趙衛(wèi)松，郭慶港，董麗紅，王培培，蘇振賀，張曉云，鹿秀云，李社增，馬平

枯草芽孢桿菌NCD-2對棉花根系分泌物L-脯氨酸響應的轉錄-蛋白質組學聯(lián)合分析

趙衛(wèi)松，郭慶港，董麗紅，王培培，蘇振賀，張曉云，鹿秀云，李社增，馬平

河北省農(nóng)林科學院植物保護研究所/河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室，河北保定 071000

【】棉花根系分泌物L-脯氨酸是影響生防菌株定殖的關鍵因素之一，前期研究發(fā)現(xiàn)L-脯氨酸能夠提高枯草芽孢桿菌（）NCD-2生物膜形成能力。通過高通量測序技術分析L-脯氨酸調控枯草芽孢桿菌NCD-2生物膜形成和生防潛力相關的基因，為深入認識棉花根系分泌物與生防菌株的分子互作關系打下基礎。以枯草芽孢桿菌NCD-2菌株為供試材料，外源添加濃度為10 mg·mL-1的L-脯氨酸共培養(yǎng)24 h后，分別進行轉錄組（RNA-seq）和同位素標記相對定量蛋白質組技術（iTRAQ）分析，對所獲得的轉錄組和蛋白質組數(shù)據(jù)進行生物信息學分析，利用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）驗證不同代謝通路中部分差異基因的表達情況。轉錄組分析發(fā)現(xiàn)，L-脯氨酸和NCD-2菌株共培養(yǎng)后，獲得1 071個差異表達基因（DEG），其中602個基因上調，469個基因下調。GO分析發(fā)現(xiàn)在生物過程、細胞組分和分子功能方面分別有49、14和30個功能條目顯著富集。KEGG代謝通路主要富集在化合物代謝、鞭毛組裝、細菌運動和趨化作用。蛋白質組學分析發(fā)現(xiàn)，篩選到211個差異表達蛋白（DEP），其中118個蛋白上調，93個蛋白下調。GO分析發(fā)現(xiàn)在生物過程和分子功能方面分別有13和8個功能條目顯著富集。KEGG代謝通路主要富集在氨基酸代謝、碳水化合物類代謝、鞭毛組裝和ABC轉運蛋白。進一步轉錄-蛋白質組學聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，在L-脯氨酸作用下，檢測到共有的顯著差異表達基因（或蛋白）112個，其中38個基因（或蛋白）下調，74個基因（或蛋白）上調。GO功能顯著富集主要集中在營養(yǎng)庫活性、催化活性、細胞膜、定位、細胞脂質代謝過程、氧化還原過程、sigma因子活性、轉運活性、芽孢形成9個方面。KEGG代謝通路主要富集在能量代謝、ABC轉運蛋白、抗生素生物合成、鞭毛組裝、運動或趨化作用和雙組分系統(tǒng)方面。RT-qPCR驗證了26個差異表達顯著基因，結果發(fā)現(xiàn)在表達量上存在一定的差異，但表達趨勢與RNA-seq和iTRAQ組學分析結果基本一致。棉花根系分泌物L-脯氨酸與枯草芽孢桿菌NCD-2之間的互作存在一個復雜的生物過程，依賴于不同代謝通路網(wǎng)絡中的多個基因。雙組分系統(tǒng)、抗生素生物合成、能量代謝、運動或趨化作用、鞭毛組裝和ABC轉運蛋白通路中的差異基因（或蛋白）可能在棉花根系分泌物與枯草芽孢桿菌互作過程方面發(fā)揮著重要作用。

L-脯氨酸；枯草芽孢桿菌；轉錄組；蛋白質組；互作關系

0 引言

【研究意義】芽孢桿菌（spp.）是開發(fā)微生物源農(nóng)藥的重要資源之一，已經(jīng)在生物防治中得到廣泛研究和應用[1-4]。對于作物土傳病害的防治而言，生防芽孢桿菌在作物根際的有效定殖并保持較高的群體數(shù)量是其發(fā)揮抑菌、競爭等防病作用的重要前提，且生物膜狀態(tài)下的細菌更有利于其生防能力的發(fā)揮[5-7]。Yaryura等[8]研究表明，解淀粉芽孢桿菌（）BNM339在大豆品種間的根際定殖能力存在差異，且定殖能力與不同品種根系分泌物的組成相關。筆者實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，棉花根系分泌物L-脯氨酸是影響生防菌株定殖的關鍵因素之一，枯草芽孢桿菌（）NCD-2菌株在不同抗、感黃萎病棉花品種間定殖能力存在差異，在感病品種冀棉11上的定殖能力最強[9]。通過研究枯草芽孢桿菌NCD-2對根系分泌物L-脯氨酸響應的分子特征，有助于揭示兩者之間的互作關系，對如何提高該菌株定殖能力及其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應用具有重要的實踐意義?！厩叭搜芯窟M展】芽孢桿菌防治作物土傳病害的機制主要體現(xiàn)在誘導抗性、競爭作用、抑菌作用方面[10]。芽孢桿菌在植物根際或根表定殖能力強弱是發(fā)揮生防效果的先決條件[6,11-12]。然而生防細菌的根際定殖能力與生物膜形成能力、趨化作用和外界環(huán)境因素有關[9,13-14]。根系分泌物可以直接或間接影響生防細菌在植物根部的定殖能力，其主要通過促進生防微生物生物膜的形成和趨化作用來實現(xiàn)[13]。因此，研究生防微生物與根系分泌物之間的相互關系，對于提高生防微生物對植物病害的防治效果和調控植物根系的微生物群落結構和功能具有重要意義。近年來，轉錄組和蛋白質組學的發(fā)展使生防微生物對外界環(huán)境的響應特征獲得了更加豐富與完整的基因表達信息?！颈狙芯壳腥朦c】有益微生物的生防機理是一個非常復雜的過程，僅通過對部分生防相關基因的克隆與功能開展研究不能夠全面詮釋生防機理。枯草芽孢桿菌NCD-2是筆者實驗室篩選出的一株可有效防治作物土傳病害的生防細菌，以該菌株為有效成分研制的微生物殺菌劑對棉花黃萎病具有很好的防治效果[15]。同時研究表明，NCD-2菌株在棉花根際的定殖能力與其根系分泌物組成中的L-脯氨酸相關，L-脯氨酸能夠促進NCD-2菌株生物膜形成[9]。然而L-脯氨酸如何影響枯草芽孢桿菌的生物膜形成和生防潛力尚不明確?！緮M解決的關鍵問題】采用轉錄組（RNA-seq）和蛋白質組（iTRAQ）技術，對生防枯草芽孢桿菌NCD-2在根系分泌物L-脯氨酸作用下的差異表達基因（differentially expressed gene，DEG）或蛋白（differentially expressed protein，DEP）進行分析，篩選與生防潛力和生物膜形成相關的功能基因，為探討根系分泌物和有益枯草芽孢桿菌的互作關系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2019年在河北省農(nóng)林科學院植物保護研究所植物病害生物防治實驗室完成。

