張建坡，金 麗，金 星，張志會(huì)，鐘方麗，馬明碩

(吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022)

分析化學(xué)從分析的原理方面分，可以分為化學(xué)分析和儀器分析，它的主要任務(wù)是根據(jù)物質(zhì)運(yùn)動(dòng)和變化的理論，創(chuàng)建有關(guān)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)、研制儀器設(shè)備、制定分析方法，它對(duì)國民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、國防力量的壯大和科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步各方面有著舉足輕重的作用[1-2]。分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)為我?；瘜W(xué)類專業(yè)的必修課程。目前，主要內(nèi)容以滴定分析、色譜實(shí)驗(yàn)、電化學(xué)實(shí)驗(yàn)為主，這些實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)相類似，缺乏創(chuàng)新性；而光譜類實(shí)驗(yàn)(傅里葉紅外光譜實(shí)驗(yàn)和紫外可見吸收光譜實(shí)驗(yàn))主要為驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，缺乏與實(shí)際生活的聯(lián)系，導(dǎo)致學(xué)生學(xué)習(xí)興趣下降，未能取得良好的教學(xué)效果[3-5]。近年來，熒光探針，基于量子點(diǎn)類熒光強(qiáng)度的變化對(duì)食品添加劑進(jìn)行定量分析，被廣泛研究[6-11]。因此，結(jié)合教師科研課題，基于胭脂紅對(duì)石墨烯量子點(diǎn)的熒光猝滅作用，引導(dǎo)學(xué)生設(shè)計(jì)并完成一種熒光猝滅法定量分析飲料中胭脂紅含量的分析方法的研究型實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括實(shí)驗(yàn)條件的選擇(溶液酸度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響)、工作曲線的建立、猝滅機(jī)理的探討和實(shí)際樣品的分析，使學(xué)生不僅學(xué)會(huì)使用熒光分光光度計(jì)，而且學(xué)會(huì)利用origin軟件對(duì)熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

一、實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

(一)實(shí)驗(yàn)儀器

天津港東F-280熒光分光光度計(jì)；島津UV-2550紫外可見分光光度計(jì)；德國IKA RCT恒溫磁力攪拌器和部分小型玻璃儀器，均為實(shí)驗(yàn)室常用儀器。

(二)實(shí)驗(yàn)試劑

胭脂紅購自天津開復(fù)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所有的試劑均為分析純，使用前未做任何處理。

二、實(shí)驗(yàn)教學(xué)方案設(shè)計(jì)

(一)溶液配制

(1)通過檸檬酸裂解法得到濃度為0.5 mg·L-1的石墨烯量子點(diǎn)，已為學(xué)生準(zhǔn)備好樣品，樣品的平均熒光壽命為6.14 ns。

(2)準(zhǔn)確稱取0.01 g胭脂紅固體，定容于100 mL容量瓶中，得到胭脂紅儲(chǔ)液(0.1 g·L-1)。

(3)配制濃度均為0.1 mol·L-1的氫氧化鈉和鹽酸溶液；準(zhǔn)確配置pH=7.0、C=1 mol·L-1的緩沖溶液(使用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉)。

(二)熒光發(fā)射光譜的測定和紫外-可見吸收光譜的測定

熒光光譜測試條件：激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為5 nm，激發(fā)波長為367 nm，測試范圍為400～650 nm；紫外-可見吸收光譜測試范圍300～650 nm。

(三)實(shí)驗(yàn)條件的選擇

1.溶液酸度的影響

取10個(gè)比色管，向其中均加入0.1 mL石墨烯量子點(diǎn)和40 μL的胭脂紅儲(chǔ)液，將加入胭脂紅的溶液用鹽酸和氫氧化鈉溶液依次調(diào)節(jié)溶液pH為2～11后，定容至10 mL，得到1～10號(hào)溶液，室溫下孵育5 min后，測得熒光發(fā)射光譜。

同時(shí)，取10個(gè)比色管，向其中均加入0.1 mL石墨烯量子點(diǎn)，用鹽酸和氫氧化鈉溶液依次調(diào)節(jié)溶液pH為2～11后，定容至10 mL，得到1～10號(hào)溶液，室溫下孵育5 min后，測得熒光發(fā)射光譜，作為對(duì)照熒光強(qiáng)度。

