馬鈺潔，高生英，葉 菊*

（1.青海民族大學藥學院，青海西寧 810007；2.青海省青藏高原植物資源化學重點實驗室，青海西寧 810007；3.青海省現(xiàn)代藏藥創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心，青海西寧 810007）

藏藥“辛木頭勤”為唇形科荊芥屬植物藍花荊芥（Nepeta coerulescens Maxim.）的干燥全草，生長于海拔2 000～4 800 m 的山坡、河灘、灌叢及林緣，為多年生草本，分布于西藏、青海、甘肅、四川等地。其味苦、微甘，性涼；功效為清瘡熱，清肝熱、生肌、止血；常用于肝炎、牙周炎等的治療[1]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)其乙酸乙酯相和正丁醇相具有顯著的抑菌作用，進一步從上述活性部位分離得到槲皮素、丹皮酚、N?反式阿魏酰酪胺、沒食子酸、鞣花酸、對羥基苯甲酸、齊墩果酸、β?谷甾醇等14 個單體成分[2]。洪志偉等[3]研究了槲皮素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用及作用機制。黑育榮等[4]發(fā)現(xiàn)齊墩果酸對多種植物病原菌有抑制作用。閆莉等[5]研究了鞣花酸對變異鏈球菌的抑菌活性及作用機制。文獻記載藍花荊芥具有治瘡瘍、濕疹、皮膚潰爛、出血等癥的作用，上述研究結(jié)果亦從藥理學方面證實了藍花荊芥有顯著的抑菌活性。然而筆者未見相關(guān)藍花荊芥抑菌成分及其藥效的研究報道。本研究采用醇提法、萃取法、柱層析法制備了10 種單體化合物，以紙片法[6]檢測以上成分對常見11 種細菌和3 種真菌的抑菌效果，為藍花荊芥在抑菌領(lǐng)域的應用提供參考，為研制低毒、高效、優(yōu)質(zhì)的天然抑菌藥物提供依據(jù)。

1 材料、儀器和試劑

1.1 實驗材料

原藥材于2018 年7 月采自青海省平安縣夏宗寺，由青海民族大學藥學院吉守祥教授鑒定為唇形科荊芥屬藍花荊芥。陰干，備用。

1.2 實驗菌種

試驗菌株均購自中國醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心（China Medical Culture Collection，CMCC）。1～11號為細菌，12～14號為真菌，詳見表1。

表1 供試病原菌

1.3 實驗儀器

PL202?L型電子天平（上海梅特勒?托利多儀器有限公司），SHB?Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），N?1100V?W型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株式會社），立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），SW?CJ?2FD型超潔凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司），MJX?160B?Z型霉菌培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），SPX?250B?Z型生化培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.4 實驗試劑

齊墩果酸、熊果酸、槲皮素、鞣花酸、沒食子酸、β?谷甾醇、木犀草素、對羥基苯甲酸、丹皮酚、蘆?。ㄗ灾疲兌取?8%）；兩性霉素、慶大霉素、氨芐青霉素鈉（上海源葉生物技術(shù)有限公司）；營養(yǎng)瓊脂、改良馬丁氏培養(yǎng)基（北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司）；乙醇、乙酸乙酯、正丁醇（分析純，天津市紅巖試劑化工廠）；高純水（青藏高原植物資源化學重點實驗室）。

2 實驗方法

2.1 供試樣品制備

取藍花荊芥藥材9 kg，粉碎，95%乙醇水浴溫熱浸泡24 h，過濾，減壓濃縮制膏。取浸膏適量，加水溶散，用乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到不同極性部位。采用柱層析法從乙酸乙酯相和正丁醇相分離純化得到10 個單體化合物。稱取各單體化合物0.20 mg，分別用100μL DMSO溶解，備用。

2.2 菌、孢子懸液及混菌平板制備

將細菌接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h。將真菌菌種接種到改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d。

將細菌培養(yǎng)物移至100 mL、0.9%無菌氯化鈉溶液，制成濃度為108 cfu/mL 的菌懸液。將真菌培養(yǎng)物移至5 mL、0.9%無菌氯化鈉溶液（含0.05%(V/V)吐溫80），并洗脫孢子。用移液槍吸取孢子懸液至無菌試管內(nèi)，加入100 mL、0.9%無菌氯化鈉溶液（含0.05%(V/V)吐溫80）中，制成濃度為108 cfu/mL的孢子懸液。

