吳斌 崔漢青 張眉 邵春國(guó) 姜珊珊 郭霞 徐德坤 王升吉

摘要：借助高通量測(cè)序和生物學(xué)分析手段，篩選不同抗性品種間的差異表達(dá)miRNA，預(yù)測(cè)相關(guān)靶基因。對(duì)玉米抗、感粗縮病不同種質(zhì)材料高通量測(cè)序鑒定出的差異miRNA的靶基因，在Genome、Gene Ontology等生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，同時(shí)做GO（Gene Ontology，簡(jiǎn)稱GO）、京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，簡(jiǎn)稱KEGG）富集性分析。從某些相關(guān)差異miRNA的靶基因及其作用位點(diǎn)的有關(guān)GO ID及其生物學(xué)功能注釋中，發(fā)現(xiàn)一些可能與玉米粗縮病抗性有較大關(guān)系的miRNA，如zma-miR156a、zma-miR156k、zma-miR1432等;通過進(jìn)一步的miRNA靶基因KEGG富集性分析，獲得代謝通路ID，根據(jù)其生物功能注釋，推測(cè)也有一定數(shù)量的miRNA與玉米種質(zhì)抗（感）病相關(guān)。結(jié)合所涉差異miRNA在玉米抗、感種質(zhì)接毒前后上、下調(diào)的表現(xiàn)，對(duì)這些重要miRNA靶基因可能涉及粗縮病的致病機(jī)制或玉米抗性相關(guān)的GO ID、KEGG通路ID所蘊(yùn)含的功能進(jìn)行了詮釋。研究旨在探明抗病相關(guān)miRNA通過靶向作用其靶基因，在抗病過程中可能發(fā)揮的重要生物學(xué)功能和作用途徑，研究結(jié)果可為探討玉米抗粗縮病的抗病機(jī)制研究奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：玉米粗縮病;差異miRNA;高通量測(cè)序;靶基因;富集分析

中圖分類號(hào)：S435.13? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）20-0064-06

收稿日期：2021-02-11

基金項(xiàng)目：山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2018GSF121029）;國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2018YFD0200603）;山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)創(chuàng)新工程（編號(hào)：CXGC2016B11-綠色防控）。

作者簡(jiǎn)介：吳 斌（1986—），男，山東臨清人，博士，助理研究員，主要從事植物病毒學(xué)研究。E-mail：wubin228@126.com。

通信作者：王升吉，碩士，研究員，主要從事植物病毒學(xué)研究。E-mail：shjiw@163.com。

玉米粗縮病（maize rough dwarf virus，簡(jiǎn)稱MRDV）是玉米生產(chǎn)中一類重要的病害，嚴(yán)重影響了玉米生產(chǎn)[1]。該病由帶毒灰飛虱傳播病毒，在山東省，其主要毒原為水稻黑條矮縮病病毒（rice black-streaked dwarf virus，簡(jiǎn)稱RBSDV）[2-3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，種植抗病品種是防治該病的重要措施，因此，發(fā)掘玉米粗縮病抗性相關(guān)基因、微小核糖核酸（miRNA）或反式作用干擾小RNA（ta-siRNA）等，分析其功能進(jìn)而探究其抗病機(jī)制，可為抗病品種的遺傳改良提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

miRNA是真核生物體內(nèi)的一類負(fù)調(diào)控因子，在植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)和病害防御中具有重要作用[4]。病毒在侵染寄主植物的過程中能夠誘導(dǎo)大量miRNA產(chǎn)生，這些miRNA在病毒侵染時(shí)上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，通過抑制防衛(wèi)反應(yīng)中的負(fù)調(diào)控因子和促進(jìn)防衛(wèi)反應(yīng)中的正調(diào)控因子來行使功能。Wu等發(fā)現(xiàn)，水稻條紋病毒侵染水稻后，miR168與AGO18互作，調(diào)控水稻體內(nèi)AGO1的表達(dá)，進(jìn)而表現(xiàn)出抗病[5]。

