馬海霞 趙麗萍 陳文潔 胡偉宏 張世坤

目前，全球仍然約有20億人感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，其中包括約2.57億慢性乙型肝炎(CHB)患者[1]。目前認為肝組織中共價閉合的環(huán)狀DNA(cccDNA)是反映HBV復(fù)制和感染狀態(tài)形成的關(guān)鍵因素，完全消除HBV cccDNA是評估CHB患者治愈的金標準[2-4]。然而，肝內(nèi)HBV cccDNA的檢測依賴于肝活檢，但因為其有創(chuàng)的操作阻礙了肝活檢的廣泛應(yīng)用[5-6]。

HBV前基因組RNA(pgRNA)是HBV復(fù)制的中間產(chǎn)物，許多研究已證實，血清HBV pgRNA是由感染的肝細胞中的HBV cccDNA轉(zhuǎn)錄而來[7-9]。當病毒的逆轉(zhuǎn)錄和DNA合成受到抑制時，接受核苷類似物(NA)治療的患者的血清HBV RNA水平可以反映cccDNA在肝細胞中的轉(zhuǎn)錄活性[10]。這些pgRNA以HBV RNA病毒樣顆粒的形式存在于成熟病毒顆粒的核衣殼中，并與持續(xù)的病毒感染和病毒學(xué)反彈風(fēng)險相關(guān)[11]。然而，對于經(jīng)NA治療后不同臨床結(jié)局的患者，pgRNA作為cccDNA的替代是否有差別，目前尚無相關(guān)的分層分析。本研究收集了HBV感染后接受NA治療的210例臨床結(jié)果不同的患者的血清樣本，分析pgRNA在不同患者中的有效性。

資料與方法

一、一般材料

從2016年至2018年，本研究共納入在河南焦作煤業(yè)(集團)中央醫(yī)院接受恩替卡韋(ETV)或替諾福韋(TDF)治療超過6個月的210例不同臨床結(jié)局的HBV感染者，包括無癥狀攜帶者(ASC)、慢性乙型肝炎(CHB)患者和肝硬化(LC)患者各70例。根據(jù)2015年《慢性乙型肝炎預(yù)防和治療指南》[12]的診斷標準收集臨床標本，將血清樣品快速保存在-80 ℃直至進一步使用。其中ASC組的所有患者HBV DNA結(jié)果均為陽性，且根據(jù)Metavir評分系統(tǒng)，組織活性指數(shù)(HAI)或纖維化指數(shù)(F)均大于或等于2。另外選取對照組，包括健康人和其他病毒感染者，包括丙型肝炎病毒(HCV)、單純皰疹病毒(HSV)和EB病毒(EBV)的患者。本研究得到河南焦作煤業(yè)(集團)中央醫(yī)院倫理委員會的批準，每個登記的患者都簽署了知情同意書。

二、研究方法

(一)血清pgRNA水平的檢測 使用StepOne Plus熒光定量PCR(qPCR)機器(美國Life Technologies)檢測HBV感染者的血清pgRNA水平，具體方法和所使用的特異性引物及TaqMan探針參照先前文章[14]。

(二)血清HBV DNA、HBsAg和HBeAg水平的檢測

根據(jù)說明書，使用病毒基因組DNA提取試劑盒(北京新諾)提取HBV DNA，然后在-80 ℃下保存直至使用。HBV DNA和高靈敏度HBV DNA的水平用市售的實時熒光定量試劑盒(湖南圣湘)進行定量檢測，并使用試劑盒(美國Abbott)定量檢測HBV血清標志物HBsAg和HBeAg的水平。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

血清HBV DNA水平以及HBsAg和HBeAg的濃度進行對數(shù)轉(zhuǎn)換后分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析使用SPSS 23.0軟件(IBM，美國)進行。采用Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗：正態(tài)分布的數(shù)據(jù)表示為平均值和標準差，并使用T檢驗比較兩組之間的差異，采用ANOVA檢驗比較多組的差異；非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)表示為中位數(shù)和四分位區(qū)間(IQR)，使用Kruskal-Wallis檢驗比較多組間差異。采用Pearson相關(guān)分析分析各指標見的相關(guān)程度。雙尾P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同臨床結(jié)局患者的血清標志物水平的比較

表1列出了各組患者的基本臨床信息，結(jié)果顯示入組人群中超過一半的為男性，LC組患者的年齡顯著大于ASC和CHB組(P=0.003)。對于各標志物來說，ASC組和CHB組患者的各標志物水平也顯著高于LC組(P值都小于0.001)，反映了肝硬化患者病毒的不活躍狀態(tài)。

表1 HBV感染后不同臨床結(jié)局患者的臨床特征對比

二、不同臨床結(jié)局的HBV感染患者不同血清學(xué)指標的相關(guān)性分析

所有入組患者的不同血清學(xué)指標之間的相關(guān)性如圖1和圖2所示，結(jié)果表明HBV pgRNA和HBV DNA、HBsAg水平之間都呈正相關(guān)關(guān)系(HBV pgRNA與HBV DNA：R=0.613，P<0.001 ; HBV pgRNA與HBsAg：R=0.503，P<0.001)。對不同臨床結(jié)局的HBV感染患者血清學(xué)指標之間的相關(guān)性進行分層分析結(jié)果顯示，三組患者的HBV pgRNA與HBV DNA水平都呈正相關(guān)(ASC組：R=0.584，P<0.001; CHB組：R=0.634，P<0.001; LC組：R=0.493，P<0.001)。然而，在ASC和CHB組中，HBV pgRNA和HBsAg水平之間呈正相關(guān)關(guān)系(ASC組：R=0.512，P<0.001；CHB組：R=0.537，P<0.001)，但LC組則沒有正相關(guān)關(guān)系(R=0.065，P=0.582)。

