呂布 ，葉丙聰 ，周建聰 ，李曦 ，王愛民 ，顧志峰 *，鄭興

（1.海南大學(xué)海洋學(xué)院，海南 ?？?570228；2.海南大學(xué)南海海洋資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228）

大溪地等鞭金藻（Isochrysis galbana）是一種微小的金黃色金藻，其個(gè)體較小（直徑5 μm），且無細(xì)胞壁，其營養(yǎng)物質(zhì)豐富，富含多種不飽和脂肪酸和蛋白質(zhì)，并具有易被消化吸收等特點(diǎn)[1]。大溪地等鞭金藻作為海產(chǎn)雙殼動物幼蟲的理想餌料，已廣泛應(yīng)用于大珠母貝、扇貝、牡蠣和泥蚶等養(yǎng)殖，并被認(rèn)為是人工育苗的優(yōu)質(zhì)餌料[2-5]。在細(xì)巧華哲水蚤人工規(guī)模培養(yǎng)中，大溪地等鞭金藻也是其較優(yōu)餌料[6]。

大溪地等鞭金藻是微藻的一種，微藻中光合色素主要包括葉綠素和類胡蘿卜素，其具有吸收和傳遞光能的功能[7]，是細(xì)胞光合作用的主要參與者。光合色素的含量對微藻的碳、氮代謝十分重要，可直接影響微藻的生長發(fā)育及產(chǎn)量[8]。在微藻的培養(yǎng)中，培養(yǎng)條件影響著微藻的生長速度、高效擴(kuò)繁及活性物質(zhì)的積累[9]。養(yǎng)殖戶在室內(nèi)培養(yǎng)微藻的過程中，由于空間有限，影響其生長和繁育，同時(shí)室內(nèi)培養(yǎng)需要光照，在此過程中消耗大量的電力，因此，調(diào)整培養(yǎng)模式和條件對微藻的培育十分重要[10]。目前，室外條件下規(guī)模培養(yǎng)微藻具有極大的應(yīng)用價(jià)值[11]。掌握微藻的生長規(guī)律及最優(yōu)培養(yǎng)條件，對于提升微藻生長速度和擴(kuò)大產(chǎn)量有較大意義[12]?，F(xiàn)將大溪地等鞭金藻于室內(nèi)和室外條件下開展培養(yǎng)試驗(yàn)，對比分析其生長規(guī)律、光合色素含量、水分含量及灰分含量的差異，以探究最適培養(yǎng)條件，為大溪地等鞭金藻的開發(fā)利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

大溪地等鞭金藻取自海南大學(xué)海洋學(xué)院保種室。試驗(yàn)前對藻種進(jìn)行純化擴(kuò)培，提取快速生長期的藻液。使用過濾并滅菌的自然海水及“寧波3#”微藻培養(yǎng)液，海水的鹽度為30，培養(yǎng)基成分為ρ（NaNO3）=100 mg/L，ρ（NaH2PO4）=10 mg/L，ρ（FeSO4）=2.5 mg/L，ρ（MnSO4）=2.5 mg/L，ρ（EDTA－Na）=10 mg/L，ρ（維生素 B1）=6×10-3mg/L，ρ（維生素B12）=5×10-7mg/L[4]。

1.2 試驗(yàn)方法

包括室內(nèi)和室外兩種培養(yǎng)條件。其中室內(nèi)試驗(yàn)培養(yǎng)條件：溫度為（25±1）℃，光照強(qiáng)度為（119±1）μmol/（m2·s），光暗周期為12 h∶12 h；室外試驗(yàn)培養(yǎng)條件：溫度為（22±3）℃，光照強(qiáng)度為（442±94）μmol/（m2·s），光暗周期為12 h∶12 h。每種條件設(shè)置3 個(gè)平行培養(yǎng)組，于5 L 三角錐形瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，藻細(xì)胞接種密度為1.00×103cells/L，培養(yǎng)過程中不充氣，每天搖動幾次。以藻種與培養(yǎng)液充分混合后為時(shí)間起點(diǎn)，每隔24 h 取樣1 次，取樣前將培養(yǎng)瓶中的藻液搖勻，分別取3 個(gè)樣品檢測藻類密度、干重、濕重、灰分和色素含量。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

（1）藻細(xì)胞數(shù)目。采用血球計(jì)數(shù)板法測定[13]。

（2）藻細(xì)胞干重。烘干并預(yù)先稱量Whatman GF/C 膜的質(zhì)量，將20 mL 大溪地等鞭金藻的藻液于該膜過濾，經(jīng)過沖洗除營養(yǎng)鹽后，放入105 ℃烘箱中烘72 h 后稱取質(zhì)量，以前后兩次質(zhì)量差不超過2 mg為準(zhǔn)，通過烘干前后質(zhì)量的差值來計(jì)算干重[14]。

（3）水分含量。培養(yǎng)結(jié)束后，將20 mL 藻液通過Whatman GF/C 膜抽濾，于105 ℃烘箱中干燥至恒重，稱取質(zhì)量，直至前后兩次質(zhì)量差不超過2 mg，干燥后的質(zhì)量記為m1。同時(shí)，取20 mL 藻液4 000 r/min，離心10 min，收集藻細(xì)胞，樣品的質(zhì)量記為m2[14]。