本研究對(duì)RBSDV侵染不同抗性玉米品種所獲葉片、莖稈組織進(jìn)行miRNA高通量測(cè)序，對(duì)鑒定出的重要差異表達(dá)miRNA的靶基因開展GO、KEGG富集性分析，對(duì)其在玉米抗粗縮病中的生物學(xué)功能進(jìn)行闡述和討論，以期探究其在抗病過程中發(fā)揮的重要生物學(xué)功能和作用途徑，進(jìn)而為研究玉米抗粗縮病的抗病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

主要材料如下：玉米抗、感粗縮病品種分別為農(nóng)大108、鄭單958;感染水稻黑條矮縮病病毒（RBSDV）的水稻（或小麥）病株;人工養(yǎng)殖2～3齡的灰飛虱無毒若蟲;小麥易感病品種;健康水稻幼苗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 測(cè)序用玉米病株、健康株的獲得 該工作是通過人工接RBSDV方法完成的，主要包括以下幾個(gè)步驟：人工養(yǎng)殖繼代灰飛虱;2個(gè)玉米品種的盆栽播種;2、3齡灰飛虱若蟲從RBSDV病株上飼毒，并將度過循回期的帶毒灰飛虱接于1～2葉期的玉米幼苗上傳毒;將獲毒后的玉米幼苗移栽于大田中并生長(zhǎng)至喇叭口期，具體參見任春梅等的方法[6-7]。同期播種的玉米苗，保留足夠數(shù)量不接毒的幼苗，肥、水等生長(zhǎng)栽培管理同人工接毒苗。

1.2.2 miRNA高通量測(cè)序 待鄭單958玉米接毒株充分發(fā)病后，依照測(cè)序樣品分類信息（表1）進(jìn)行樣品采集，用液氮速凍、干冰保存等方式送至杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司進(jìn)行miRNA的文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序。

1.2.3 miRNA測(cè)序原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 測(cè)序獲得原始序列（raw reads）后，首先去除3′端接頭序列和垃圾序列，例如序列中有80%A/C/G/T、3N（不一定是連續(xù)的）序列，獲得凈化的序列（clean reads）;然后進(jìn)行長(zhǎng)度篩選，對(duì)于植物，保留堿基為18～25 nt 的序列;接著將剩余的序列與mRNA、RFam（含rRNA、tRNA、snRNA等）和Repbase數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，并進(jìn)行過濾，獲得有效序列（valid reads），去除重復(fù)序列，獲得單一原始序列和單一有效序列;對(duì)miRNA的長(zhǎng)度分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.4 miRNA差異表達(dá)分析 統(tǒng)計(jì)測(cè)序結(jié)果中各樣品miRNA的表達(dá)量，并進(jìn)行2個(gè)品種相同組織在接種病毒、未接種病毒處理間的比對(duì)，篩選差異表達(dá)miRNA的標(biāo)準(zhǔn)為差異倍數(shù)|log2 （fold change）|>2、P<0.05。

1.2.5 差異表達(dá)miRNA靶基因的預(yù)測(cè)及富集分析 借助Target Finder對(duì)差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，通過靶基因注釋對(duì)玉米miRNA靶基因在生物學(xué)功能上行使的生物學(xué)作用進(jìn)行分析。候選靶基因的注釋借助于Gene Ontology（簡(jiǎn)稱GO，http：//www.geneontology.org/）和Genome中的KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）數(shù)據(jù)庫(kù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 miRNA測(cè)序有效數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計(jì)

待8個(gè)玉米miRNA文庫(kù)通過高通量測(cè)序后，對(duì)每個(gè)文庫(kù)內(nèi)的全部小RNA片段進(jìn)行測(cè)序，獲得相應(yīng)的原始序列數(shù)。然后進(jìn)行長(zhǎng)度篩選，過濾掉堿基長(zhǎng)度小于18 nt、大于25 nt的序列，去除重復(fù)的miRNA序列，分別獲得有效序列、單一有效序列等，詳見表2。