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌NCD-2菌株保藏于中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CGMCC No.1019），由河北省農(nóng)林科學院植物保護研究所植物病害生物防治實驗室提供。生物膜誘導培養(yǎng)基（MSgg培養(yǎng)基）[16]：100 mmol·L-1MOPS，0.5%甘油，0.5%谷氨酸，5 mmol·L-1磷酸鉀緩沖液（pH 7.0），50 μg·mL-1色氨酸，50 μg·mL-1苯丙氨酸，2 μmol·L-1VB1，2 mmol·L-1MgCl2，700 μmol·L-1CaCl2，50 μmol·L-1FeCl3，50 μmol·L-1MnCl2，1 μmol·L-1ZnCl2。蛋白裂解緩沖液：100 mmol·L-1碳酸氫銨，6 mol·L-1尿素，0.2% SDS，pH 8.0。上述培養(yǎng)基和緩沖液各組分121℃，20 min單獨滅菌。

1.2 生物膜的制備

參考文獻[16]的方法制備枯草芽孢桿菌生物膜，具體步驟如下：將在LB平板上活化的NCD-2菌株接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃、180 r/min過夜培養(yǎng)至OD600=0.5—0.6。在24孔培養(yǎng)板的每個孔中加入2 mL含有L-脯氨酸濃度為10 mg·mL-1的MSgg培養(yǎng)液，種子液接種濃度為1.0%（v/v），以不加入L-脯氨酸只接種菌株的處理作為空白對照，在37℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)48 h后，吸取并棄掉培養(yǎng)孔下的MSgg培養(yǎng)液，保留培養(yǎng)孔中的生物膜，無菌水清洗兩次后，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 L-脯氨酸誘導下NCD-2菌株生物膜形成的轉錄差異基因分析

cDNA文庫的構建及測序：按照1.2將收集的不同樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司，進行不同樣本總RNA提取及質量檢測，利用NEBNext? UltraTMDirectional RNA Library Prep Kit（NEB，USA）試劑盒進行cDNA文庫構建，利用Agilent 2100 bioanalyzer對文庫插入的片段長度進行檢測，并用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）對文庫有效濃度進行定量，每組樣品3個重復。構建成功的cDNA文庫使用Illumina Hiseq 2500高通量測序平臺進行測序，測序得到的原始數(shù)據(jù)提交至中國國家生物信息中心（CNCB），獲得接收編號為CRA004208。

基因注釋和表達定量分析：通過上述測序平臺得到不同樣品cDNA文庫的原始數(shù)據(jù)，分布去除數(shù)據(jù)中帶有接頭、N的比例大于10%和低質量的reads，得到的clean reads用于后續(xù)基因組比對分析。根據(jù)比對結果，采用HTSeq軟件對各樣品進行基因表達水平分析。利用FPKM值表示對應unigene的表達豐度。同時，計算Q20、Q30和GC含量對測序數(shù)據(jù)進行質量評估。

差異表達基因的篩選：通過比較分析不同樣本之間的數(shù)據(jù)比值篩選出差異表達基因。將＜0.05且差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C，兩樣品間表達量的比值）≥2作為篩選標準。通過GOseq軟件實現(xiàn)差異表達基因的GO富集分析，使用KOBAS軟件進行KEGG Pathway的富集分析。

1.4 L-脯氨酸誘導下NCD-2菌株生物膜形成的差異蛋白分析

樣品制備：將1.2制備的樣品轉移至液氮預冷的研缽中研磨成粉，迅速轉移至離心管，加入適量蛋白裂解緩沖液，渦旋儀上振蕩混勻，冰水浴超聲5 min使其充分裂解，4℃、12 000×離心15 min，取上清加入終濃度10 mmol·L-1DTTred于56℃金屬浴反應1 h，之后加入足量IAM，25℃黑暗條件反應1 h，之后加入4倍體積的預冷丙酮在-20℃沉淀至少2 h，4℃、12 000×離心15 min，收集沉淀。之后加入1 mL -20℃預冷丙酮重懸并清洗沉淀，在相同條件下收集沉淀，風干后送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行后續(xù)處理，包括蛋白質量檢測、酶切與除鹽、iTRAQ標記、色譜分離和質譜檢測。每組樣品3次重復。測序得到的原始數(shù)據(jù)提交至蛋白數(shù)據(jù)庫（ProteomeXchange），獲得接收編號為PXD026233。

數(shù)據(jù)處理：利用NCBIcustomer. fasta蛋白質數(shù)據(jù)庫對質譜數(shù)據(jù)進行匹配，利用Proteome Discoverer2.2軟件對檢索結果進行過濾，選擇可信度在99%以上的譜肽，去除FDR＞0.01的肽段和蛋白。