取無菌培養(yǎng)皿，注入培養(yǎng)基20 mL，放置水平臺面上使其凝固，作為底層。另取培養(yǎng)基適量加熱至48～50 ℃（芽孢可至60 ℃），加入菌懸液或孢子懸液2 mL，搖勻。每個培養(yǎng)皿中分別加入5 mL 上述培養(yǎng)菌，使其在底層上均勻攤布，作為菌層，放置在水平臺上冷卻。作為陰性對照，備用。

2.3 活性測試

2.3.1 抑菌活性的初篩

取無菌培養(yǎng)皿，注入培養(yǎng)基20 mL，凝固。取供試細菌懸液和真菌孢子懸液各2 mL，分別移至150 mL培養(yǎng)基中，混合均勻，吸取5 mL 至培養(yǎng)皿中，待其凝固，制得混菌平板。

無菌條件下，取“2.1”項下供試品溶液潤濕后的濾紙片，放至混菌平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)1 d，記錄藥物的抗菌活性。

2.3.2 抑菌活性的復篩

按照“2.3.1”項同樣方式制備混菌平板。

取陽性對照藥品兩性霉素B、氨芐青霉素鈉、硫酸慶大霉素適量，加入DMSO，分別制成2 .00 g/L 溶液。無菌條件下，取上述對照溶液及復篩試驗樣品溶液潤濕后的濾紙片，放至混菌平板上，供試細菌35～37 ℃培養(yǎng)18～24 h，供試真菌20～25 ℃培養(yǎng)24～48 h，用游標卡尺測量抑菌圈的直徑，計算相對抑菌率。相對抑菌率=（樣品平均抑菌直徑?陰性對照平均抑菌直徑）/陽性對照平均抑菌直徑×100%。

2.3.3 最小抑菌濃度的確定（MIC）

按照“2.3.1”項同樣方式制備混菌平板。

取復篩藥物適量配制成2.0、1.0、0.5、0.25 g/L 濃度梯度的溶液，按照“2.3.1”項同種方式制備混菌平板。取上述濃度復篩藥物溶液潤濕后的濾紙片置于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑，并確定最小抑菌濃度。

3 結(jié)果

3.1 抑菌活性初篩結(jié)果

對藍花荊芥極性部位分離純化后的單體化合物抑菌活性進行了初步篩選，結(jié)果見表2。

表2 藍花荊芥單體化合物抑菌活性初篩結(jié)果

如表2 所示，槲皮素、鞣花酸、對羥基苯甲酸、丹皮酚、沒食子酸對釀酒酵母菌有較強的抑菌作用；齊墩果酸對蠟狀芽孢桿菌有較強的抑制作用。β?谷甾醇、熊果酸、蘆丁、木犀草素對供試菌并無抑制作用。其中鞣花酸對甲型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、痢疾志賀氏菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌都有顯著的抑菌活性?，F(xiàn)代藥理學證實許多多酚類化合物具有廣譜的抑菌效果。C.Zongo 等[7]發(fā)現(xiàn)大黃多酚對葡萄菌屬具抑菌活性，并測定了最小抑菌濃度。陳孝娟等[8]發(fā)現(xiàn)石榴皮總多酚有一定的體外抑菌作用。黃素臻[9]發(fā)現(xiàn)牛蒡多酚對大腸桿菌等3個菌種有抑菌效果并測定了其最小抑菌濃度。申凱等[10]發(fā)現(xiàn)菱莖多酚對金黃色葡萄球菌等5個菌種有抑菌活性，對腐敗希瓦氏菌及釀酒酵母菌較為敏感。鞣花酸作為一種多酚二內(nèi)酯成分，其抑菌效果可以更進一步進行研究。故將鞣花酸作為復篩化合物，對其進行復篩試驗[11]。

3.2 抑菌活性復篩

根據(jù)初篩，鞣花酸有顯著抑菌效果，具有代表性。因此，分別以氨芐青霉素鈉、慶大霉素和兩性霉素B 作為陽性對照，進行復篩試驗。對照結(jié)果見表3。

表3 鞣花酸抑菌活性復篩結(jié)果

如表3 所示，以氨芐青霉素鈉為陽性對照，鞣花酸對甲型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌的抑菌率分別為45.63%、56.11%；以慶大霉素為陽性對照，鞣花酸對甲型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、痢疾志賀氏菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌的抑菌率分別為40.18%、52.09%、39.57%、43.57%、59.26%；以兩性霉素B為陽性對照，鞣花酸對釀酒酵母菌的抑菌率為63.03%。故鞣花酸對釀酒酵母菌、甲型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、痢疾志賀氏菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌都有較強的抑菌作用，對細菌大腸埃希菌和真菌釀酒酵母菌有較顯著的抑菌作用。根據(jù)上述復篩結(jié)果，測定鞣花酸對于上述6種供試菌的最小抑菌濃度，明確鞣花酸的抑菌效果。

