周雯 韓艷軍 周玥 汪小波 丁繼超 劉小虎

【摘要】目的：探討磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路在人參皂苷Rg1 （ginsenoside Rg1）誘導人紅白血病細胞（K562）衰老中的作用機制。方法：將K562分為實驗組和對照組，實驗組加入20 μmol·Lˉ1的人參皂苷Rg1，對照組加入等量的PBS。使用CCK-8試劑盒檢測K562的增殖能力;使用SA-β-gal染色檢測細胞衰老情況、western blotting檢測端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）活性以確定K562細胞衰老生物學改變，熒光定量PCR檢測PI3K，Akt和mTOR mRNA表達改變，western blotting 檢測PI3K、p - Akt、p - mTOR和自噬調(diào)控因子微管輕鏈I蛋白3-II型（LC3II）蛋白表達的改變。結(jié)果：人參皂苷Rg1誘導后，K562細胞增殖抑制率增高，K562的增殖能力下降（P<0.05），SA-β-gal染色顯示衰老細胞較對照組明顯增多，陽性率增高（P<0.05），端粒酶hTERT蛋白表達水平下調(diào)（P<0.05），K562細胞呈現(xiàn)衰老生物學改變;自噬調(diào)控因子LC3II蛋白表達下調(diào)（P<0.05）與對照組比較，實驗組K652細胞PI3K，Akt和mTOR mRNA表達上調(diào)（P<0.05），PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達上調(diào)（P<0.001）。結(jié)論： 人參皂苷Rg1可通過激活PI3K /Akt / mTOR信號通路誘導K562細胞衰老。

【關鍵詞】K562;衰老;人參皂苷Rg1;PI3K;Akt;mTOR

【中圖分類號】R733.7 【文獻標識碼】A 【文章編號】2026-5328（2021）08-014-03

白血病 （leukemia） 是多能造血干細胞異常增殖形成的惡性血液系統(tǒng)疾病，病因復雜多樣，目前化療藥物治療是臨床白血病治療的主要方法，但化療藥物在殺傷白血病細胞的同時也損傷機體正常血細胞[1，2]。許多天然藥物在抗白血病細胞同時具有保護正常細胞的優(yōu)點，因此，對中藥活性成分的探究并從其中尋找治療白血病的有效藥物是值得探索的途徑之一。

據(jù)報道，人參皂苷Rg1在體外可有效抑制白血病K562細胞增殖[3，4]，促進腫瘤細胞凋亡[5]?，F(xiàn)下對人參皂苷Rg1的作用機制研究大多針對促進腫瘤細胞凋亡，但卻很少有研究報道Rg1誘導白血病細胞衰老的作用機制。本研究以人慢性粒細胞白血病K562細胞為對象，探討人參皂苷Rg1通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導K562細胞衰老的機制。

1.材料

2.K562細胞、RPMI培養(yǎng)基（HyClone公司）;胎牛血清（BI公司）;人參皂苷Rg1（大連美侖生物有限公司，純度>95%）;CCK-8試劑盒、SA-β-Gal Staining Kit （ Cell Signaling 公司）;，PCR 引物（ Invitrogen 公司）;熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa 公司））;抗體（Santa Cruz 公司）;蛋白裂解液（ Applygen公司），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術研究所）。

2.分組

實驗組：取對數(shù)生長期K562細胞加入20 μmol·Lˉ1 的人參皂苷Rg1。對照組：加入與實驗組藥物等量的PBS。置于37 ℃、含5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.K562細胞衰老相關生物學檢測

3.1 CCK-8法檢測細胞增殖能力

將K562細胞重懸后，按1×105個/ml的濃度將K562細胞接種于96孔板，每孔100 μL，每組設5個復孔。實驗組加入20 μmol·Lˉ1人參皂苷Rg1，每孔10 μL;對照組加入10 μL PBS，共培養(yǎng)48 后，每孔加入10 μL CCK-8，孵育4 h后，酶標儀檢測A450值。細胞增殖抑制率（%）=（對照組A450平均值-實驗組A450平均值）/對照組A450平均值×100%。