差異表達蛋白的篩選：當FC≥1.2且＜0.05，蛋白表達量上調；當FC≤0.83且＜0.05，蛋白表達量下調，作為差異表達蛋白篩選標準。

1.5 RT-qPCR驗證

為進一步檢測轉錄組和蛋白質組數(shù)據(jù)的準確性，從L-脯氨酸誘導下選擇不同代謝途徑中的26個差異基因通過RT-qPCR進行定量分析，用軟件設計qPCR引物（表1），以為內參基因。利用細菌總RNA提取試劑盒（TIANGEN）提取RNA，利用NanoDrop 2000C分光光度計測定RNA濃度及純度，以cDNA為模板，用熒光定量試劑盒（TB GreenTMPremix EX TaqTM）、QuantStudioTMreal-time PCR軟件（Applied Biosystems公司）進行熒光定量檢測。選取擴增反應體系為20 μL，其中2×TransStartTMGreen qPCR SuperMix 10 μL、上下游引物各（10 μmol·L-1）0.4 μL、cDNA 模板2 μL、Passive Reference Dye I 0.4 μL、ddH2O補足至20 μL。反應程序條件95℃ 10 min；95℃ 5 s、60℃ 15 s、72℃ 15 s、40個循環(huán)，相對變化倍數(shù)利用公式2-ΔΔCT進行計算。

表1 引物及其堿基序列

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Origin 8.6軟件進行數(shù)據(jù)分析，利用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析、獨立樣本T檢驗統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 轉錄組測序數(shù)據(jù)質量分析

兩個處理（T：添加L-脯氨酸；CK：未添加L-脯氨酸的作為空白對照）經(jīng)高通量測序，CK和T處理原始測序序列數(shù)目分別為1 110萬條和897萬條左右，經(jīng)過濾得到的數(shù)據(jù)分別為1 087萬條和878萬條左右，總信息量分別為1.63 G和1.32 G。將獲得的不同處理的過濾序列與NCD-2菌株全基因組序列比對，得到的有效序列分別為963萬條和804萬條，分別約占總序列的88.59%和91.57%。測得數(shù)據(jù)經(jīng)過濾后GC含量介于41.81%—43.30%，CycleQ20 值均在97%以上，Cycle Q30值大于90%（表2）。綜合分析表明，測得的數(shù)據(jù)準確度高，數(shù)據(jù)質量好，能夠滿足后期數(shù)據(jù)的分析。

2.2 基因表達數(shù)量及比例分析

分別統(tǒng)計了NCD-2菌株在添加和未添加L-脯氨酸條件下不同F(xiàn)PKM值基因的數(shù)量以及基因的表達比例（表3）。在單個基因的表達方面，F(xiàn)PKM 值大于1基因表達比例為85.58%，表達水平較高。轉錄組測序結果與參考基因組（subsp168）進行比對，共得到4 530個轉錄本，有功能注釋的轉錄本有4 017個，處理組與對照組之間的差異表達的基因有1 071個，其中602個基因上調，469個基因下調（圖1）。

圖1 差異表達基因的整體分布

表2 測序數(shù)據(jù)質量統(tǒng)計

表3 不同表達水平區(qū)間的基因數(shù)量及比例統(tǒng)計

2.3 差異表達基因的GO功能注釋

GO富集分析主要分為生物過程、細胞組分和分子功能3個基本分類，它們又分別包含1 183、224和649個亞分類。將轉錄組測序的結果在GO數(shù)據(jù)庫進行基因功能注釋，以＜0.05為篩選闕值，評價不同功能條目的富集情況（圖2）。

在生物過程方面，共有49個功能條目顯著富集，對不同功能條目差異表達基因分析發(fā)現(xiàn)，可分為3類，上調基因數(shù)均顯著高于下調基因數(shù)（12個功能條目），分別為發(fā)育過程（GO:0032502）、脂質代謝過程（GO:0006629）、二羧酸代謝過程（GO:0043648）、分泌過程（GO:0046903）、有機氮化合物代謝過程（GO:1901564）、類固醇生物合成過程（GO:0006694）、膜脂代謝過程（GO:0006643）、脂質生物合成過程（GO:0008610）、糖脂代謝過程（GO:0006664）、碳水化合物生物合成過程（GO:0016051）、磷脂代謝過程（GO:0006644）和磷脂酰肌醇代謝過程（GO:0046488）；下調基因數(shù)顯著高于上調基因數(shù)（34個功能條目），位于前10位的功能條目分別為運動（GO:0040011）、纖毛或鞭毛依賴的細胞運動（GO:0001539）、細菌型鞭毛依賴的細胞運動（GO:0071973）、古細菌或細菌型鞭毛依賴的細胞運動（GO:0097588）、細胞運動（GO:0048870）、細胞定位（GO:0051674）、細胞或亞細胞成分的運動（GO:0006928）、外界刺激響應（GO:0009605）、細胞激活（GO:0001775）和凝血（GO:0007596）；完全下調基因功能條目有3個，分別為趨化性（GO: 0006935）、趨性（GO:0042330）和RNA甲基化（GO:0001510）。

在細胞組分方面，共有14個功能條目顯著富集，分別是細菌型鞭毛基體（GO:0009425）、纖維蛋白復合體（GO:0005577）、細菌型鞭毛（GO:0009288）、無膜細胞器（GO:0043228）、細胞突起（GO:0042995）、胞外區(qū)域（GO:0044421）、微管細胞骨架（GO: 0015630）、細菌型鞭毛部分（GO:0044461）、細胞突起部分（GO:0044463）、細胞器（GO:0043226）、有絲分裂紡錘體（GO:0072686）、濃縮染色體外著絲粒（GO:0000940）、紡錘體（GO:0005819）和細胞外間隙（GO:0005615）。進一步對其差異表達基因分析發(fā)現(xiàn)，下調基因數(shù)均顯著高于上調基因數(shù)，說明枯草芽孢桿菌NCD-2在L-脯氨酸誘導后降低了其自身組成能力。

