杜嘉偉，杜鑫澤，楊昕冉，宋貴兵，趙慧，昝林森,2，王洪寶,2

干擾抑制牛成肌細胞分化

杜嘉偉1，杜鑫澤1，楊昕冉1，宋貴兵1，趙慧1，昝林森1,2，王洪寶1,2

1西北農(nóng)林科技大學動物科技學院，陜西楊凌 712100；2國家肉牛改良中心，陜西楊凌 712100

肌肉可以維持哺乳動物運動功能并調(diào)節(jié)機體代謝，它的數(shù)量和分布對肉質(zhì)有重要影響，骨骼肌的生長發(fā)育及其遺傳特性在很大程度上影響甚至決定家畜的產(chǎn)肉量和肉品質(zhì)，研究骨骼肌的生長發(fā)育具有重要意義。對自噬的調(diào)控作用以及對前體脂肪細胞分化的調(diào)控機制已有研究，而對于牛成肌細胞分化的影響尚未報道?！尽刻骄縏P53INP2對秦川牛成肌細胞分化的影響，為肉牛肉用性狀分子育種工作提供理論依據(jù)。利用實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR）技術(shù)檢測了在24月齡秦川牛不同組織中的表達特性，同時分析了其在體外培養(yǎng)的牛骨骼肌成肌細胞不同分化時期的表達規(guī)律；合成基因siRNA并轉(zhuǎn)染秦川牛成肌細胞，轉(zhuǎn)染后12h進行誘導分化，觀察成肌細胞表型變化，并利用RT-qPCR技術(shù)和Western Blot技術(shù)分別檢測其在誘導分化第四天時分化標志基因和蛋白的表達情況。1.RT-qPCR結(jié)果顯示，在成年秦川牛背最長肌組織中表達量最高，在小腸組織中表達量最低。在成年牛心臟、肝臟、腎臟、網(wǎng)胃、瘤胃中表達量較高，在其余組織中表達量較低（與背最長肌相比）。2.隨著成肌細胞的分化，該基因在第0—4天表達量呈上升趨勢且在第4天達到峰值，隨后表達量呈下降趨勢。3.在成肌細胞中干擾后，試驗組肌管的數(shù)量和長度均顯著低于對照組。4.干擾并提取細胞總RNA，RT-qPCR結(jié)果顯示，成肌細胞分化標志基因肌細胞生成素（）和肌球重鏈蛋白3（）相對于對照組表達量顯著降低。5.干擾并提取細胞總蛋白，Western Blot結(jié)果顯示，試驗組MYOG、MYH3、MYOD的蛋白表達量均降低且與對照組相比差異極顯著。干擾對牛成肌細胞的分化具有抑制作用，提示該基因可能對秦川牛肌肉組織的生長發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，可對其進行深入的功能研究以期用于肉牛的分子育種實踐中。

