馬湘成,張高立,高廣春,王春琳,母昌考,葉央芳,史 策*

（1.寧波大學 海洋學院,浙江 寧波 315832;2.浙江海洋高效健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江 寧波 315832;3.杭州橫士蟹客海洋科技有限公司,浙江 杭州 311106;4.浙大城市學院 信息與電氣工程學院,浙江 杭州 310015）

青蟹(Scyllaspp.)味道鮮美、營養(yǎng)價值高,深受東亞和東南亞地區(qū)消費者喜愛[1-2].作為我國主要海水養(yǎng)殖蟹類,其2019 年養(yǎng)殖產(chǎn)量為16.06×104t,占海水蟹類養(yǎng)殖總產(chǎn)量的54.7%[3],其中,90%以上產(chǎn)量來自擬穴青蟹(Scylla paramamosain)[4].我國擬穴青蟹生產(chǎn)以池塘養(yǎng)殖為主,但該方式相對粗放,畝產(chǎn)較低,制約了擬穴青蟹養(yǎng)殖業(yè)的進一步發(fā)展[5].工廠化苗種培育為解決上述問題提供了新的途徑,但目前擬穴青蟹的工廠化中間培育技術還不成熟,苗種存活率仍然較低[6].

現(xiàn)有研究表明,適宜的養(yǎng)殖容器顏色可顯著促進養(yǎng)殖對象的生長和存活,提高餌料利用率[7-9],而不適宜的養(yǎng)殖容器顏色則會導致養(yǎng)殖動物生長遲緩,甚至死亡[10].如Eslamloo 等[11]發(fā)現(xiàn)金魚(Carassius auratus)在白色背景中生長最快,其血漿的皮質(zhì)醇水平顯著低于紅色背景.對于甲殼動物,紅螯螯蝦(Cherax quadricarinatus)在黑色養(yǎng)殖容器中的體重增長量、特定生長率和存活率最高[12].而鋸緣青蟹(S.serrata)幼體在暗色的養(yǎng)殖容器中發(fā)育更快、存活率更高[13].

此外,養(yǎng)殖容器顏色還會影響?zhàn)B殖動物的體色[14].Kasagi 等[15]發(fā)現(xiàn)虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的體色亮度與養(yǎng)殖容器顏色的亮度呈正相關.而黑色容器能顯著促進紅櫻桃蝦(Neocaridina davidi)的著色,明顯提高其蝦青素含量[16].養(yǎng)殖動物體色是影響消費者選購的重要依據(jù)之一[17],因此有必要對養(yǎng)殖動物的體色進行調(diào)控.

盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖容器會影響水生生物的生長和體色,但目前其對擬穴青蟹的影響尚未見報道.為此本研究通過46 d的擬穴青蟹幼蟹養(yǎng)殖,評估了6 種養(yǎng)殖容器顏色(紅、黃、綠、藍、黑和白)對幼蟹生長、應激和甲殼顏色的影響,以期獲得擬穴青蟹幼蟹較適宜的養(yǎng)殖容器顏色,為擬穴青蟹幼蟹的工廠化中間培育提供技術支持.

1 材料與方法

1.1 實驗設計和養(yǎng)殖條件

實驗于2020 年7 月至8 月間進行,實驗動物選用寧波市某水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)的擬穴青蟹C1 期幼蟹.實驗前,在塑料桶內(nèi)對幼蟹暫養(yǎng)3 d,選擇健康、活力好且附肢完整的幼蟹(0.02±0.01)g 裝于有0.5 L海水的聚乙烯養(yǎng)殖容器(內(nèi)尺寸:130 mm×83 mm× 48 mm)中.養(yǎng)殖容器的顏色分別為紅、黃、綠、藍、黑和白共6 種,容器顏色的Lab 值見表1.每個養(yǎng)殖容器內(nèi)放1 只幼蟹,每個顏色處理設置30個重復.養(yǎng)殖用海水經(jīng)過濾和紫外消毒后,鹽度22‰～ 25‰,溫度21～27 ℃,溶解氧＞6 mg·L-1,pH 值8.0～ 8.5,總氨氮(TAN)＜0.5 mg·L-1.每個養(yǎng)殖盒中都放置1個透明聚乙烯網(wǎng)片供幼蟹棲息和躲避(規(guī)格:10 目,30 mm×20 mm).實驗使用的自然光周期約為14 h光照和10 h黑暗,光強范圍為2 000～3000 lx.于每天7:00 和18:00 各投喂一次商品飼料(浙江天邦公司,40.0%蛋白質(zhì)、6.0%脂肪、5.0%纖維、12.0%水分、18.0%灰分、1.2%總磷、2.0%賴氨酸),每次投喂后2 h 收集殘留餌料,記錄幼蟹前5 周的日攝食量.每天6:00 換水,換水率為100%,記錄幼蟹的蛻殼和存活情況.于養(yǎng)殖結束后稱量幼蟹體重并拍照,然后液氮凍存?zhèn)溆?