在分子功能方面，共有30個功能條目顯著富集，對不同功能條目差異表達基因分析分為3類，包括上調基因數(shù)均顯著高于下調基因數(shù)（有9個功能條目），分別為不同類型與分子氧結合作用于單個供體的氧化還原酶活性（GO:0016701和GO:0016702）、雙加氧酶活性（GO:0051213）、陰離子跨膜轉運蛋白活性（GO:0008509）、不同類型的類固醇脫氫酶活性（GO:0003854、GO:0016229和GO:0033764）、轉移酶活性（GO:0016782）、無機分子跨膜轉運蛋白活性（GO:0015318）；下調基因數(shù)顯著高于上調基因數(shù)（有 9個功能條目），分別為鈷胺素結合（GO:0031419）、蛋白結合（GO:0030674）、分子適配器活性（GO:0060090）、鈉協(xié)同載體（GO:0015370）、亞鐵離子介導的雙加氧酶活性（GO:0010309）、轉運體活性（GO:0015293）、陽離子轉運體活性（GO:0015294）、鈉轉運體活性（GO:0005343）和金屬離子跨膜轉運蛋白活性（GO:0046873）；完全上調基因功能條目為12個，分別為配體陽離子通道活性（GO:0099094）、鈣離子跨膜轉運蛋白活性（GO:0015085）、血紅素銅末端氧化酶活性（GO:0015002）、細胞色素c氧化酶活性（GO:0004129）、作用于供體血紅素基團及氧作為受體的氧化還原酶活性（GO:0016675和GO: 0016676）、鈷離子結合（GO:0050897）、細胞內配體離子通道活性（GO:0005217）、蘭尼堿敏感的鈣釋放通道活性（GO:0005219）、鈣通道活性（GO:0005262）、鈣釋放通道活性（GO:0015278）和配體主導的鈣通道活性（GO:0099604）。

2.4 差異表達基因的KEGG代謝途徑分析

將差異表達基因與KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對，確定差異表達基因中顯著性富集的代謝途徑（篩選閾值以＜0.05為顯著富集的條目），探討枯草芽孢桿菌NCD-2在L-脯氨酸作用下差異表達基因參與的代謝途徑差異。結果表明，L-脯氨酸處理NCD-2菌株后富集顯著的代謝途徑有10條（表4），分別為不同環(huán)境的微生物代謝、鏈霉素生物合成、碳代謝、硫代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、細菌趨化性、鞭毛組裝、核糖體、萜類化合物生物合成和錯配修復。

NCD-2菌株在L-脯氨酸作用下差異基因表達情況具體表現(xiàn)為不同環(huán)境的微生物代謝（KEGG ID: bsu01120）相關的2-脫氫-3-脫氧葡萄糖激酶基因（）、2-磷酸磺酰乳酸磷酸酶基因（）、4-羥基苯乙酸-3-單加氧酶基因（）、氧化還原酶基因（）等40個基因表達上調；碳代謝（KEGG ID: bsu01200）相關的甲基丙二酸半醛脫氫酶基因（）、氨基甲基轉移酶基因（）、2-甲基檸檬酸合成酶基因（）等25個基因表達上調；硫代謝（KEGG ID: bsu00920）相關的硫酸腺苷酰轉移酶基因（）、脂肪族磺酸鹽結合蛋白基因（）、胱硫醚--裂解酶基因（）等8個基因表達上調；乙醛酸和二羧酸代謝（KEGG ID: bsu00630）相關的二磷酸果糖酶基因（）、草酸脫羧酶基因（）、乙酰輔酶A乙酰轉移酶基因（）等9個基因表達上調。

圖2 差異表達基因的GO分析

表4 KEGG代謝途徑分析

鞭毛組裝（KEGG ID: bsu02040）相關的鞭毛生物合成蛋白基因（）、鞭毛M環(huán)蛋白基因（）等26個基因表達下調，差異基因占該代謝途徑基因的78.79%；細菌趨化性（KEGG ID: bsu02030）相關的鞭毛運動開關蛋白基因（、）、趨化蛋白基因（、）等13個基因表達下調，差異基因占該代謝途徑基因的54.17%；核糖體（KEGG ID: bsu03010）相關的50S核糖體蛋白L23（）、30S核糖體蛋白S6（）等18個基因表達下調，差異基因占該代謝途徑基因的20.45%；萜類化合物生物合成（KEGG ID: bsu00900）相關的丙烯基二磷酸合酶基因（、）、焦磷酸合酶基因（）等5個基因表達下調，差異基因占該代謝途徑基因的35.71%；錯配修復（KEGG ID: bsu03430）相關的單鏈DNA結合蛋白基因（）、單鏈DNA特異性核酸外切酶基因（）等6個基因表達下調，差異基因占該代謝途徑基因的30.00%。

2.5 差異表達蛋白分析及功能注釋

分別對空白對照處理、L-脯氨酸處理后的枯草芽孢桿菌NCD-2進行總蛋白提取及iTRAQ定量分析，結果顯示，在對照和處理樣品中共鑒定并定量了2 329個蛋白質，對所有蛋白質強度進行歸一化并進行-test統(tǒng)計差異分析（＜0.05），篩選到211個表達量具有顯著差異的蛋白質。對211個差異蛋白質進行聚類分析（圖3），每一行代表一個蛋白質（群），其中紅色部分表示顯著上調，藍色部分表示顯著下調。對照組和處理組分別聚類，聚類良好，主要聚類為兩大類群。