2.2 miRNA的長(zhǎng)度分布

在對(duì)測(cè)序的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)的基礎(chǔ)上，對(duì)8個(gè)樣品文庫(kù)中過濾去重后的有效（valid）序列總數(shù)（total）以及種數(shù)（unique）進(jìn)行長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)其豐度主要集中于18～25 nt，且在24 nt處的序列豐度最大（圖1）。

2.3 差異miRNA的上下調(diào)統(tǒng)計(jì)分析

通過對(duì)抗、感粗縮病2個(gè)品種的相同組織在接種病毒、未接種病毒處理間進(jìn)行比對(duì)，并用TPM算法進(jìn)行歸一化處理，獲得幾個(gè)樣品比較組有上調(diào)、下調(diào)差異性表達(dá)的miRNA情況。從圖2可以看出，抗病品種農(nóng)大108接毒后，健康植株莖稈、葉片材料較接毒前健康植株的比較組（ChL1 vs nChL1，ChL1 vs nChL1）的差異miRNA下調(diào)數(shù)明顯較上調(diào)數(shù)多，而感病品種鄭單958接毒后病株miRNA較接毒前健康植株（CdL9 vs nChL9，CdS9 vs nChS9）的比較組則相反，其差異miRNA的上調(diào)數(shù)較下調(diào)數(shù)多，尤其在葉片材料中，這可能是玉米抗病品種抗病機(jī)制的一種表現(xiàn)。

2.4 差異表達(dá)miRNA的篩選

通過對(duì)8個(gè)文庫(kù)中的miRNA進(jìn)行歸一化分析，確認(rèn)相關(guān)miRNA的表達(dá)差異。由表3可以看出，zma-miR156a-5p、zma-miR1432-5p、zma-miR390a-5p、zma-miR156k-5p、zma-miR396f-3p、zma-miR166a-3p、zma-miR164f-5p、zma-miR167e-5p、zma-miR394a-5p等9個(gè)miRNA在感病品種鄭單958和耐病品種農(nóng)大108的葉片、莖稈組織中接毒前后表達(dá)趨勢(shì)相反，因此選擇這9個(gè)miRNA作為重要miRNA展開研究。

2.5 差異表達(dá)miRNA靶基因的GO分析

對(duì)篩選出的9個(gè)差異miRNA的靶基因與Genome、Gene Ontology等生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行GO富集性分析，發(fā)現(xiàn)差異miRNA的部分靶基因及其作用位點(diǎn)的生物學(xué)功能與玉米粗縮病抗性密切相關(guān)。其中，zma-miR156a-5p的部分靶基因與寄主對(duì)病原物的防御性反應(yīng)相關(guān)，zma-miR1432-5p的部分靶基因與病毒的加工、裝配有關(guān)，zma-miR390a-5p的部分靶基因與病毒粒子在寄主內(nèi)細(xì)胞間的傳輸有關(guān)，其他miRNA的靶基因也多參與寄主的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、免疫應(yīng)答的防衛(wèi)性反應(yīng)等（表4）。

2.6 差異表達(dá)miRNA靶基因KEGG分析

對(duì)篩選出的差異表達(dá)miRNA靶基因進(jìn)行KEGG富集性分析發(fā)現(xiàn)，部分通路可能與玉米種質(zhì)抗?。ù挚s?。┬韵嚓P(guān)。其中多個(gè)miRNA涉及的ko04626-植物病毒與植物寄主與病原間的相互作用、ko00130-泛醌及其他萜類醌的生物合成、ko04075-植物激素信號(hào)傳導(dǎo)、ko00280-泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用相關(guān)（表5）。對(duì)ko04626通路分析發(fā)現(xiàn)，靶基因通過調(diào)控RAR1、SGT1、HSP90等關(guān)鍵基因參與玉米與病原物的互作（圖3）。