；分化成肌細胞；秦川牛

0 引言

【研究意義】骨骼肌是人類最豐富的組織，約占總體重的50%，參與許多重要功能[1]。隨著人們生活質(zhì)量的提高，牛肉作為重要的肉食品，優(yōu)質(zhì)、高檔牛肉供不應求[2-3]。肌肉的數(shù)量和分布對肉質(zhì)有重要影響[4-5]，因此研究肌肉再生和分化的調(diào)控機制對畜牧業(yè)具有重要意義。另外，研究骨骼肌的生長發(fā)育對于提高家畜的產(chǎn)肉性能和改善肉質(zhì)品質(zhì)也具有重要意義。【前人研究進展】腫瘤蛋白p53誘導核蛋白（TP53INP）家族包括TP53INP1和TP53INP2兩個蛋白[6]。目前研究的較多且較為清楚，是在19世紀90年代末由3個不同的獨立實驗室發(fā)現(xiàn)的，作為p53靶基因在癌癥研究領(lǐng)域成為了研究熱點[7]。是的重要旁系同源物，又稱為DOR或PINH[8]。該基因編碼的蛋白質(zhì)可直接作用于一個重要的自噬相關(guān)蛋白LC3，該蛋白的主要功能為促進自噬體的形成，主要在細胞質(zhì)中起作用[9]，但XU等研究發(fā)現(xiàn)促進核仁的rRNA的合成，協(xié)助核仁的合成代謝并刺激核仁的分解代謝[10]。TP53INP2在細胞核內(nèi)可作為核受體，如哺乳動物的糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）、維生素D受體（vitaminDreceptor，VDR）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator- activatedreceptorγ，PPARγ）等的轉(zhuǎn)錄輔激活因子，表明TP53INP2在細胞核內(nèi)主要發(fā)揮轉(zhuǎn)錄輔激活因子的作用[11-12]。用饑餓培養(yǎng)基或雷帕霉素（ rapamycin）誘導細胞自噬，TP53INP2會迅速從細胞核移位至細胞質(zhì)中，與自噬標志蛋白相互作用[11,13-15]。許多研究證實，自噬參與脂肪細胞的分化，并在分化早期起著至關(guān)重要的作用[16-17]。ROMERO等通過在3T3-L1前體脂肪細胞上的研究表明對于前體脂肪細胞分化是負向調(diào)控的[16]。最近的一些研究表明TP53INP2在細胞凋亡信號通路上發(fā)揮作用，它可以正向調(diào)控細胞凋亡[15,18-19]?！颈狙芯壳腥朦c】對自噬的調(diào)控作用以及對前體脂肪細胞分化的調(diào)控機制已有研究，而對于牛成肌細胞分化的影響尚未報道。同時本研究通過對24月齡秦川牛不同組織進行qRT-PCR，發(fā)現(xiàn)基因在背最長肌組織中的表達量最高，因此決定研究干擾對秦川牛成肌細胞分化的作用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過siRNA轉(zhuǎn)染秦川牛成肌細胞，確定干擾對秦川牛成肌細胞分化的作用，為秦川牛的肉質(zhì)性狀改良及良種選育提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

本試驗于2020年上半年在陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學國家肉牛改良中心完成。

1.1 試驗動物采樣

樣本均來自西北農(nóng)林科技大學國家肉牛改良中心的肉牛良種繁育場，將3頭成年秦川牛（24月齡）作為研究對象，屠宰后取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腸、小腸、瘤胃、網(wǎng)胃、皺胃、腎周脂肪、皮下脂肪、背最長肌等組織，液氮冷凍后轉(zhuǎn)存-80℃冰箱長期保存。新生牛背最長肌組織用于后續(xù)成肌細胞的分離培養(yǎng)。

1.2 主要試驗耗材與儀器設(shè)備

TB GreenTMPremix EX TaqTMⅡ（TaKaRa），DEPC水，電泳液（Solarbio），電解液（Solarbio），10X TBST Buffer（Sangon Biotech），PBS緩沖液（HyClone），QuickBlock Western一抗稀釋液（Beyotime），QuickBlock Western二抗稀釋液（Beyotime），QuickBlock Western封閉液（Beyotime），無水乙醇（西隴化工），三氯甲烷（西隴化工），異丙醇（范德生物），RIPA（Solarbio），PMSF（Solarbio），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa），Trizol（TaKaRa），胎牛血清（PAN），F(xiàn)-12/DMEM（Hyclone），馬血清(Hyclone)，Lipofectamine 3000（ThermoFisher），opti(Hyclone)，蛋白上樣緩沖液（Solarbio）。

轉(zhuǎn)膜儀（BIO-RAD），電泳槽（BIO-RAD），4℃離心機（Eppendorf），實時熒光定量儀（BIO-RAD），QL-901漩渦震蕩儀，37℃恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Fisher），熒光倒置顯微鏡（Olympics），酶標儀（Tecan Austria GmbH 5082）。