與空白對照相比，L-脯氨酸處理后NCD-2菌株菌體內118個蛋白上調，93個蛋白下調。以＜0.05為閾值，通過GO顯著性分析確定差異蛋白行使的主要生物學功能（圖4）。結果表明，在分子功能方面，存在8個顯著富集的條目，其分別為作用于CH-NH基團供體的氧化還原酶活性（GO:0016645）、天冬酰胺合酶活性（GO:0004066）、核糖體腺嘌呤二甲基轉移酶活性（GO:0000179）、輔酶A轉移酶活性（GO:0008410）、-谷氨酰轉移酶活性（GO:0003840）、運動活性（GO:0003774）、NAD或NADP作為受體、CH-NH基團為供體的氧化還原酶活性（GO:0016646）和吡咯啉-5-羧酸還原酶活性（GO:0004735）。在生物過程方面，存在13個顯著富集的條目，其分別為羧酸分解代謝過程（GO:0046395）、-氨基酸代謝過程（GO:1901605）、-氨基酸分解代謝過程（GO:1901606）、天冬酰胺生物合成過程（GO:0006529）、核糖體修飾（GO:0000154）、谷胱甘肽代謝過程（GO:0006749）、細胞氨基酸分解代謝過程（GO:0009063）、脯氨酸代謝過程（GO:0006560）、細菌型鞭毛依賴性細胞運動（GO:0071973）、谷氨酰胺家族氨基酸代謝過程（GO:0009064）、有機氮化合物分解代謝過程（GO:1901565）、核糖體加工（GO:0006364）、細胞氨基酸生物合成過程（GO:0008652）。然而在細胞組分方面，L-脯氨酸處理與空白對照處理之間不存在顯著富集的條目。

圖3 差異表達蛋白的聚類分析

圖4 差異表達蛋白的GO功能富集

2.6 差異表達蛋白KEGG代謝途徑分析

獲得的211個差異蛋白經(jīng)DAVID工具分析后，與KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對，確定差異表達蛋白中顯著性富集的代謝通路（篩選閾值以＜0.05為顯著富集的條目），探討枯草芽孢桿菌NCD-2在L-脯氨酸作用下差異表達蛋白參與的代謝通路差異。結果表明，L-脯氨酸處理NCD-2菌株后富集顯著的代謝通路有10條（表5），具體包括酮體的合成與降解、乙醛酸和二羧酸代謝、?；撬岷蛠喤；撬岽x、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、鞭毛組裝、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉化、精氨酸和脯氨酸代謝、丁酸代謝、不同環(huán)境的微生物代謝和ABC轉運蛋白。

表5 差異表達蛋白的KEGG代謝途徑分析

2.7 轉錄-蛋白質組聯(lián)合分析

枯草芽孢桿菌NCD-2菌株經(jīng)L-脯氨酸誘導后，經(jīng)轉錄-蛋白質組聯(lián)合分析表明，存在共有差異的蛋白（或基因）數(shù)目為112個（圖5）。

進一步在GO數(shù)據(jù)庫進行基因功能注釋，以＜0.05為篩選闕值，結果表明，功能分類主要分布在催化活性、細胞脂質代謝過程、定位、營養(yǎng)庫活性、細胞膜、氧化還原過程、sigma因子活性、轉運活性、孢子形成9個方面。

L-脯氨酸處理（T）和空白對照（CK）的轉錄-蛋白質聯(lián)合組學KEGG代謝途徑分析表明，富集顯著的代謝通路有11條，分別為ABC轉運蛋白、細菌趨化性、抗生素生物合成、丁酸代謝、鞭毛組裝、賴氨酸降解、代謝途徑、不同環(huán)境中的微生物代謝、丙酮酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、雙組分系統(tǒng)。其中，62.5%的ABC轉運蛋白通路下調表達；細菌趨化性和雙組分系統(tǒng)通路下調表達；丁酸代謝、丙酮酸代謝、賴氨酸降解、淀粉和蔗糖代謝上調表達；71.43%的抗生素合成、72.73%不同環(huán)境中的微生物代謝、81.82%代謝途徑通路上調表達。

2.8 RT-qPCR 驗證

為驗證轉錄-蛋白質組聯(lián)合分析的數(shù)據(jù)準確性，選取26個差異表達顯著的基因（包含能量代謝、ABC轉運蛋白、抗生素合成、鞭毛組裝、生物膜形成和趨化作用相關的基因），設計引物并利用RT-qPCR 進行對照組和L-脯氨酸誘導下基因的表達量變化分析。結果表明，RT-qPCR 結果與組學聯(lián)合測序的結果在基因表達幅度上有一定的差異，但基因的表達趨勢一致（圖6），說明組學測序的結果是可信的。

all_tran代表轉錄組測序得到的所有基因，diff_tran代表轉錄組測序得到的差異表達基因，all_prot代表蛋白質組測序得到的所有蛋白，diff_prot代表蛋白質組測序得到的差異表達蛋白all_tran represents all the genes identified by transcriptome, diff_tran represents the differentially expressed genes identified by transcriptome, all_prot represents all the proteins identified by proteome, diff_prot represents the differential expressed proteins identified by proteome

3 討論

微生物不同組學技術從生理代謝和形態(tài)結構水平發(fā)展到細胞的內在適應機制、轉錄水平和翻譯水平調控的分子層面[17]?？股厥强莶菅挎邨U菌產(chǎn)生的主要抑菌物質，該菌株在植物根部與其他微生物通過營養(yǎng)競爭和空間競爭表征定殖能力的強弱。芽孢桿菌的定殖作用受自身遺傳因素（主要包括生物膜形成、群集運動和趨化性等）的影響，還受外界環(huán)境條件（植物根系分泌物、溫度、濕度、土壤pH等）的影響。為深入了解棉花根系分泌物L-脯氨酸介導的與枯草芽孢桿菌的分子互作機制，本研究采用轉錄組、蛋白質組及聯(lián)合組學技術分析了枯草芽孢桿菌在L-脯氨酸作用下的響應特征，從生物膜形成、運動和趨化作用、抗生素生物合成、雙組分系統(tǒng)、能量代謝和ABC轉運蛋白通路方面推測了枯草芽孢桿菌對根系分泌物響應情況。