表1 不同養(yǎng)殖容器顏色的L*值、a*值和b*值

1.2 存活和生長數(shù)據(jù)測定

存活率、生物量、特定生長率(SGR)、增重率(WG)、重量變異系數(shù)(CV)、蛻殼頻率和攝食量的計算公式如下:

式中:C為存活率,%;Oi為實驗開始時活蟹數(shù)量,只;Of為實驗結束時活蟹的數(shù)量,只;S為生物量,g·m-3;Wt為蟹的總質(zhì)量,g;V為養(yǎng)殖容器容積,m3;ZSGR為特定生長率,%·d-1;Wf為蟹最終質(zhì)量,g;Wi為蟹的初始質(zhì)量,g;t為實驗持續(xù)時間,d;GWG為增重率,%;VCV為質(zhì)量變異系數(shù);U為末重標準差;k為蛻殼頻率;K為存活青蟹總蛻殼次數(shù);L為存活青蟹數(shù)量;n為攝食量,g·(只·d)-1;N為存活青蟹的總攝食量,g;E為存活青蟹數(shù)量,只;D為總天數(shù),d.

1.3 代謝物和酶活測定

皮質(zhì)醇、葡萄糖(Glu)、乳酸(LD)、丙二醛(MDA)和樣本的蛋白含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙酮酸激酶(PK)和己糖激酶(HK)活力測定均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒,方法參照試劑盒的操作說明.

SOD的活力定義:每毫克組織蛋白在1 mL 反應液中SOD 抑制率達50%時所對應的SOD 量為1個SOD 活力單位(U).

CAT的活力定義:每毫克組織蛋白每秒分解1 μmol H2O2的量為1個活力單位(U).

PK的活力定義:在37 ℃、pH 7.6 條件下,每克組織蛋白每分鐘分解1 μmol 磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)為丙酮酸為1個酶活力單位.

HK的活力定義:在37 ℃、pH 7.6 條件下,每毫克組織蛋白每分鐘生成1 mmol 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)定義為1個酶活力單位.

1.4 體色測定

采用數(shù)碼相機(iphone,MWF12CH/A)拍攝幼蟹,并選擇Pantone 國際標準色卡作為拍攝比色卡,以便于校準.拍攝時固定數(shù)碼相機的相關拍攝系數(shù),在相同的布光條件下(6 000 lx,全光譜)拍攝樣本.利用Lab 顏色模型分析青蟹幼蟹的體色變化,該模型由3個要素組成,1個要素是亮度(L*),取值范圍是0～100.另2個要素是顏色通道a*和b*,a*代表從綠色到紅色的分量,取值范圍是-128～127;b*代表從藍色到黃色的分量,取值范圍是-128～127.利用Adobe Photoshop CS9 軟件分析圖像Lab值.

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 22.0 軟件對各處理組進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan 多重比較,數(shù)據(jù)均用“平均值±標準誤差”表示.使用線性回歸評估養(yǎng)殖容器顏色和甲殼顏色之間的關系.決定系數(shù)(R2)表示線性回歸的適用性,當R2的值接近1時,表明可以更好地擬合回歸模型.