1.3 試驗方法

1.3.1 秦川牛各組織總RNA的提取和cDNA的合成 采用傳統(tǒng)的Trizol法提取各組織的總RNA。提取過程為：取少量組織樣于研缽中，加入液氮反復研磨；加入500 μL Trizol，繼續(xù)研磨混勻后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，室溫放置15 min后4℃、12 000 r/min離心15 min；取上清，按Tizol總體積1/5的量加入氯仿，劇烈振蕩15 s后室溫靜置5 min；4℃、12 000 r/min離心15 min；取上清加入等體積的異丙醇充分混勻后室溫靜置10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min；棄上清，加入1 mL 4℃預冷的體積分數(shù)75%乙醇，4℃、8 000 r/min離心5 min；室溫干燥2—5 min；用適量RNase-free水溶解RNA，測定濃度后于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂妹笜藘x檢測所提取總RNA的純度及濃度，并使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。以提取的RNA為模板，按照PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒操作步驟進行cDNA的合成。

1.3.2 秦川牛成肌細胞培養(yǎng)，siRNA的合成及轉(zhuǎn)染 秦川牛成肌細胞的分離培養(yǎng)參見文獻[20]。將秦川牛成肌細胞復蘇后采用生長培養(yǎng)基（含體積分數(shù)20%胎牛血清和體積分數(shù)1%雙抗的F-12/DMEM）培養(yǎng)。針對TP53INP2 mRNA序列，由廣州銳博生物有限公司合設(shè)計成siRNA及陰性對照。待細胞生長密度達到80%時進行轉(zhuǎn)染，具體操作步驟參照Lipofectamine 3000試劑盒說明書，復合物1：125 μl opti+5 μl（si- TP53INP2/si-NC）孵育5 min，復合物2：125 μl opti+ 3.75 μl lip3000孵育5 min，之后將復合物2加入復合物1中充分混勻后室溫孵育5 min。用PBS清洗細胞兩遍后，加入含有復合物1、2混合物的生長培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后，更換為分化培養(yǎng)基（含體積分數(shù)2%馬血清和體積分數(shù)1%雙抗的F-12/DMEM）培養(yǎng)，每2 d更換一次培養(yǎng)基，于分化第0、2、4、6、8、10天取細胞樣品，采用Trizol法提取RNA[21]。

1.3.3 cDNA樣品準備和RT-qPCR 已提取的RNA根據(jù)試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GenBank已公布的牛序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異實時熒光定量引物，送交西安擎科有限公司合成。以作為內(nèi)參，利用TB GreenTMPremix EX TaqTMⅡ進行實時熒光定量PCR反應。PCR反應體系15 μL：TB Rreen Ⅱ 7.5 μL，cDNA 1.2 μL，上下游引物各0.3 μL，加RNase free H2O補足體系，技術(shù)重復3次。于Bio-Rad熒光定量PCR儀上進行反應，反應條件：95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s，72℃30 s，40個循環(huán)；采集熔解曲線熒光信號和達到峰值循環(huán)數(shù)Ct值。采用2-△△Ct法對數(shù)據(jù)進行分析，具體公式為△Ct1=待測組目標基因Ctmean-待測組Ctmean；△Ct2=基測組目標基因Ctmean-基準組Ctmean；RQ= 2-(△Ct1-△Ct2)=2-△△Ct[22]。另外，本研究中所有實時熒光定量PCR結(jié)果均以作為內(nèi)參基因，所有實時熒光定量PCR引物序列見表1。

1.3.4 提取細胞總蛋白 吸出細胞培養(yǎng)板中所有培養(yǎng)基，并用PBS輕柔的清洗細胞2—3次；6孔板每孔按RIPA（蛋白裂解液）﹕PMSF（蛋白酶抑制劑）=100﹕1的比例加入150 μL混合液；冰上裂解30 min，于冰上用細胞刮刮細胞培養(yǎng)板底部，使細胞充分裂解；將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，4℃，12 000×離心10 min，離心后將上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中，按照上清液﹕上樣緩沖液（5X）=4﹕1的比例加入蛋白上樣緩沖液；煮沸10 min，保存于-80℃。