1—13代表能量代謝（氨基酸、糖類等）相關的基因，分別為putC、rocA、ald、gapB、yerA、mmgD、asnO、acoC、yisZ、thrD、ggt、yjmD和yoaD；14—19代表ABC轉運蛋白相關的基因，分別為scoB、glnQ、opuCC、opuCA、znuA和ssuB；20、21代表鞭毛組裝相關的基因，分別為fliF和fliY；22、23代表抗生素合成相關的基因，分別為gcvPB和yodQ；24、25代表生物膜形成相關的基因，分別為epsA和epsC；26代表趨化作用相關的基因cheY 1-13 are genes related to energy metabolism (amino acids, sugars, etc.), representing putC, rocA, ald, gapB, yerA, mmgD, asnO, acoC, yisZ, thrD, ggt, yjmD and yoaD, respectively. 14-19 are genes related to ABC transporters, representing scoB, glnQ, opuCC, opuCA, znuA and ssuB, respectively. 20-21 are genes related to flagellar assembly, representing fliF and fliY, respectively. 22-23 are genes related to biosynthesis of antibiotics, representing gcvPB and yodQ, respectively. 24-25 are genes related to biofilm formation, representing epsA and epsC, respectively. 26 represents chemotaxis related gene cheY

3.1 對生物膜形成的影響

芽孢桿菌的生物膜由胞外多糖（EPS）、TasA蛋白、-多聚谷氨酸（-PGA）以及一些脫氧核糖核酸（DNA）等物質組成，其中胞外多糖和胞外蛋白TasA是構成生物膜的骨架和基本組分，其分別由eps操縱子和tap-sip-tas操縱子負責合成并分泌到胞外組成生物膜的胞外基質，維持芽孢桿菌生物膜的結構穩(wěn)定[18-19]。本研究通過轉錄-蛋白質組學聯(lián)合分析未發(fā)現(xiàn)NCD-2菌株經(jīng)L-脯氨酸處理后對生物膜形成GO功能顯著富集的相關基因。然而，轉錄組分析發(fā)現(xiàn)L-脯氨酸處理后GO功能富集的生物膜形成相關的MarR家族轉錄調控因子基因（）和假設蛋白基因（）上調表達；蛋白質組學分析發(fā)現(xiàn)在L-脯氨酸作用下NCD-2菌株的參與生物膜基質形成的多聚糖生物合成蛋白基因（）下調表達，而生物膜蛋白基因（）上調表達。此外，本課題組前期發(fā)現(xiàn)，L-脯氨酸處理后顯著提高NCD-2菌株中表達，且隨外源L-脯氨酸濃度的增加，表達倍數(shù)遞增；而低濃度L-脯氨酸（0.625 mg·mL-1）顯著提高了的表達，高濃度L-脯氨酸使表達量與空白對照差異不顯著，推測L-脯氨酸處理后主要是誘導的表達，促使產(chǎn)生更多的胞外蛋白TasA，而胞外多糖較少參與或不參與[16]。因此，為了更深入系統(tǒng)地了解NCD-2菌株對棉花根系分泌物L-脯氨酸的響應機制，對和的功能進行驗證是今后的重要工作之一。

3.2 對運動或趨化作用的影響

鞭毛是細菌的運動器官，細菌會通過鞭毛介導的運動朝著有利的方向運動，具有一定的趨化作用[20]。趨化作用是生防菌在植物根部形成生物膜定殖到植物根部進而發(fā)揮防病作用的前提條件[21]。此外，已有研究表明部分細菌鞭毛、纖毛、菌絲及膜小泡等對生物膜形成存在影響[22-24]。本研究中，在L-脯氨酸作用下，NCD-2菌株的鞭毛組裝和細菌趨化性相關的GO term顯著富集，包含鞭毛運動開關基因（）、鞭毛基體M環(huán)蛋白基因（）、趨化和運動的調控基因（）均表現(xiàn)為下調表達。轉錄組分析表明，趨化作用相關基因（）、與鞭毛相關的基因）均下調表達。由此推測，NCD-2菌株在L-脯氨酸作用下，雖然在一定程度上降低了其運動和趨化作用，但能夠在寄主周圍定殖占據(jù)生態(tài)位。

3.3 對抗生素合成的影響

已有研究表明，抗生素是枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的主要抑菌物質，同時抗生素類物質是微生物競爭的有效武器，且其能夠作為信號分子調節(jié)微生物群落的動態(tài)平衡[25-28]。Hoffman等[26]研究報道抗生素妥布霉素（tobramycin）在低濃度下能夠增強細菌生物膜的形成；López等[27]研究報道表面活性素（surfactin）能夠感受細胞膜激酶KinC并傳導至SinI-Spo0A途徑，增強枯草芽孢桿菌6051生物膜的形成；Xu等[28]研究表明，桿菌霉素D（bacillomycin D）的合成基因缺失突變菌株顯著影響解淀粉芽孢桿菌的生物膜形成和根際定殖能力；徐志輝等[29]研究報道桿菌霉素D參與鐵離子調控解淀粉芽孢桿菌SQR9生物膜形成的通路；董麗紅[30]研究發(fā)現(xiàn)，表面活性素通過增強生物膜形成能力提高NCD-2菌株的定殖能力。

本研究通過轉錄-蛋白質聯(lián)合組學分析發(fā)現(xiàn)，在L-脯氨酸作用下，NCD-2菌株抗生素合成相關的GO term顯著富集，細胞脂質代謝過程基因（）、吡咯啉-5-羧酸還原酶基因（）和dTDP-4-脫氧核糖核酸-3,5-差向異構酶基因（）下調表達，占抗生素合成代謝途徑的28.57%，而負責催化活性的氨基甲基轉移酶基因（）、甘氨酸脫羧酶基因（）、脯氨酸脫氫酶基因（）和脫乙酰酶基因（）上調表達，占該代謝途徑的71.43%。蛋白質組學分析發(fā)現(xiàn)，與空白對照相比，NCD-2菌株經(jīng)L-脯氨酸處理后脂肽類抗生素泛革素（fengycin）家族合成酶相關基因（）、聚酮類抗生素（如四環(huán)素、紅霉素等）聚酮體合成酶基因（）表達不存在顯著差異；表面活性素家族合成酶相關基因和表達不存在顯著差異，而顯著下調表達。綜上所述，上述基因的表達可能是枯草芽孢桿菌NCD-2菌株在L-脯氨酸作用下產(chǎn)生的應激反應。