2 結果與分析

2.1 養(yǎng)殖容器顏色對擬穴青蟹幼蟹生長的影響

在不同的養(yǎng)殖容器顏色下,擬穴青蟹幼蟹的生長產(chǎn)生了一定的差異(圖1),主要表現(xiàn)在黃色組與藍色組幼蟹的增重率、特定生長率和生物量都顯著高于其他組(P＜0.05).黃色組、黑色組和藍色組幼蟹的存活率均大于63%,高于白色組(50%)、綠色組(50%)和紅色組(36.67%)(圖1(a)).黑色組幼蟹CV 最低,其次是黃色組、藍色組、綠色組和白色組的CV 在10～17 之間,紅色組的CV 最高,達到32.25(圖1(c)).此外,黃色組的幼蟹攝食量顯著高于其他組(P＜0.01,圖1(d)).

圖1 不同顏色養(yǎng)殖容器中擬穴青蟹幼蟹的存活率(a)、末重(b)、質(zhì)量變異系數(shù)(c)、攝食量(d)、增重率(e)、特定生長率(f)、蛻殼頻率(g)和生物量(h)

2.2 養(yǎng)殖容器顏色對擬穴青蟹幼蟹應激的影響

養(yǎng)殖容器顏色對擬穴青蟹幼蟹產(chǎn)生了一定的應激影響.紅色組和黃色組幼蟹的皮質(zhì)醇水平顯著高于藍色組、黑色組和白色組,而黑色組幼蟹的皮質(zhì)醇水平最低,顯著低于紅色組、黃色組和綠色組(P＜0.01).盡管養(yǎng)殖容器顏色對幼蟹的葡萄糖含量無顯著影響(P＞0.05),但藍色組的幼蟹HK 活力最低,顯著低于紅色組、綠色組和白色組(P＜0.05).養(yǎng)殖容器顏色對幼蟹的PK 活力也無顯著影響(P＞0.05),但紅色背景導致幼蟹的乳酸水平顯著高于其他組(P＜0.01).

養(yǎng)殖容器顏色還導致幼蟹膜脂過氧化和抗氧化酶活性變化.如紅色組的幼蟹MDA 含量顯著高于其他處理組,而藍色和黑色組的幼蟹MDA 含量顯著低于其他處理組(P＜0.01).黃色組幼蟹SOD活力顯著高于其他組(P＜0.01).而黃色和藍色組的幼蟹CAT 活力顯著高于紅色組、黑色組和白色組(P＜0.05).

2.3 養(yǎng)殖容器顏色對擬穴青蟹幼蟹甲殼顏色影響

養(yǎng)殖容器顏色顯著影響了擬穴青蟹幼蟹的甲殼顏色(圖2 和表2).黑色組幼蟹甲殼亮度L*值(17.73±1.88)最低(P＜0.01),其次是紅色組和藍色組,最高的是綠色組、黃色組和白色組.黑色組和紅色組幼蟹甲殼顏色的a*值顯著高于其他組,其次是藍色組和白色組,綠色組和黃色組的最低.此外,黃色組幼蟹甲殼顏色的b*值最高,其次是綠色組、白色組、藍色組和紅色組,黑色組的b*值最低.

表2 不同顏色養(yǎng)殖容器中擬穴青蟹幼蟹甲殼顏色的Lab 值

圖2 不同顏色養(yǎng)殖容器中擬穴青蟹幼蟹

由圖3 可知,L*、a*、b*的R2分別為0.801 7、0.412 8 和0.191 3,說明擬穴青蟹幼蟹甲殼顏色的L*、a*、b*值的80.17%、41.28%和19.13%由養(yǎng)殖容器的顏色決定.幼蟹甲殼顏色與容器顏色的L*值的擬合程度更好.

圖3 實驗容器顏色的L*、a*、b*值(x)與擬穴青蟹甲殼顏色的L*、a*、b*值(y)的關系

3 討論

養(yǎng)殖動物的存活和生長會受到養(yǎng)殖容器顏色的影響[9,18-20].同樣,擬穴青蟹幼蟹的存活和生長也受到養(yǎng)殖容器顏色的直接影響.擬穴青蟹幼蟹在紅色養(yǎng)殖容器中存活率最低,在藍色和黃色容器中特定生長率和生物量最高,這與黃顙魚(Pelt-eobagrus fulvidraco)幼魚的研究結果相似[21].但與本研究不同的是,鋸緣青蟹幼體在深色背景中(黑色、暗紅及暗綠)存活率較高[13],而羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)幼體在紅色和綠色容器中的存活率較高[22],這可能暗示著養(yǎng)殖動物對養(yǎng)殖容器顏色的偏好具有物種特異性[23].

