張鑫眾，孫倩倩，王錦姝，劉 剛

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 鄭州 450003；3.河南省人民醫(yī)院臨床單細(xì)胞生物醫(yī)學(xué)中心，河南 鄭州 450003)

食管癌是最常見的消化道腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率在世界上分別位于第7位和第6位[1]。由于食管癌的發(fā)病隱匿，大多數(shù)食管癌患者確診時已發(fā)展到中晚期，因此，治療失敗、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是食管癌患者病死率高的主要原因之一[2]。食管癌的形成、演變和轉(zhuǎn)移是一個多分子參與、相互調(diào)節(jié)的復(fù)雜生物學(xué)過程，其中表觀遺傳學(xué)改變起著重要作用。表觀遺傳學(xué)是指除調(diào)控DNA基因序列表達(dá)以外的綜合因素，不涉及DNA序列的變化，主要包括：組蛋白修飾、基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化和微RNA(microRNA,miRNA)的甲基化等，其中組蛋白甲基化表觀遺傳學(xué)調(diào)控在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3]。賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶4C(lysine-specific histone demethylase 4C，KDM4C)是一種重要的組蛋白去甲基化酶，可以催化去除組蛋白賴氨酸殘基甲基化標(biāo)記，參與調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定、基因轉(zhuǎn)錄沉默、維持胚胎干細(xì)胞自我更新、分化潛能等生物進(jìn)程[4]。研究顯示，KDM4C在食管癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌等多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高頻擴增或過表達(dá)，并與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)[5-8]。本文針對KDM4C在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其靶向抑制劑的相關(guān)研究進(jìn)行綜述，以期為食管癌的早期診斷及靶向治療藥物的研發(fā)提供參考。

1 KDM4C的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能

KDM4C又被稱為食管鱗狀細(xì)胞癌擴增基因1(gene am-plified in squamous cell carcinoma 1，GASC1)。2000年，YANG等[4]使用熒光原位雜交和Southern blot分析繪制了9p23-24擴增子，通過Northern blotting篩選該擴增子中存在的靶基因轉(zhuǎn)錄本，利用該方法成功從食管癌細(xì)胞系中克隆并擴增出新基因GASC1，GASC1在多種惡性腫瘤組織中過表達(dá)。KDM4C基因位于9p24.1，長度約為407 kb，全長 3 171個堿基，共有1 056個氨基酸，是由1個N末端十字域(Jumonji N，JMJN)結(jié)構(gòu)域和1個C末端十字域(Jumonji C，JMJC)結(jié)構(gòu)域、2個植物同源結(jié)構(gòu)域(plant homeodomains，PHD)與Tudor結(jié)構(gòu)域組成[9-11]。其中，JMJC結(jié)構(gòu)域作為JMJD家族的酶活性中心存在，構(gòu)成組蛋白去甲基化功能的催化部分，JMJN結(jié)構(gòu)域主要與KDM4C的轉(zhuǎn)錄與調(diào)節(jié)相關(guān)[12]。

KDM4C是一個通過調(diào)控遺傳信息分布來維持組蛋白去甲基化和染色體穩(wěn)定性的關(guān)鍵蛋白，其定位于染色體的有絲分裂過程中，與組蛋白H3賴氨酸K9三甲基化(histone H3K9 trimethylation,H3K9me3)的去甲基化過程密切相關(guān)。三甲基化或二甲基化的組蛋白H3K9me3/me2中有特異性結(jié)合位點，可與異染色質(zhì)蛋白1(heterochromatin protein 1，HP1)結(jié)合后形成穩(wěn)定的異染色質(zhì)從而激活機體的正常保衛(wèi)機制，阻止正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)變，但由于KDM4C具有很強的去甲基化作用，H3K9me3/me2在其作用下轉(zhuǎn)化為H3K9me1，進(jìn)而破壞HP1的結(jié)合位點，使異染色質(zhì)難以形成與維持，導(dǎo)致基因不穩(wěn)定，誘發(fā)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10,13-14]。KDM4C在正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，KDM4C基因不僅參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展、侵襲等過程，在正常組織中也扮演著重要角色。KDM4C在小鼠胚胎發(fā)育的不同時期均有不同程度的表達(dá)，且在胚胎后期表達(dá)量最高，若在此細(xì)胞期沉默KDM4C可使胚胎發(fā)育停滯，表明KDM4C可以影響胚胎發(fā)育和分化[15]。此外，在胚胎干細(xì)胞中下調(diào)KDM4C基因的表達(dá)和增加組蛋白H3K9me3的合成，可以抑制Pou5f1/Sox2/NANOG信號通路，這些信號通路在維持干細(xì)胞多能性和自我更新能力方面發(fā)揮重要作用，這表明敲除KDM4C會抑制細(xì)胞的增殖分化[16]。與正常組織相比，KDM4C在多種腫瘤組織中的表達(dá)明顯升高，表明KDM4C的異常高表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展等過程密切相關(guān)。