3.4 對雙組分信號轉導系統(tǒng)的影響

Stock等[31]認為雙組分信號轉導系統(tǒng)是細菌中常見的信號系統(tǒng)，細菌可以通過雙組分系統(tǒng)感知、適應各種細胞外環(huán)境條件的變化并作出反應。已有研究表明，典型的雙組分系統(tǒng)由位于細胞膜上的組氨酸蛋白激酶和位于細胞質內的調控因子組成，細菌中雙組分系統(tǒng)的數(shù)量取決于基因組大小和細菌所處環(huán)境的多樣性[32-33]?？莶菅挎邨U菌含有36種組氨酸激酶和34種響應因子[34]。同時，許多學者研究發(fā)現(xiàn)，雙組分系統(tǒng)作為信號分子影響抗生素生物合成、氨基酸合成、生物膜形成和芽孢形成相關基因[35-37]。Sullivan[35]研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌中雙組分調控系統(tǒng)ComPA，主要調控感受態(tài)的形成（吸收外源DNA）和表面活性素、-多聚谷氨酸的產(chǎn)生；Murray等[36]研究發(fā)現(xiàn)，雙組分調控系統(tǒng)DegSU中的調控因子DegU能夠調控芽孢桿菌從浮游狀態(tài)向生物膜狀態(tài)的改變；Guo等[37]研究認為，PhoR/PhoP雙組分系統(tǒng)通過影響氨基酸和碳水化合物的代謝來調控脂肽類物質的合成。

本研究中蛋白質組學分析發(fā)現(xiàn)，NCD-2菌株中存在42個雙組分調控系統(tǒng)，在L-脯氨酸作用下，其中DegSU、PhoRP、ResDE、VicRK等40個雙組分調控系統(tǒng)中基因表達不存在顯著差異，而DNA結合反應調控因子（NarL/FixJ家族，包含REC和HTH結構域）基因表達顯著上調，趨化反應調控因子CheB（趨化性家族，包含REC和蛋白質谷氨酸甲基酯酶結構域）基因表達顯著下調。

3.5 對能量代謝的影響

Pisithkul等[38]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌在早期生物膜生長期間三羧酸（TCA）循環(huán)的相關酶活性增加，從脂肪酸生物合成轉變?yōu)橹舅峤到?，通過代謝組學、轉錄組學和蛋白質組學的結果表明，生物膜發(fā)育過程中的代謝重塑受轉錄水平的調控，證明乙酰膽堿的產(chǎn)生對生物膜的生長至關重要，并且具有維持氧化還原平衡和細胞外pH的雙重作用。Kimura等[39]研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸合成酶缺失突變體抑制了生物膜的形成，進一步分析發(fā)現(xiàn)該突變體在三羧酸循環(huán)中積累的檸檬酸根離子會由于螯合而導致鐵缺乏，從而降低生物膜形成，外源添加過量的鐵到培養(yǎng)基時，突變體的生物膜形成能力恢復。本研究蛋白質組學分析發(fā)現(xiàn)，參與三羧酸循環(huán)的編碼檸檬酸合成酶基因（）上調表達、參與糖酵解的3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（和）分別表現(xiàn)下調和上調表達。聯(lián)合組學分析表明，在L-脯氨酸作用下，NCD-2菌株丁酸代謝相關的GO term顯著富集，乙酰輔酶A轉移酶基因（）、3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶基因（）和降解乙酰輔酶A硫酶基因（）上調表達；NCD-2菌株中催化活性和營養(yǎng)庫活性相關的GO term顯著富集，依賴AdoMet甲基轉移酶基因（）、草酸脫羧酶基因（）、氧化還原酶基因（）、羧酸脫氫酶基因（）、依賴NAD的丙氨酸脫氫酶基因（）、腺嘌呤脫氨酶基因）、芽孢形成相關的天冬酰胺合成酶基因（）、膜結合-谷氨酰轉肽酶基因（）上調表達；NCD-2菌株中淀粉和蔗糖代謝活性相關的GO term顯著富集，葡萄糖苷酶基因（）、磷酸轉移酶系統(tǒng)（PTS）地衣聚糖特異酶基因（）和麥芽糖特異酶基因（）均上調表達。此外，蘇氨酸合成酶基因（）、2-羥基酸脫氫酶基因（）和天冬氨酸激酶Ⅲ基因（）下調表達，而檸檬酸合成酶基因（）、2-磷酸-3-環(huán)丁磺酸合酶基因（）、二氫硫辛酸乙酰轉移酶基因（）、磷酸腺苷酸還原酶基因（）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因（）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（）、腺苷酸硫酸激酶基因（）等8個基因上調表達。上述代謝途徑基因表達的變化說明L-脯氨酸干擾了NCD-2菌株的能量代謝，其中由于芽孢形成相關的天冬酰胺合成酶基因（）上調表達，推測L-脯氨酸可能促進NCD-2菌株芽孢產(chǎn)生，從而提高菌株在環(huán)境中的存活能力，該推論有待于進一步驗證。