當外界環(huán)境或機體內(nèi)環(huán)境發(fā)生劇烈變化時,生物體內(nèi)往往產(chǎn)生活性氧(ROS),過量的ROS 對生物體造成氧化損傷[24].蟹類作為無脊椎動物,含非特異性免疫系統(tǒng),特別是抗氧化系統(tǒng)在抵抗外界環(huán)境脅迫方面發(fā)揮著重要作用[25].正常狀態(tài)下,生物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)可清除代謝產(chǎn)生的多余ROS[26].抗氧化系統(tǒng)主要由SOD 和CAT 組成,其中SOD能夠清除機體內(nèi)部的活性氧自由基,將其轉化為H2O2,隨后CAT 將H2O2完全分解成水和氧氣,保護生物體的組織和細胞不受氧化損傷[27].本研究中,紅色組幼蟹的SOD 和CAT 活力較低,而脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量較高,說明紅色背景會使擬穴青蟹幼蟹產(chǎn)生較多氧化應激.與紅色相反,黃色對幼蟹氧化應激是適中的,沒有造成嚴重氧化損傷,這可能是由于黃色組青蟹通過增加攝食獲得更多能量,以抵抗應激脅迫.Kang等[28]發(fā)現(xiàn)明亮的養(yǎng)殖容器顏色可促進牙鲆(Paralichthys olivaceus)血液中的皮質(zhì)醇適當增加,反而增強了其攝食和生長.

皮質(zhì)醇是生物體在應激狀態(tài)下產(chǎn)生的一種類激素,其水平的高低反映了生物體的應激狀態(tài)[29].抵抗脅迫是一個能量消耗的過程,需要消耗大量的儲能物質(zhì)以補充機體消耗的能量[30].皮質(zhì)醇可促進糖原分解,增加葡萄糖含量,并通過糖異生作用促進脂質(zhì)的利用,進而為機體供能[31].本研究中,紅色組和黃色組青蟹的皮質(zhì)醇水平較高,表明其受到了更多脅迫.另一方面,在有氧呼吸產(chǎn)生的能量不足以滿足代謝需求時,生物體會通過糖酵解途徑來補充能量[32].糖酵解途徑是葡萄糖在無氧條件下分解供能的過程,其中丙酮酸激酶(PK)和己糖激酶(HK)是糖酵解途徑兩個關鍵限速酶[33].本研究中紅色養(yǎng)殖容器激活了幼蟹的HK 活性,并導致了乳酸積累,表明幼蟹已借助糖酵解途徑產(chǎn)能以抵抗應激.

甲殼動物的體色不但能夠作為個體間的通訊訊號,也可以作為生理變化的表觀表現(xiàn)[34],是基因和環(huán)境因素共同作用的結果[35].本研究表明擬穴青蟹幼蟹的甲殼顏色逐漸趨近于養(yǎng)殖容器顏色.如黃色組幼蟹甲殼顏色的+b*值趨近黃色,紅色組幼蟹甲殼顏色的+a*值趨近紅色,而綠色組幼蟹甲殼顏色的-a*值趨近綠色,黑色組幼蟹甲殼顏色的L*值亮度最低.斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)也表現(xiàn)出類似的顏色適應反應,在暴露于深色或淺色的基質(zhì)時會擴張或收縮其皮下的著色結構[36].該過程往往是通過富集蝦青素完成[37],而蝦青素的富集需要消耗能量,從而負面影響了甲殼動物的生長[38],魚類中也存在類似現(xiàn)象[39].保護色無疑有助于動物躲避敵害,但過于強烈的體色變化可能意味著更多的能量消耗.前人研究發(fā)現(xiàn),黑色容器中養(yǎng)殖的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)幼蟹體色變化劇烈,導致了最低的生長速度[40].因此,本研究中黑色組幼蟹強烈的體色變化可能影響了其存活和生長.

4 結語

盡管擬穴青蟹幼蟹在黃色和藍色的容器都具有較好的生長表現(xiàn),但黃色組具有較高的皮質(zhì)醇和無氧呼吸水平,可能表明其消耗了更多能量以抵抗應激.因此,藍色容器更適合擬穴青蟹幼蟹的中間培育.