2 KDM4C與食管癌的發(fā)生和發(fā)展

食管癌的發(fā)生和發(fā)展是一個復(fù)雜連續(xù)的多基因、多步驟過程，其中包括臨近組織的侵襲、淋巴組織的轉(zhuǎn)移及經(jīng)血液系統(tǒng)向遠(yuǎn)處定植等[17-20]。食管癌的發(fā)生和發(fā)展受組蛋白甲基化表觀遺傳學(xué)調(diào)控，組蛋白的甲基化平衡狀態(tài)由組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(histone lysine methyltransferases,HKMTs)與組蛋白賴氨酸去甲基化酶(histone lysine demethylases,HKDMs)來共同協(xié)調(diào)與維持[21-23]。KDM4C作為HKDMs的一員，在促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移中發(fā)揮作用[24]。雖然目前的研究結(jié)果支持KDM4C為致癌基因，但對于其過度表達(dá)究竟是腫瘤發(fā)生的原因還是結(jié)果目前還存在爭議。因為KDM4C在腫瘤細(xì)胞中的基因組擴增和多種致癌特性，所以其主要被認(rèn)為是一個致癌基因，可作為抗腫瘤表觀遺傳藥物的潛在靶點。

KDM4C作為食管癌細(xì)胞系KYSE-150細(xì)胞的主要擴增靶點，參與食管癌發(fā)生、發(fā)展中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并在食管癌惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用[4]。有研究將KDM4C表達(dá)下調(diào)的雜合子小鼠與野生型小鼠進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，KDM4C低表達(dá)的雜合子小鼠良、惡性腫瘤的發(fā)生及多樣性均降低，選擇性敲除KDM4C基因后食管癌的細(xì)胞活性受到抑制，體內(nèi)轉(zhuǎn)化實驗顯示，KDM4C低表達(dá)的雜合子小鼠的腫瘤體積顯著減??；表明KDM4C基因敲除可降低食管癌細(xì)胞在體內(nèi)的生存和增殖能力[25]。腫瘤起始細(xì)胞(tumor initiating cell，TIC)由于其固有的干細(xì)胞特性，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展及腫瘤復(fù)發(fā)的主要驅(qū)動力，從食管癌患者來源的腫瘤標(biāo)本中可分離出具有乙醛脫氫酶高活性亞細(xì)胞群(aldehyde dehydrogenase bright stem cells，ALDHbri+)亞型細(xì)胞群，同樣具有干細(xì)胞特性[26]。YUAN等[27]研究顯示，通過下調(diào)KDM4C降低食管癌中ALDHbri+TIC的表達(dá)，可使食管癌的惡性進(jìn)展受到顯著抑制。KDM4C在食管癌中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期等密切相關(guān)，在已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的食管癌患者中，KDM4C陽性率遠(yuǎn)高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的食管癌患者，靶向敲除KDM4C基因可以降低食管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，因此，通過調(diào)控KDM4C的表達(dá)可以改善食管癌的病情進(jìn)展[22,28]。LIU等[5]為驗證KDM4C擴增與腫瘤細(xì)胞惡性表型之間的關(guān)系，對乳腺癌良、惡性細(xì)胞系進(jìn)行了全基因組分析，結(jié)果表明，KDM4C擴增表達(dá)的細(xì)胞系均為侵襲、轉(zhuǎn)移性強的細(xì)胞株。