3.2 SA-β-Gal衰老染色

將K562細胞重懸后，取1×105 個K562細胞置于50 c㎡的培養(yǎng)瓶中，加入 RPMI 1640培養(yǎng)基至5 mL。實驗組和對照組分別加入20 μmol·Lˉ1人參皂苷Rg1和PBS 各500 μL，培養(yǎng)48 h后離心收集兩組細胞，PBS洗滌2次，按照SA-β-Gal Staining Kit 方法操作，染色細胞孵育12h后顯微鏡下進行計數(shù)。

3.3 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）活性檢測

收集兩組細胞，PBS洗滌2次，提取各組細胞總蛋白，按BCA蛋白濃度測定試劑盒方法測定總蛋白濃度，取等量總蛋白經(jīng) SDS-PAGE 電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5% 脫脂奶粉封閉 2h，加入兔抗鼠hTERT一抗（ 1∶200），4℃ 過夜，TBST 緩沖液漂洗2次，加入HRP標記的羊抗兔二抗 （1∶5000），室溫反應 2h，TBST洗膜3次，CL增強發(fā)光試劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光，顯影定影后觀察結(jié)果。

3.4 熒光定量PCR檢測PI3K，Akt和mTOR mRNA的表達

收集兩組細胞，Trizol裂解后，分別提取各組細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為DNA，反轉(zhuǎn)錄反應條件：30℃，10min，42℃，30min，95℃，5min;以RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，擴增PI3K，Akt和mTOR，以 GAPDH 為內(nèi)參照。引物序列見表1。擴增條件：50℃ 2min; 95℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 1min，40個循環(huán)。 應用Quantity One 4. 6. 2 軟件（ Bio Rad公司） 進行數(shù)據(jù)處理，分析結(jié)果。

3.5 western blotting 檢測PI3K、p-Akt、p-mTOR和自噬調(diào)控因子LC3II蛋白表達

收集兩組細胞，PBS洗滌2次，提取各組細胞總蛋白，按BCA蛋白濃度測定試劑盒方法測定總蛋白濃度，取等量總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2h，加入兔抗鼠PI3K、p-Akt、p-mTOR、LC3II一抗（ 1∶200），4℃過夜，TBST緩沖液漂洗2次，加入HRP標記的羊抗兔二抗（ 1∶5000），室溫反應 2h，TBST洗膜3次，ECL增強發(fā)光試劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光，顯影定影后觀察結(jié)果。

3.6 統(tǒng)計學分析

運用 SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行實驗數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析方法，結(jié)果以均值±標準差（）表示，P<0.05表明差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1. 人參皂苷Rg1對K562細胞增殖的影響

實驗組K562經(jīng)20 μmol·Lˉ1人參皂苷Rg1處理48 h后，抑制率為（35.23±0.26）;與對照組相比，實驗組K562細胞增殖抑制率升高，細胞增殖能力下降，差異有統(tǒng)計學意義（P <0.05）。

2. Rg1對K562細胞SA-β-Gal染色陽性率的影響

K562細胞經(jīng)不同組處理48h后，與對照組比較，實驗組K562細胞SA-β-Gal染色陽性率增高（見表2），差異有統(tǒng)計學意義。（P<0.05）。

3.人參皂苷Rg1對K562細胞hTERT活性的影響

對照組hTERT蛋白表達為65.220±1.611%，實驗組hTERT蛋白表達為21.117±1.166 %（P<0.01）;與對照組比較，實驗組K562細胞hTERT蛋白表達下調(diào)。

4. 人參皂苷Rg1對K562細胞自噬因子LC3Ⅱ表達的影響

對照組K562細胞自噬因子LC3II表達量為30.477±0.828 %，實驗組LC3II表達量為18.790±2.305 %;與對照組比較，Rg1組K562細胞LC3II蛋白表達明顯下調(diào)（P<0.05）。