3 結(jié)論與討論

當(dāng)前對(duì)于玉米粗縮病的研究多聚焦于致病機(jī)制方面，對(duì)于其抗病機(jī)制的研究相對(duì)較少。水稻黑條矮縮病病毒通過細(xì)胞外壁的傷口或昆蟲介體刺吸而造成微傷侵染玉米后，會(huì)引起寄主防御系統(tǒng)中相關(guān)基因表達(dá)、蛋白質(zhì)合成、激素水平及生物途徑的變化，使玉米生長(zhǎng)受阻、發(fā)育不良，最終導(dǎo)致發(fā)病甚至死亡[8-10]。在此期間，玉米抗、耐病品種被植物病毒侵染誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生大量的miRNA中，相關(guān)miRNA即可通過上調(diào)或者下調(diào)等模式，抑制防衛(wèi)反應(yīng)中的負(fù)調(diào)控因子或促進(jìn)防衛(wèi)反應(yīng)中的正向調(diào)控因子，進(jìn)而行使功能，可能是玉米抗耐病機(jī)制的一種表現(xiàn)[11]。本研究中涉及的zma-miR156、zma-miR1432、zma-miR390a-5p、zma-miR164f-5p等多個(gè)miRNA，均在受到RBSDV侵染脅迫后，在玉米抗、感病種質(zhì)材料中呈現(xiàn)相反的表達(dá)趨勢(shì)，且存在2種情況，部分在抗性材料（農(nóng)大108）中表現(xiàn)為上調(diào)，在感病材料（鄭單958）中表現(xiàn)為下調(diào)，另一種情況恰好相反，分析其原因，可能是miRNA的靶基因在抗病防御性反應(yīng)中的正、負(fù)調(diào)控機(jī)制差異所致。

此外，在本研究中，抗耐病品種農(nóng)大108接毒后，與接毒前相比，健康植株莖稈、葉片中差異miRNA下調(diào)數(shù)明顯較上調(diào)數(shù)多，與感病品種鄭單958在接毒后病株與接毒前健康植株比較的情況相反，可能是玉米抗、感品種分別受到粗縮病侵染脅迫時(shí)內(nèi)源miRNA自身反饋調(diào)節(jié)的一種真實(shí)體現(xiàn)。農(nóng)大108受到粗縮病病原侵染后，差異miRNA下調(diào)數(shù)多于上調(diào)數(shù)，可能由于miRNA所起作用的靶基因負(fù)調(diào)控作用機(jī)制相對(duì)較多，從而抑制了抗耐病品種植株發(fā)病，而感病品種鄭單958受到病毒侵染后，差異miRNA的上調(diào)數(shù)多于下調(diào)數(shù)，植物病毒在與寄主的互作中占據(jù)優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致寄主發(fā)病。

另有研究者分別對(duì)水稻與玉米miRNA及其靶基因?qū)τ衩状挚s病病毒的應(yīng)答通路進(jìn)行了研究[12-14]，結(jié)果顯示，一些miRNA家族及其靶基因在玉米與病毒互作中起著重要作用[14]。例如，與泛素有關(guān)（miR166a-3p等）的靶基因的表達(dá)受抑制，泛素合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生變化，表明泛素途徑在玉米抗粗縮病中起著重要作用。黃強(qiáng)的研究結(jié)果表明，RBSDV的侵染引起玉米中吲哚-3-乙酸（IAA）含量下降，玉米素核苷（ZR）相對(duì)保持不變，細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比值（C/A）升高，引起玉米頂端優(yōu)勢(shì)喪失，并導(dǎo)致細(xì)胞分化的紊亂，出現(xiàn)植株矮縮、脈突、心葉無法抽出等生長(zhǎng)畸形癥狀，粗縮病癥狀迅速表現(xiàn)，導(dǎo)致植株畸形生長(zhǎng)[9]。

此外，1種miRNA（例如miR156）可同時(shí)參與玉米的生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種功能，并在粗縮病脅迫響應(yīng)過程發(fā)揮重要作用[15-16]。分析其原因可能是玉米粗縮病誘導(dǎo)玉米體內(nèi)miRNA調(diào)控其靶基因參與信號(hào)傳導(dǎo)、抗氧化脅迫、自身反饋調(diào)節(jié)、抗病相關(guān)代謝等途徑[17-18]，各類抗病途徑共同構(gòu)建了玉米抗粗縮病脅迫的復(fù)雜的防御機(jī)制。

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