以上研究結(jié)果證實，KDM4C伴隨著食管癌病情進(jìn)展而呈現(xiàn)明顯的高表達(dá)趨勢，KDM4C的表達(dá)與食管癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲密切相關(guān)。此外，腫瘤組織侵襲轉(zhuǎn)移很大程度上影響癌癥患者的治療與預(yù)后，諸多研究表明，超過90%的癌癥患者死于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而并非是腫瘤原發(fā)灶[29-30]。

3 KDM4C與食管癌患者的預(yù)后

食管癌的早期癥狀隱匿，其主要表現(xiàn)為吞咽不適，包括吞咽食物時的梗噎感、胸骨后方燒灼感、停滯感或異物感等，?？赏ㄟ^吞咽口水緩解或消失，且癥狀時輕時重，不易察覺，確診時多因已進(jìn)入中晚期而錯過最佳的治療時間[31-34]。雖然食管癌的診斷及治療已取得重大進(jìn)展，但多數(shù)食管癌患者預(yù)后仍較差，主要歸因于腫瘤分化程度低、惡性程度高、在確診時多數(shù)已發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。因此，阻止食管癌發(fā)生鄰近組織的侵襲和遠(yuǎn)處器官的轉(zhuǎn)移對食管癌的治療和延長患者生存至關(guān)重要[35-37]。

自從KDM4C被從食管癌細(xì)胞株中擴增出來，其陽性表達(dá)就與腫瘤的發(fā)展進(jìn)程及患者的預(yù)后表現(xiàn)出密切的聯(lián)系[27]。Kaplan-Meier生存分析顯示，細(xì)胞核中KDM4C高表達(dá)的食管癌患者5 a生存率為26.5%，而KDM4C陰性或低表達(dá)患者的 5 a生存率為43.7%。多變量分析顯示，KDM4C的高表達(dá)可作為食管癌患者預(yù)后的預(yù)測因素[38]。SUN等[16]研究表明，KDM4C在食管癌細(xì)胞中可通過調(diào)控MDM2啟動子上的組蛋白甲基化來誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而降低抑癌基因p53蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。除了MDM2以外，KDM4C在食管癌細(xì)胞中也激活另外2個高?；騊PARG和NANOG，而MDM2、PPARG和NANOG是食管癌預(yù)后不良強有力的預(yù)測因子[27]。此外，人食管癌細(xì)胞中TIC群體的存在被認(rèn)為是腫瘤患者對化學(xué)治療耐藥及復(fù)發(fā)的主要驅(qū)動力。從食管癌患者來源的腫瘤標(biāo)本中分離的細(xì)胞亞群帶有ALDHbri+TIC表型，KDM4C可增強食管癌中ALDHbri+TIC亞群的表達(dá)，提示KDM4C能夠靶向ALDHbri+TIC，影響患者的生存率及預(yù)后[27]。因此，針對KDM4C靶向治療的研究對抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、侵襲和延長食管癌患者的生存時間至關(guān)重要[39-40]。

4 KDM4C靶向抑制劑的研究

研究表明，增強KDM4C的催化活性和表達(dá)可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，通過調(diào)控KDM4C的表達(dá)可改善食管癌的病情[41-43]。KDM4C對組蛋白甲基化狀態(tài)的影響與患者的不良預(yù)后、復(fù)發(fā)和耐藥性均有關(guān)，因此，KDM4C可以作為癌癥的潛在治療靶點[44]。KDM4C抑制劑根據(jù)作用機制的不同可分為4類：(1)α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)或2-氧代戊二酸(2-oxoglutarate，2-OG)輔助因子類似物；(2)金屬輔助因子干擾劑，該類抑制劑可通過破壞鐵和鋅輔助因子的結(jié)合來抑制KDM4蛋白的催化活性；(3)組蛋白底物競爭性抑制劑，比如賴氨酸組蛋白底物模擬物可競爭性抑制組蛋白去甲基化酶活性；(4)環(huán)肽，環(huán)肽是最近開發(fā)出的一種新型抑制劑，可通過底物和非輔助因子相互作用而選擇性抑制KDM4C[45]。然而，迄今為止，KDM4C的有效靶點抑制劑的開發(fā)與發(fā)展進(jìn)程仍然較慢。

