3 討論

目前超聲引導(dǎo)下聚桂醇硬化已成為治療囊腫類疾病的理想方案，通過破壞囊壁上皮細(xì)胞阻止囊液分泌達(dá)到治療目的，是安全可靠、簡(jiǎn)便有效的微創(chuàng)介入治療方法。研究[8-9]表明聚桂醇用于超聲引導(dǎo)下介入治療囊腫效果顯著，能于80%患者緩解臨床癥狀，但目前仍處于經(jīng)驗(yàn)性治療階段，對(duì)其藥物濃度及作用時(shí)間等尚無定論。探索硬化治療有效濃度與硬化作用時(shí)間的最佳組合對(duì)臨床應(yīng)用聚桂醇意義重大。膽囊橫徑變化可作為評(píng)估膽囊體積變化的指標(biāo)，常規(guī)超聲與超聲造影條件下，膽囊橫徑與膽囊體積均具有良好的相關(guān)性。本研究以兔膽囊最大橫徑為觀察指標(biāo)，評(píng)估硬化后膽囊體積變化，分析硬化治療效果。

聚桂醇作用效果具有濃度依賴性。前期研究[6]證實(shí)，留置濃度0.25%聚桂醇作用 10 min后抽出，對(duì)囊腫的治愈率為50%，留置不抽出治愈率可達(dá)87.5%；而濃度為0.125%時(shí)，即使留置不抽出，也僅37.5%產(chǎn)生療效，提示0.25%聚桂醇可能是囊腫硬化治療的最低有效濃度。故本實(shí)驗(yàn)以0.25%為最低濃度，觀察聚桂醇對(duì)模型的硬化療效。

硬化劑作用時(shí)間亦為影響硬化療效的關(guān)鍵因素。作用時(shí)間不足導(dǎo)致柱狀上皮細(xì)胞殘留，可繼續(xù)生長(zhǎng)而致治療失敗。目前關(guān)于聚桂醇作用時(shí)間對(duì)硬化療效影響的文獻(xiàn)較少。KOBAYASHI等[10]觀察聚桂醇濃度與作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞死亡的影響，以體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)采用1.5%聚桂醇，給藥后15 s細(xì)胞即死亡，濃度為0.3%時(shí)作用15 min后細(xì)胞死亡；稀釋至0.003%時(shí)，作用60 min甚至更長(zhǎng)時(shí)間細(xì)胞也不會(huì)死亡。高濃度聚桂醇可導(dǎo)致細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)死亡，而在較低濃度下細(xì)胞死亡所需時(shí)間延長(zhǎng)，甚至增加作用時(shí)間亦不能達(dá)到硬化治療效果。本實(shí)驗(yàn)中聚桂醇濃度為0.50%、硬化時(shí)間5 min時(shí)，僅少量上皮細(xì)胞壞死脫落，大部分黏膜結(jié)構(gòu)仍存在；0.50%聚桂醇作用10 min亞組上皮細(xì)完全損傷，而濃度0.50%、作用時(shí)間20 min亞組黏膜下肌層已受到影響，提示作用時(shí)間過長(zhǎng)可能損傷囊腫周圍正常組織。

與目前醫(yī)學(xué)科研中廣泛應(yīng)用的單因素多水平研究方法相比，析因設(shè)計(jì)可同時(shí)考察多因素多水平，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中具有方法學(xué)上的重要意義。本研究采用析因設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，不僅能分析影響硬化治療效果的因素，還可篩選出最優(yōu)治療參數(shù)。本研究結(jié)果表明，聚桂醇濃度與作用時(shí)間之間存在交互作用。顯微鏡下可見0.50%聚桂醇作用10 min時(shí)黏膜輪廓已破壞，出現(xiàn)上皮細(xì)胞全層脫落壞死，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果證實(shí)該組硬化療效最顯著，說明該組合可使上皮細(xì)胞發(fā)生不可逆壞死，達(dá)到理想治療效果。聚桂醇濃度為1.00%時(shí)對(duì)囊壁損傷較大，黏膜上皮細(xì)胞脫落、囊腔碎屑?xì)埩簟つは聦铀[、炎性細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維組織增生，致使硬化后膽囊橫徑值反而增大。

綜上所述，聚桂醇在體硬化治療肝囊腫兔模型的藥物濃度與作用時(shí)間最佳組合方案為0.50%、10 min。