3.6 對ABC轉運蛋白的影響

已有研究表明，無機離子轉運和代謝（如鐵離子）對微生物生物膜的形成至關重要。Rizzi等[40]研究認為，枯草芽孢桿菌生物膜的形成與鐵的獲取之間有著密切聯(lián)系，尤其是生物膜基質在促進鐵載體的有效利用方面起著重要作用；Ollinger等[41]證實枯草芽孢桿菌共有5個鐵離子運輸?shù)霓D運系統(tǒng)，即YwbMNL、YfmCDEF、YfiYZ、FhuBGC和FeuABC；Lin等[42]發(fā)現(xiàn)鐵離子ABC轉運蛋白正向調控生物膜形成，在低鐵的條件下，金黃色葡萄球菌（）鐵ABC轉運蛋白基因缺失后生物膜形成能力下降了75%；Banin等[43]和Patriquin等[44]發(fā)現(xiàn)，敲除銅綠假單胞菌（）中鐵載體pyoverdine的基因后，突變菌株僅能形成微弱的生物膜，外源加入鐵不能夠形成完整的生物膜；XU等[28]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌突變體SQR9M1的生物膜形成延遲現(xiàn)象與其鐵離子轉運能力受損有關，其鐵離子ABC轉運蛋白FhuBGC、FeuABC和YfmCDEF相關基因顯著下調表達。本研究發(fā)現(xiàn)，L-脯氨酸處理后NCD-2菌株與ABC轉運蛋白活性相關的GO term顯著富集，62.5%的ABC轉運蛋白通路下調表達，包括不同氨基酸ATP結合蛋白的基因（）、細胞通透蛋白的基因（）、氨基酸結合脂蛋白基因（）、保護細胞通透脂蛋白的基因（）；37.5%的ABC轉運蛋白通路上調表達，包括谷氨酰胺轉運蛋白基因（）、鋅結合脂蛋白基因（）和脂肪族磺酸鹽轉運蛋白基因（）。同時，經(jīng)蛋白質組學分析發(fā)現(xiàn)鐵離子結合脂蛋白基因（）上調表達，而轉錄組學分析發(fā)現(xiàn)鐵ABC轉運蛋白相關基因（）下調表達。因此，在L-脯氨酸作用下NCD-2菌株的ABC轉運蛋白代謝途徑相關基因的表達產(chǎn)生改變，但其具體分子機制還需深入研究。

4 結論

棉花根系分泌物L-脯氨酸與生防菌株枯草芽孢桿菌NCD-2之間存在復雜的分子互作關系，通過轉錄-蛋白質聯(lián)合組學分析發(fā)現(xiàn)，顯著富集的代謝通路主要集中在生物膜形成、趨化作用、抗生素生物合成、雙組分系統(tǒng)、能量代謝和ABC轉運蛋白方面，從而影響生防菌株的定殖能力和抑菌作用。同時，不同代謝途徑之間存在密切的關系，共同影響枯草芽孢桿菌NCD-2生物膜形成的調控網(wǎng)絡。

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Transcriptome and proteome analysis ofNCD-2 response to L-proline from cotton root exudates

ZHAO Weisong, GUO Qinggang, DONG Lihong, WANG Peipei, SU Zhenhe, ZHANG Xiaoyun, LU Xiuyun, LI Shezeng, MA Ping

Plant Protection Institute of Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences/IPM Centre of Hebei Province/Key Laboratory of IPM on Crops in Northern Region of North China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Baoding 071000, Hebei

【】L-proline in root exudates of cotton is one of the key factors affecting the colonization of biocontrol microorganisms. Previous studies showed that L-proline could improve the ability ofNCD-2 biofilm formation. The objective of this study is to explore the regulatory genes related to the biofilm formation and biocontrol potential of strain NCD-2 through high-throughput sequencing technology, and to lay a foundation for further understanding the molecular interaction between cotton root exudates and biocontrol strain.【】Strain NCD-2 was co-cultured with L-proline at the concentration of 10 mg·mL-1for 24 h, and it was analyzed by transcriptome (RNA-seq) and isotope labeled relative quantitative proteomics (iTRAQ). The expression of some differential genes in different metabolic pathways was verified by RT-qPCR.【】Transcriptome analysis showed that 1 071 differentially expressed genes (DEGs) were obtained after L-proline and NCD-2 co-culture, of which 602 genes were up-regulated and 469 genes were down-regulated. Go analysis showed that 49, 14 and 30 functional items were significantly enriched in biological process, cell component and molecular function, respectively. KEGG pathways were mainly enriched in compound metabolism, flagellum assembly, bacterial motility or chemotaxis. Proteomic analysis showed that a total of 211 differentially expressed proteins (DEPs) were detected compared to the control, of which 118 proteins were up-regulated and 93 proteins were down-regulated. Go analysis showed that 13 and 8 functional items were significantly enriched in biological process and molecular function, respectively. KEGG pathways were mainly enriched in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism, flagellum assembly and ABC transporter. Further transcriptional-proteomics analysis revealed that 112 DEGs (or DEPs), including 38 down-regulated genes (or proteins) and 74 up-regulated genes (or proteins), were detected. GO functional items were significantly enriched in nine aspects, including nutrient reservoir activity, catalytic activity, cell membrane, localization, cellular lipid metabolic process, oxidation-reduction process, sigma factor activity, transport activity and spore formation. KEGG pathways were mainly enriched in energy metabolism, ABC transporter, antibiotic biosynthesis, flagellum assembly, motility or chemotaxis and two-component system. Twenty-six DEGs were verified by RT-qPCR. The results showed that there were some differences in the expression level, but the expression trend was basically consistent with that of RNA-seq and iTRAQ.【】The interaction between L-proline in cotton root exudates andNCD-2 is a complex biological process, which depends on multiple genes in different metabolic pathway networks. It is cleared that DEGs (or DEPs) of the two-component system, antibiotic biosynthesis, energy metabolism, motility or chemotaxis, flagellum assembly and ABC transporter pathway may play an important role in the interaction between cotton root exudates and.

L-proline;; transcriptome; proteome; interaction relationship

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.21.009

2021-03-21；

2021-05-31

國家自然科學基金（31801786）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系（CARS-15-18）、河北省農(nóng)林科學院科學技術研究與發(fā)展計劃（201820101）、國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201503109）

趙衛(wèi)松，E-mail：zhaoweisong1985@163.com。通信作者馬平，E-mail：pingma88@126.com

（責任編輯 岳梅）