大多數(shù)KDM4C抑制劑是屬于α-KG或2-OG輔助因子類似物抑制劑，如草酸衍生物N-草酰甘氨酸(N-Oxalylglycine，NOG)，已被確定為KDM4C的弱抑制劑[46]。這些抑制劑在催化位點競爭性地與KDM4C中的Fe(II)分子結(jié)合并抑制該蛋白的關(guān)鍵區(qū)域[47]。所有含JMJC的去甲基化酶的去甲基化都需要α-KG，因此，開發(fā)KDM4C靶向抑制劑α-KG/2-OG類似物是一種可行的策略。雖然有些2-OG類似物已被證明是有效的抑制劑，但由于這些化合物含有較大的親水結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其細(xì)胞滲透性較差。異羥肟酸酯類的2-OG輔助因子類似物抑制劑NCDM32針對KDM4C的抑制活性是NOG的500倍?；衔颯AHA針對KDM4C的抑制活性是NOG的500倍，其針對KDM4C的靶向選擇性是NOG的100倍[48]。雖然對異羥肟酸酯類KDM4C選擇性抑制劑進(jìn)行了許多研究，但對其在臨床上的選擇性和功效的應(yīng)用研究卻少有報道。通過Chem-seq和表型篩選方法鑒定出8-羥基喹啉類衍生物SD70為KDM4C特異性抑制劑[49]。此外，一些吡啶羧酸類化合物也屬于KDM4C選擇性抑制劑[50]。非鐵金屬破壞鐵和鋅輔助因子的結(jié)合，如鎳通過占據(jù)Fe(II)分子結(jié)合位點從而抑制KDM4C的催化活性。組蛋白底物競爭性抑制劑CP2顯示出對KDM4C的選擇性抑制作用(半抑制濃度為39 nmol·L-1)[51]。

KDM4C蛋白在活性位點上具有高度保守性。大多數(shù)KDM4C靶向抑制劑結(jié)合位點在輔助因子或底物上，易出現(xiàn)較低選擇性和脫靶效應(yīng)[52]。為了克服這一困難，目前探索開發(fā)了新的抑制劑類型“環(huán)肽”，其通過底物和獨立輔助因子的相互作用來靶向抑制KDM4C。環(huán)肽結(jié)合在KDM4C表面遠(yuǎn)離活性位點的變構(gòu)位點和保守程度較低的區(qū)域[53]。這些研究結(jié)果可能有助于開發(fā)KDM4C選擇性抑制劑的新結(jié)合位點。

5 前景與展望

食管癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移嚴(yán)重影響患者的5 a生存率，通過一種特定標(biāo)志物或基因來有效預(yù)測及控制食管癌的病情進(jìn)展極為重要。對KDM4C的研究有助于了解KDM4C蛋白與其特定基因程序之間的相互作用與機制，從而為食管癌診斷與治療提供更有力的理論支撐。KDM4C蛋白的表達(dá)升高，在多種腫瘤組織和細(xì)胞中可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成，提示KDM4C可能成為腫瘤治療的重要靶標(biāo)[54]。組蛋白甲基化表觀遺傳學(xué)變化具有可逆性，因此將KDM4C靶向抑制劑用于抗癌藥物的方案是可行的。目前多數(shù)關(guān)于KDM4C抑制劑的研究是以輔助因子和底物模擬物為基礎(chǔ)，且大多數(shù)抑制劑對KDM4C相似的非靶蛋白也有活性，因此，這種抑制劑可以被定義為是非選擇性的。開發(fā)有效且具有高選擇性的KDM4C抑制劑是目前面臨的主要任務(wù)之一。相比之下，環(huán)肽類抑制劑表現(xiàn)出對KDM4C更好的選擇性，是最有可能開發(fā)為腫瘤靶向治療的抑制劑類型。