5. 人參皂苷Rg1對K562細胞PI3K、Akt和mTOR mRNA表達的影響

經(jīng)過濃度為20 μmol·L-1的人參皂苷Rg1作用48h，與對照組比較，Rg1組K562細胞PI3K、Akt和mTOR mRNA表達水平明顯上調(diào)（見表3）。

6. 人參皂苷Rg1對K562細胞PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達的影響

與對照組比較，Rg1組K562細胞PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達水平上調(diào)（見表4）

討論

白血病是一類由造血干細胞惡性克隆形成的疾病，白血病的傳統(tǒng)治療包括骨髓移植和化療，骨髓移植供體來源缺，治療費用昂貴，化療副作用大，特異性差，且化療藥物在殺傷白血病細胞的同時也對機體正常細胞起到損傷的作用，探尋既能殺滅白血病細胞又能保護正常血液細胞的調(diào)控劑是白血病治療研究的新策略。

人參是祖國醫(yī)學“補氣活血”的君藥，具有生血，補氣，抗衰老，抗腫瘤的功效，Rg1對白血病K562細胞具有抑制增殖分化的功能。據(jù)報道，K562細胞與5、10、20、40、80μmol·Lˉ1劑量的人參皂苷共培養(yǎng)24、48、72h后，20 μmol·Lˉ1人參皂苷Rgl與K562細胞共培養(yǎng)48 h 時，對K562細胞增殖抑制作用最強。[6]Rg1能否通過誘導K562細胞衰老達到抑制白血病的作用是本文著重關注的問題。

細胞異常增殖是腫瘤的基本特征之一，細胞衰老是抑制增殖的重要機制，檢測腫瘤細胞增殖能力是評價腫瘤發(fā)生發(fā)展和腫瘤細胞衰老程度的重要指標。衰老的細胞內(nèi)SA-β-Gal活性上調(diào)，與X-Gal反應后在顯微鏡下呈現(xiàn)深藍色，是鑒定細胞衰老的重要標識。端粒-端粒酶系統(tǒng)與細胞增殖和衰老有關，端粒酶的高表達可使細胞永生化，進而引起腫瘤無限增殖;衰老細胞端粒長度縮短，端粒酶活性下降hTERT與端粒酶活性呈正相關[7]。本研究將Rg1體外作用于K562細胞，結(jié)果顯示，Rg1誘導后K562細胞增殖能力顯著下降，SA-β-Gal染色陽性細胞數(shù)量增多，hTERT活性顯著下降，這些改變與細胞衰老的生物學變化一致，提示Rg1可在體外誘導K562細胞衰老。

自噬通過清除氧自由基和受損細胞器及誘導細胞程序性死亡，來維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和基因組穩(wěn)定，抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展;同時細胞通過自噬清除其損傷的細胞器或錯誤折疊蛋白發(fā)揮調(diào)控細胞衰老的功能，細胞自噬水平下降可加速細胞衰老的發(fā)生。LC3-II的含量的多少與自噬體數(shù)量的多少呈正比，是反映自噬強度的指標。Rg1誘導后K562細胞PI3K，Akt和mTOR mRNA表達上調(diào)，PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達上調(diào)，說明Rg1可通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路而抑制細胞自噬，自噬調(diào)控分子LC3-II的表達下調(diào)，從而在誘導細胞衰老中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

【參考文獻】

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[6]韓艷軍，王翠麗，劉小虎，等. 人參皂苷Rg1對K562細胞增殖的影響[J]. 大理大學學報，2020，5：16-20.

[7]Aref S，El A M，El S A，et al. Prognostic Value of CD200 Expression and Soluble CTLA-4 Concentrations in Intermediate and High-Risk Myelodysplastic Syndrome Patients[J]. Asian Pac J Cancer Prev，2020，21（8）：2225-2230.

[基金項目]國家自然科學基金（81860038;81660731;81873103）

[第一作者]周雯，碩士生，從事中藥藥理學相關研究，

[通訊作者]*周玥，博士，教授，碩士生導師，研究方向為中藥藥理學