圖1 HBV pgRNA 和 HBV DNA的相關(guān)性分析

圖2 HBV pgRNA 和 HBsAg的相關(guān)性分析

三、比較HBeAg陽性和陰性組中HBV pgRNA和HBV DNA的水平及其相關(guān)性

將210例HBV患者的標本分為HBeAg陽性組和HBeAg陰性組進行對比，如圖3所示。結(jié)果表明，HBeAg陽性組的HBV pgRNA和HBV DNA水平都顯著高于HBeAg陰性組的水平(P<0.001)。HBV pgRNA和HBV DNA水平在HBeAg陽性組和HBeAg陰性組患者中均呈正相關(guān)關(guān)系，但前者的相關(guān)性強于后者(HBeAg陽性組：R=0.587，P<0.001； HBeAg陰性組：R=0.313，P<0.001)。

圖3 根據(jù)HBeAg狀態(tài)不同分組HBV pgRNA和HBV DNA的對比

四、HBV DNA水平<500 IU/mL的標本中HBV pgRNA的檢出率分析

將患者按照HBV DNA的水平進行劃分，分析結(jié)果如表2所示。HBV DNA<500 IU/mL的血清標本中HBV pgRNA的檢出率為72.8%?；诖私Y(jié)果，筆者從54名HBeAg陰性患者中選擇了樣本進行進一步分析，包括37例HBV DNA水平<20 IU/mL的標本和17例HBV DNA水平> 20 IU/mL但<500 IU/mL。統(tǒng)計分析表明，兩組中HBV pgRNA的檢出率分別為17.6%和41.2%。

表2 HBV DNA水平<500 IU/mL患者的臨床特征

討 論

據(jù)統(tǒng)計，全世界有20億的CHB患者，這其中15%～40%的患者因為得不到早期診治會發(fā)展為LC或HCC[13]。目前，依靠血清HBsAg、HBeAg、HBV DNA和ALT的水平，結(jié)合肝纖維化檢查，可以區(qū)分不同時期的HBV感染，確定治療時機，判斷停藥時間。然而，常用的標志物依然不能準確反映cccDNA的復(fù)制狀態(tài)。

既往研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者的血清HBsAg水平與肝細胞核中HBV cccDNA的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)密切相關(guān)，因此可以用血清HBsAg水平反映肝細胞核中HBV cccDNA的清除率[14]。本研究的結(jié)果顯示，三組患者之間的HBV DNA和HBsAg水平顯著不同，具體來說，CHB組的HBV DNA和HBsAg水平均高于LC組，表明LC患者HBV復(fù)制的不活躍。此外，CHB組和LC組患者的血清HBV pgRNA水平也與HBV DNA和HBsAg的水平一致，表明pgRNA與HBV DNA和HbsAg的一致性。血清HBsAg的消失是CHB“功能治愈”的標準，但由于HBV DNA在HBV感染的肝細胞中的整合，血清HBsAg有時會出現(xiàn)持續(xù)低表達，在這種情況下，血清HBsAg無法反映肝臟中cccDNA的活性[14-16]。與血清HBsAg不同的是，血清pgRNA的來源只有cccDNA，可以準確反映肝臟中cccDNA的狀態(tài)。

有研究表明CHB患者血清中的HBV RNA和HBV DNA水平呈正相關(guān)[17]，本研究也發(fā)現(xiàn)血清HBV pgRNA水平和HBV DNA表達水平高度相關(guān)。然而，不同臨床結(jié)局的HBV感染者，尤其是ASC組和CHB組中，血清HBV pgRNA、HBV DNA和HBsAg水平之間存在一定的相關(guān)性。這些結(jié)果表明，HBV感染者血清中HBV pgRNA與其他傳統(tǒng)指標相當。但值得注意的是，盡管各種HBV血清學(xué)和分子標志物之間呈正相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)程度并不高，這可能歸是由于病毒變異的積累以及臨床研究中宿主背景的多樣性造成的。

目前，抗病毒療效評估主要取決于HBV DNA水平，但HBV DNA低于檢測極限時僅表示病毒的逆轉(zhuǎn)錄被抑制，并不能作為停藥標準[18]。因此本研究分析了DNA水平<500 IU/mL的HBV感染者的HBV pgRNA水平，發(fā)現(xiàn)檢出率高達78.9%，并且即使在HBV DNA水平低于20 IU/mL的情況下，也有17.57%的患者檢測出HBV pgRNA。因此，僅通過檢測HBV DNA拷貝數(shù)來評估抗病毒治療的療效具有一定的局限性，而與HBV DNA相比，血清HBV pgRNA在監(jiān)測治療期間持續(xù)病毒應(yīng)答和cccDNA水平的變化方面具有優(yōu)勢。