（4）灰分含量。將Whatman GF/C 膜放在鋁箔杯中，置于105 ℃的烘箱中，烘干至恒重，記為M2；將20 mL 藻液通過Whatman GF/C 膜抽濾后，放入鋁箔杯于500 ℃的馬弗爐中烘干至恒重，記為M3。鋁箔杯的質(zhì)量記為M1[15]。

（5）葉綠素及類胡蘿卜素的測定。利用丙酮萃取法提取微藻的葉綠素[16-17]，將藻液于Whatman GF/C 膜上抽濾，離心，用分光光度計(jì)（島津UV-1700）分別測定在波長為 630，647，664，750 和 470 nm 處溶液的吸光度值并記錄，減去波長750 nm 下測得的吸光度值，得到校正后的各波長對應(yīng)的吸光光度值，并計(jì)算各色素的濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD），采用Microsoft Excel 2016 對數(shù)據(jù)處理，用DPS 14.5軟件進(jìn)行單因素方差分析，若有顯著差異，再進(jìn)行二因素方差分析，以P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果和分析

2.1 兩種培養(yǎng)條件對密度的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，在室內(nèi)培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)1~7 d，藻細(xì)胞密度隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而升高；在室外培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)1~10 d，藻細(xì)胞密度隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而升高；達(dá)到峰值后，兩種培養(yǎng)條件下的藻細(xì)胞密度均隨培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸降低并趨于平穩(wěn)。在室外培養(yǎng)條件下，藻細(xì)胞密度在第10 d 最高，為4.95×103cells/L，在室內(nèi)培養(yǎng)條件下，藻類密度在第7 d 最高，為3.48×103cells/L（圖1）。第8 d 開始，兩種培養(yǎng)條件下藻類細(xì)胞密度開始出現(xiàn)顯著差異（P<0.05），二因素方差分析結(jié)果顯示，室外培養(yǎng)條件下藻細(xì)胞密度顯著（P<0.05）高于室內(nèi)培養(yǎng)條件下。

圖1 兩種培養(yǎng)條件對大溪地等鞭金藻密度的影響

2.2 兩種培養(yǎng)條件對色素含量的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，在室內(nèi)培養(yǎng)條件下，葉綠素a、葉綠素c 和類胡蘿卜素經(jīng)過緩慢增長后快速達(dá)到最高濃度，然后逐漸降低：葉綠素a 在第7 d 達(dá)到最大質(zhì)量濃度，為0.44 mg/L；葉綠素c 在第2 d 達(dá)到最大質(zhì)量濃度，為 0.26 mg/L（圖2）；類胡蘿卜素在第7 d 達(dá)到最大質(zhì)量濃度，為5.91 mg/L（圖3）。在室外培養(yǎng)條件下，葉綠素a、葉綠素c 和類胡蘿卜素的變化趨勢與室內(nèi)條件類似：葉綠素a 在第11 d 達(dá)到最大質(zhì)量濃度，為 0.78 mg/L；葉綠素c 在第11 d 達(dá)到最大質(zhì)量濃度，為0.28 mg/L；類胡蘿卜素在第11 d達(dá)到最大質(zhì)量濃度，為14.15 mg/L。

圖2 兩種培養(yǎng)條件對大溪地等鞭金藻葉綠素的影響

圖3 兩種培養(yǎng)條件對大溪地等鞭金藻類胡蘿卜素的影響

兩種培養(yǎng)條件下，葉綠素a 質(zhì)量濃度從第4 d開始出現(xiàn)極顯著差異（P<0.01），葉綠素c 質(zhì)量濃度從第11 d 起開始出現(xiàn)極顯著差異（P<0.01），類胡蘿卜素質(zhì)量濃度從第3 d 開始出現(xiàn)極顯著差異（P<0.01）。二因素方差分析表明，不同培養(yǎng)條件對于葉綠素a 具有極顯著的影響（P<0.01），而培養(yǎng)時(shí)間無顯著影響（P>0.05）；不同培養(yǎng)條件和時(shí)間對葉綠素c 均具有顯著的影響（P<0.05）；不同培養(yǎng)條件對于類胡蘿卜素具有極顯著的影響（P<0.01），而培養(yǎng)時(shí)間無顯著影響（P>0.05）。在室外培養(yǎng)條件下，葉綠素a 和類胡蘿卜素質(zhì)量濃度均顯著（P<0.05）高于室內(nèi)培養(yǎng)條件。

2.3 兩種培養(yǎng)條件對水分和灰分含量的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，大溪地等鞭金藻水分含量和灰分含量的變化趨勢相似，其中在室內(nèi)培養(yǎng)條件下，大溪地等鞭金藻水分含量最大值為95.11%，灰分含量最大值為70.57%；在室外培養(yǎng)條件下，水分含量最大值為95.53%，灰分含量最大值為82.57%；在兩種培養(yǎng)條件下灰分含量具有顯著性差異（P<0.05）（圖4 和圖5）。二因素方差分析結(jié)果顯示，培養(yǎng)時(shí)間對大溪地等鞭金藻的水分含量和灰分含量具有極顯著的影響（P<0.01），不同培養(yǎng)條件對大溪地等鞭金藻的水分含量無顯著影響（P>0.05），對于灰分含量有顯著的影響（P<0.05）。