1.3.5 Western Blot 配制 12% 的分離膠，用乙醇壓平液面，室溫靜置至少 30 min；待分離膠凝固后，棄去上層的乙醇，配制濃度為 5% 的濃縮膠，混合后加入兩玻璃板中間，迅速插入梳子；將膠板裝入垂直板電泳槽，拔掉梳子灌入1×Tris-Gly電泳緩沖液，淹沒中間室，并漫過點樣孔；上樣（通常上樣蛋白量為 10—20 μg），80 V 電壓電泳，待樣品進入分離膠后，調(diào)電壓至 120 V，待樣品中溴酚藍遷移至凝膠最下端時，電泳完畢；將膠板從電泳槽中拆下，小心取出凝膠，裝配轉(zhuǎn)移裝置，提前用甲醛浸泡1—2 min 激活PVDF膜并浸泡厚濾紙；使用Bio-Rad公司的轉(zhuǎn)膜裝置進行轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，放入TBST溶液洗10 min；將膜置于封閉液中，搖床上室溫封閉2 h，封閉結(jié)束后TBST 溶液漂洗膜 3 次，10 min/次；將一抗用一抗稀釋劑稀釋至相應比例：GAPDH（1﹕5000），MYOD（1﹕1000），MYOG（1﹕200），MYH3（1﹕500）之后在 4℃條件下用一抗過夜孵育PVDF 膜；回收抗體，TBST 溶液漂洗膜 3 次，10 min/次；將二抗用二抗稀釋劑稀釋至相應比例，室溫下?lián)u床上避光孵育膜2 h；TBST 溶液漂洗膜 3 次，10 min/次；化學發(fā)光顯影。

1.3.6 統(tǒng)計分析在不同組織中以及肌細胞不同分化時期的表達差異采用單因素方差分析進行計算，多重比較以表達量最低組織或誘導分化第0天為對照，使用LSD方法進行。在成年牛特定組織中的表達差異分析用t檢驗進行計算，以＜0.05表示差異顯著性判斷標準。本研究數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism6軟件進行統(tǒng)計分析并作圖。

2 結(jié)果

2.1 成年牛不同組織TP53INP2相對表達量的檢測

由圖1可知，在各組織中廣泛表達，但表達量不盡相同。其中在小腸中表達最低，在小腸、脾臟、腎周脂肪、大腸、肺臟、皺胃、皮下脂肪等組織中的整體表達水平較低（與背最長肌相比）；在網(wǎng)胃、腎臟、瘤胃、肝臟、心臟等組織中整體表達水平較高；另外，該基因在背最長肌中表達量最高且極顯著地高于其他組織。

2.2 TP53INP2在成肌細胞不同分化天數(shù)的表達規(guī)律的測定

在成肌細胞誘導分化不同天數(shù)的相對表達量是以第0天作為標準計算得出的結(jié)果。由圖2可知，從整體趨勢來看，的表達量先上升后下降，其表達量在第4天達到最高。

2.3 TP53INP2 siRNA干擾效率的檢測

如圖3所示，在siRNA轉(zhuǎn)染牛成肌細胞后的第4天，通過qRT-PCR檢測其干擾效率，測得干擾效率約為84%，可用于后續(xù)試驗研究。

2.4 干擾TP53INP2基因后對成肌細胞分化的影響

如圖4所示，在干擾后處理組和對照組的分化表型差異極顯著，處理組肌管明顯少于且短于對照組；圖5顯示當干擾后，處理組和的相對表達量極顯著低于對照組，而處理組的相對表達量低于對照組，但差異不顯著；圖6、圖7所示處理組中的蛋白表達量均極顯著低于對照組。