2.反應(yīng)時(shí)間的影響

取2個(gè)比色管，向其中加入0.1 mL石墨烯量子點(diǎn)，分別向其中加入0 μL和40 μL的胭脂紅儲(chǔ)液，用pH為7的緩沖溶液定容至10 mL，得到1和2號(hào)溶液，每隔2 min測一次2號(hào)溶液的熒光發(fā)射光譜，測1號(hào)溶液的熒光發(fā)射光譜作為對(duì)照。

(四)猝滅機(jī)理探討

1.UV-vis吸收光譜

取2個(gè)比色管，向其中加入0.1 mL石墨烯量子點(diǎn)，分別向其中加入0 μL和40 μL的胭脂紅儲(chǔ)液，用pH為7的緩沖溶液定容至10 mL，得到1和2號(hào)溶液，分別測得兩個(gè)溶液的紫外-可見吸收光譜。

2.變溫實(shí)驗(yàn)及kq值的比較

取6個(gè)比色管，向其中加入0.1 mL石墨烯量子點(diǎn)，并加入一系列體積(0、10、20、30、40和50 μL)的胭脂紅儲(chǔ)液，用pH為7的緩沖溶液定容至10 mL，得到1～6號(hào)溶液，室溫下孵育5 min后，將溶液依次置于20和30 ℃水浴中10 min后，測得熒光發(fā)射光譜。

根據(jù)Kq=KSV/τ0，其中KSV由變溫實(shí)驗(yàn)的斜率求得，τ0=6.14 ns(樣品的平均熒光壽命)，求得kq值再與最大擴(kuò)散碰撞速率常數(shù)(2.0×1010L·mol-1·s-1)進(jìn)行比較。

(五)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取8個(gè)比色管，向其中加入0.1 mL石墨烯量子點(diǎn)，并加入一系列體積(0、10、20、30、40、50、60和70 μL)的胭脂紅儲(chǔ)液，用所配置的緩沖溶液統(tǒng)一定容至10 mL，在經(jīng)過5 min室溫孵育后，分別測定其熒光發(fā)射光譜。

(六)實(shí)際樣品分析

(1)移取20 mL飲料于50 mL燒杯中，置于電爐上微沸10 min以去除溶液中的二氧化碳，冷卻后，備用，得樣品A溶液。

(2)取2個(gè)比色管，先加入石墨烯量子點(diǎn)0.1 mL，再分別加入樣品A溶液0 mL和0.4 mL，用pH為7的緩沖溶液定容至10 mL，5 min后測得熒光發(fā)射光譜，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到樣品中胭脂紅的含量，單位為g/mL。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

(一)溶液酸度和孵育時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響

首先研究了pH值對(duì)反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度(F0/F)的影響(圖1)。F0/F值隨著pH值的增大呈現(xiàn)而先增大后減小的趨勢，在pH=7時(shí)出現(xiàn)最大值，因而測試pH值定為7；其次研究了孵育時(shí)間對(duì)F0/F的影響。當(dāng)孵育5分鐘后，該體系的熒光強(qiáng)度變化(F0/F)趨于平穩(wěn)，因而選擇孵育時(shí)間為5分鐘。

pH

(二)猝滅機(jī)理探討

1.UV-vis吸收光譜

打開電腦和紫外-可見分光光度計(jì)，測試前預(yù)熱20 min。雙擊測試軟件圖標(biāo)，儀器完成自檢后，設(shè)置測試范圍為200～800 nm，先測空白溶液得到基線，之后測試樣品。

測試結(jié)果如圖2所示，未加入胭脂紅時(shí)GQDs的紫外吸收峰位于334 nm(黑線)，加入胭脂紅后，GQDs的紫外吸收峰發(fā)生了明顯的藍(lán)移(紅線)，這表明GQDs和胭脂紅之間形成了新的復(fù)合物。

Wavelength/nm

2.變溫實(shí)驗(yàn)

選取20 ℃、30 ℃和40 ℃3個(gè)溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測定。依據(jù)方程F0/F=KSV[C]+b對(duì)所測熒光光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，其中F0代表GQDs的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為加入胭脂紅后GQDs的熒光強(qiáng)度，C表示胭脂紅的濃度。隨著孵育溫度的增加，擬合直線的斜率依次減小，這是因?yàn)殡S著溫度增加，所形成的石墨烯量子點(diǎn)/胭脂紅復(fù)合物的穩(wěn)定性依次減弱。