3.3 最小抑菌濃度MIC的測定

根據(jù)復篩結(jié)果，為了進一步明確鞣花酸對上述6種供試菌株的抑菌效果，對其進行了最低抑菌濃度(MIC)測定，結(jié)果見圖1。

圖1 不同濃度鞣花酸對不同菌種抑菌活性結(jié)果

如圖1 所示，隨著鞣花酸濃度的降低，對于不同供試菌的抑菌活性逐漸下降，濃度高于1.00 g/L 時均具有顯著抑菌活性。對于金黃色葡萄球菌、痢疾志賀氏菌、銅綠假單胞菌，4 個濃度下抑菌活性均具有顯著性差異，濃度為0.25 g/L 時，無抑菌活性，可確定其最小抑菌濃度均為0.5 g/L；對于甲型副傷寒沙門菌，0.50 g/L 和0.25 g/L 濃度下的抑菌活性無顯著差異。然而0.50 g/L 濃度下具有抑菌活性，可確定其最小抑菌濃度為0.50 g/L。故鞣花酸對于以上4 種菌種敏感度較高，最小抑菌濃度均為0.50 g/L。對于大腸埃希菌和釀酒酵母菌，濃度為2.00、1.00、0.50 g/L 時，抑菌活性均具有顯著差異，濃度為0.50 和0.25 g/L 時不具抑菌活性，故鞣花酸對以上2 種菌種敏感度較低，最小抑菌濃度為1.00 g/L，較低濃度時無抑菌活性，只有較高濃度的樣品才能發(fā)揮抑菌作用。

4 討論

從正丁醇相分離純化的齊墩果酸、槲皮素、鞣花酸、對羥基苯甲酸、丹皮酚、乙酸乙酯相分離的沒食子酸具有較強的抑菌活性。正丁醇相分離的熊果酸、蘆丁、木犀草素、乙酸乙酯相分離的β?谷甾醇對供試菌并無抑制作用。鞣花酸純品對釀酒酵母菌、甲型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、痢疾志賀氏菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌均有顯著的抑制作用。以鞣花酸作為復篩藥物，對其抑菌活性進行復篩，通過陽性藥品對照，計算對6種菌種的抑菌率，并確定對甲型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、痢疾志賀氏菌、銅綠假單胞菌的MIC為0.50 g/L，而對大腸埃希菌和釀酒酵母菌敏感度較低，MIC為1.00 g/L。

藍花荊芥作為一種傳統(tǒng)藏藥，具有低毒、無污染、高效等特點，藏醫(yī)常用于治療瘡瘍、濕疹、皮膚潰爛等癥。馬凱琪等[12]從藍花荊芥中篩選得到了7 種抗單純皰疹1型病毒的提取物，但其相關(guān)抑菌活性研究未見報道。本研究從藍花荊芥中分離得到的鞣花酸、齊墩果酸、槲皮素、丹皮酚、沒食子酸等均具有顯著的抑菌效果。張溪桐[13]發(fā)現(xiàn)丹皮酚對幽門螺旋桿菌有較好的抑菌活性且高劑量時抑菌率達82.90%。謝三都等[14]發(fā)現(xiàn)蓮蓬醇提物對沙門氏菌等3個菌種具有抑菌活性，且與槲皮素濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。吳悠等[15]發(fā)現(xiàn)低濃度齊墩果酸和二甲亞砜聯(lián)合可有效抑制單一生物膜中糞腸球菌生長。張錫嬌等[16]研究了沒食子酸對水稻細菌性條斑病菌的抑菌作用及其作用機制。上述現(xiàn)代藥理學研究結(jié)果和藏醫(yī)應用證明藍花荊芥是一種優(yōu)良的抗菌抗病毒藏藥。眾所周知，銅綠假單胞菌在自然界分布廣泛，水體、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道等都有該菌存在，是多種疾病感染的主要病原菌，而現(xiàn)用抗生素都對其有耐藥性，本研究發(fā)現(xiàn)藍花荊芥富含的鞣花酸對于銅綠假單胞菌具有較好的抑菌效果，而且較為敏感，最小抑菌濃度為0.50 g/L。因此，將鞣花酸開發(fā)成抗銅綠假單胞菌藥物是一種新的科研思路，也為從天然藥物中尋找新型抗菌先導化合物提供實驗依據(jù)。