3 討論

3.1 TP53INP2在成年牛不同組織的相對表達量

肌肉的發(fā)育離不開肌細胞的增殖分化，而增殖分化的過程是極其復雜的[23]。成肌細胞具有增殖和分化的能力，但融合成肌管之后便失去增殖能力，轉(zhuǎn)而進行分化[24]。近些年來，已有的研究報道表明，TP53INP2可以作為骨骼肌基底自噬的激活因子，它被認為是骨骼肌質(zhì)量的負調(diào)控因子，其蛋白可以通過自噬調(diào)節(jié)肌肉質(zhì)量其負調(diào)控肌肉質(zhì)量的這一功能主要是由于能激活成肌細胞中自噬這一過程[1,12]。本試驗采用qRT-PCR技術(shù)檢測并獲得了在成年秦川牛不同組織中的表達模式及該基因在成肌細胞誘導分化不同天數(shù)的表達規(guī)律，研究結(jié)果初步揭示了的表達特性及規(guī)律。在成年秦川牛各組織中，在背最長肌中的表達量極顯著高于其他組織，這說明其對牛肌肉組織的生長發(fā)育可能會具有重要的調(diào)控作用。

標不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05），標不同大寫字母表示差異極顯著（P＜0.01），標相同字母表示差異不顯著

D0：成肌細胞誘導分化第0天；D2：成肌細胞誘導分化第2天；D4：成肌細胞誘導分化第4天；D6：成肌細胞誘導分化第6天；D8：成肌細胞誘導分化第8天；D10：成肌細胞誘導分化第10天

**代表差異極顯著。下同

紅色箭頭表示肌細胞融合所形成的肌管

3.2 TP53INP2對肌肉分化的影響

目前已有的在不同組織的表達模式分析也僅限于小鼠和人上，研究報道證明在人和小鼠的骨骼肌、心臟及腦等組織的表達量非常高[25]，這與本研究的結(jié)果是一致的。根據(jù)在成肌細胞不同分化天數(shù)的表達規(guī)律可以知道其整體表達趨勢是先上升后下降且在誘導分化的第4天表達量達到最高，提示該基因可能對肌細胞的分化有一定的調(diào)控作用，因此研究者在成肌細胞中利用siRNA干擾該基因進行后續(xù)功能試驗。結(jié)果顯示，在誘導分化的第4天，處理組中成肌細胞分化較慢，肌管較少、較短，而對照組中肌細胞融合得更好，肌管更多更長，處理組與對照組差異極顯著，因此初步判定干擾后抑制成肌細胞的分化。qRT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示，處理組肌細胞分化標志基因、和的表達水平均被下調(diào)，同樣提示干擾后抑制了成肌細胞的分化。肌細胞生成素（MYOG）是骨骼肌細胞中特異性表達的轉(zhuǎn)錄因子，其可促進一些肌肉相關(guān)基因的表達并對于成肌細胞的終末分化有至關(guān)重要的調(diào)控作用，在本研究中當干擾的表達后，MYOG的RNA及蛋白水平都極顯著下調(diào)，這更加肯定了TP53INP2對于成肌細胞分化的功能[26]。肌球重鏈蛋白3（MYH3）屬于MYH家族，其編碼的蛋白含有IQ結(jié)構(gòu)域及肌球蛋白頭樣結(jié)構(gòu)域，有研究報道證明該基因?qū)τ谔杭∪獍l(fā)育有至關(guān)重要的作用，若引起該基因突變將引發(fā)疾病，在本研究中干擾后，的表達被抑制，因此證實能影響骨骼肌肌肉的發(fā)育[27]。肌源性分化蛋白1（MYOD），其可通過誘導細胞增殖周期停滯以促進成肌細胞分化，另外其與及一同占據(jù)一些成肌過程中肌肉形成特異性基因的啟動子核心區(qū)域，以促進成肌[28-29]。本研究中，抑制的表達后，的表達也被抑制，再次證實了牛成肌細胞的分化受到了抑制。目前，尚未見到調(diào)控肌細胞分化的文獻報道，不過已有研究證實夠激活肌細胞自噬，而肌細胞自噬激活則會促進肌細胞的分化[30]，據(jù)此推測干擾可能通過抑制牛肌細胞自噬以起到抑制成肌細胞分化的作用，但其具體作用機制還有待深入研究。