3.比較kq值

通過方程Kq=KSV/τ0計(jì)算，τ0=6.14 ns。通過計(jì)算可知20 ℃時(shí)KSV為1.60×105(R2為0.997)，則Kq為2.6×1014mol·L-1·s-1，30 ℃時(shí)KSV為1.47×105(R2為0.989)，則Kq為2.4×1014mol·L-1·s-1，40 ℃時(shí)KSV為1.29×105(R2為0.991)，則Kq為2.1×1014mol·L-1·s-1該數(shù)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于2×1010mol·L-1·s-1(最大動(dòng)力學(xué)猝滅常數(shù))。

綜上，依據(jù)紫外吸收光譜分析、變溫實(shí)驗(yàn)分析和kq值的比較，從理論上可以判定胭脂紅對(duì)GQDs的熒光猝滅為準(zhǔn)靜態(tài)猝滅過程。其反應(yīng)機(jī)理可以闡述如下：胭脂紅作為一種有機(jī)染料，每一個(gè)分子均具有—SO3-和—OH基團(tuán)，而石墨烯量子點(diǎn)表面具有—COOH，石墨烯量子點(diǎn)表面的—COOH與胭脂紅表面的—SO3-之間具有較強(qiáng)的相互作用(如圖3所示)，因而形成二者的復(fù)合物，引發(fā)GQDs基態(tài)化合物的能量散失，造成GQDs熒光發(fā)射強(qiáng)度降低，即GQDs的熒光猝滅。

圖3 石墨烯量子點(diǎn)與胭脂紅作用機(jī)理模擬圖

(三)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在最優(yōu)條件下，發(fā)現(xiàn)胭脂紅濃度為0.165 6～1.158 9 μmol·L-1的范圍內(nèi)，石墨烯量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的降低(F0/F)與胭脂紅濃度之間具有良好的線性關(guān)系(如圖4所示)，回歸方程為F0/F=1.905 3[胭脂紅]+ 0.742 1，相關(guān)系數(shù)為0.997。通過方程LOD=(3.3 σ·k-1)計(jì)算得檢出限(LOD)為0.052 34 μmol·L-1，σ代表標(biāo)準(zhǔn)偏差，k代表回歸方程的斜率。通過5次重復(fù)檢測1.5 μg·L-1的胭脂紅，得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(2.8%)，說明該方法具有良好的重復(fù)性。

Concentration of Ponceau 4R/(μmol·L-1)

(四)實(shí)際樣品分析

1.做圖法求算飲料中胭脂紅的含量

如圖5所示，實(shí)際樣品引起的GQDs熒光強(qiáng)度變化的F0/F值為1.968 8，通過做圖法可知胭脂紅的濃度為0.643 8 μmol·L-1；該濃度為原飲料溶液0.4 mL定容至10 mL，稀釋后所含胭脂紅的濃度，原飲料中含有胭脂紅的濃度應(yīng)換算為0.643 8×604×10-4/4=9.721 mg·L-1。通過本實(shí)驗(yàn)讓學(xué)生學(xué)會(huì)使用origin做圖，掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線法作圖法求算未知樣品的含量。

Concentration of Ponceau 4R/(μmol·L-1)

2.計(jì)算法求算飲料中胭脂紅的含量

依據(jù)F0/F=1.968 8，根據(jù)回歸方程F0/F=1.905 3[胭脂紅]+ 0.742 1，胭脂紅的濃度為0.643 8 μmol·L-1；該濃度為原飲料溶液0.4 mL定容至10 mL，稀釋后所含胭脂紅的濃度，原飲料中含有胭脂紅的濃度應(yīng)換算為0.643 8×604×10-4/4=9.721 mg·L-1。

四、結(jié) 語

通過食品添加劑對(duì)石墨烯量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度變化的實(shí)驗(yàn)探究，設(shè)計(jì)了一個(gè)定量分析飲料中胭脂紅含量的綜合型實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)過程中，學(xué)生需要獨(dú)立完成溶液的配制、儀器調(diào)試、測試和實(shí)際樣品分析等工作；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后需運(yùn)用origin軟件完成做圖、對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，以及結(jié)合譜圖和計(jì)算結(jié)果完成對(duì)反應(yīng)機(jī)理的探討，提高了學(xué)生的動(dòng)手能力和解決實(shí)際問題的能力。將教師科研課題引入到本科生教學(xué)中，讓學(xué)生了解到科學(xué)研究最終的目的是為了解決生活中的實(shí)際問題，使學(xué)生體會(huì)到學(xué)以致用的樂趣。