圖5 成肌細胞分化標志基因mRNA水平檢測

圖6 Western Blot檢測成肌細胞分化標志基因

圖7 不同標志蛋白相對表達量

4 結(jié)論

在成年秦川牛背最長肌中表達量最高且極顯著高于其他組織；在秦川牛成肌細胞不同分化天數(shù)，的mRNA表達量總體趨勢為先上升后下降，且在第4天表達量最高；干擾的表達后，抑制了秦川牛成肌細胞的分化。

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Interference inGene Inhibits the Differentiation of Bovine Myoblasts

DU JiaWei1, DU XinZe1, YANG XinRan1, SONG GuiBing1, ZHAO Hui1, ZAN LinSen1,2, WANG HongBao1,2

1College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi;2National Beef Cattle Improvement Center, Yangling 712100, Shaanxi

【】Muscle can maintain the motor function of mammals and regulate body metabolism. Its quantity and distribution have an important influence on meat quality. The growth and development of skeletal muscle and its genetic characteristics influence and even determine the meat production and meat quality to a large extent. It is of great significance to study the growth and development of skeletal muscle. The regulatory effect ofon autophagy and the regulation mechanism on the differentiation of preadipocytes have been studied, but whether it affects the differentiation of bovine myoblasts has not been reported. 【】This study aims to explore the effect ofon the differentiation of Qinchuan bovine myoblasts in order to provide a theoretical basis for the molecular breeding of beef cattle meat traits. 【】The real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) technology was used to detect the expression characteristics ofat different stages of differentiation were analyzed.gene siRNA was synthesized and transfected to Qinchuan bovine myoblasts, cells were induced to differentiation 12 hours after transfection, phenotypic changes of myoblasts were observed at different time pionts, and RT-qPCR and Western Blot technologies were performed respectively to detect the expression of differentiation marker genes and proteins on the fourth day of induced differentiation. 【】1. RT-qPCR results showed that the expression level ofwas the highest in adult Qinchuan cattle Longissimus dorsi muscle tissue and the lowest in the small intestine tissue. It is higher in adult bovine heart, liver, kidney, reticulum and rumen, and lower in other tissues (compared with longissimus dorsi). 2. With the differentiation of myoblasts, the expression of this gene increased from 0 to 4 days and reached a peak on the 4th day, and then decreased. 3. After interfering withsiRNA in myoblasts, the number and length of myotubes in the test group were significantly lower than those in the control group. 4. RT-qPCR results showed that the expression of myoblast differentiation marker genes myogenin () and myosin heavy chain protein 3 () was significantly lower than that of the control group. Western Blot results showed that the protein expressions of MYOG, MYH3 and MYOD in the test group were reduced and the differences were extremely significant compared with the control group.【】Interfering ofhas an inhibitory effect on the differentiation of bovine myoblasts, suggesting that this gene may have an important regulatory effect on the growth and development of Qinchuan cattle muscle tissue, and it can be used for in-depth functional research for molecular breeding of beef cattle practice.

; differentiation; myoblasts; Qinchuan cattle

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.21.017

2020-09-25；

2021-03-12

國家自然科學基金（31572363）、陜西省人才推進計劃青年科技新星項目（2017KJXX-76）、國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFD0502002）

杜嘉偉，E-mail：614502306@qq.com。通信作者王洪寶，E-mail：wanghongbao@nwsuaf.edu.cn

（責任編輯 林鑒非）