圖4 兩種培養(yǎng)條件對大溪地等鞭金藻水分含量的影響

圖5 兩種培養(yǎng)條件對大溪地等鞭金藻灰分含量的影響

2.4 兩種培養(yǎng)條件對培養(yǎng)基pH 值的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，在室內(nèi)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)基的pH 值為7.1~8.7，在室外培養(yǎng)條件下培養(yǎng)基的pH值為9~9.6，其中在室外條件下培養(yǎng)基pH 值升高的幅度較大（圖6）。從第3 d 開始，在兩種培養(yǎng)條件下培養(yǎng)基pH 值開始出現(xiàn)顯著差異（P<0.05）。二因素方差分析結(jié)果顯示，培養(yǎng)時(shí)間對培養(yǎng)基pH 值無顯著影響（P>0.05），培養(yǎng)條件對培養(yǎng)基pH 值有極顯著的影響（P<0.01）。

圖6 兩種培養(yǎng)條件對大溪地等鞭金藻培養(yǎng)基pH 值的影響

3 討論

研究顯示，與室內(nèi)嚴(yán)格的培養(yǎng)條件相比，室外培養(yǎng)條件的變化大，具有不確定性，室外培養(yǎng)條件對微藻細(xì)胞的適應(yīng)能力提出了更高的要求。由于室內(nèi)外的環(huán)境不同，導(dǎo)致培養(yǎng)條件和污染程度各不相同，藻細(xì)胞在生長方面也表現(xiàn)出了不同的規(guī)律。在室外培養(yǎng)條件下，藻細(xì)胞的生長環(huán)境較室內(nèi)惡劣，盡管在室外培養(yǎng)條件下培養(yǎng)基的pH 值變化較小，但是與室內(nèi)條件下存在極顯著差異（P<0.01），且室外溫度的變化也較明顯。室外培養(yǎng)條件下藻細(xì)胞密度顯著（P<0.05）高于室內(nèi)培養(yǎng)條件。柳敏海等[4]研究顯示，大溪地金藻適宜生長溫度為10~35 ℃，其適合作為在高溫季節(jié)的育苗餌料。在室外培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)中的部分藻細(xì)胞密度有所下降，可能與當(dāng)天降雨溫度和光照變化相關(guān)。本研究中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，培養(yǎng)液中積累的有機(jī)成分增多，藻液更有利于雜藻和細(xì)菌的生長，其種類和數(shù)量增加，遠(yuǎn)超過了接種初期，這可能也是第10 d 以后藻細(xì)胞密度開始下降的重要原因。戴俊彪等[18]研究指出，過強(qiáng)的光照也可能是室外培養(yǎng)條件下球等鞭金藻生長緩慢的原因，當(dāng)光照強(qiáng)度為（442±94）μmol/（m2·s）時(shí)，大溪地等鞭金藻生長得更好，其密度遠(yuǎn)高于球等鞭金藻，相較而言，大溪地等鞭金藻適合作為高溫季節(jié)的戶外餌料。目前，大溪地等鞭金藻在室外條件下進(jìn)行培養(yǎng)的研究較少，本研究中其對室外培養(yǎng)條件表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)性，生長和繁殖速度較室內(nèi)培養(yǎng)條件下快，因此認(rèn)為大溪地等鞭金藻有一定承污能力，經(jīng)進(jìn)一步培養(yǎng)優(yōu)化后，大溪地等鞭金藻的大規(guī)模室外培養(yǎng)具有一定的可行性。

大溪地等鞭金藻屬于光合自養(yǎng)型單胞藻，光照是其生長的關(guān)鍵因素。一般而言，細(xì)胞光合速率決定了藻類生長速度，而光合速率又取決于光合色素的含量，因此光合色素含量變化能反映大溪地等鞭金藻生長發(fā)育情況[19]。研究中，在室外培養(yǎng)條件下，大溪地等鞭金藻葉綠素a、葉綠素c 和類胡蘿卜素的最大質(zhì)量濃度分別為0.78，0.26 和14.15 mg/L，其葉綠素a、葉綠素c 質(zhì)量濃度遠(yuǎn)低于湛江等鞭金藻，類胡蘿卜素質(zhì)量濃度則更高[20]。出現(xiàn)該結(jié)果一方面可能是因?yàn)榇笙氐缺藿鹪迦~綠素a 含量較低時(shí)，其將吸收的光能主要用于藻細(xì)胞數(shù)量的增加、生物質(zhì)和類胡蘿卜素的積累以及必須組分的合成，光合色素可滿足光能的吸收，因此不需要進(jìn)行色素的累積[21]；另一方面可能是因?yàn)槭覂?nèi)光照強(qiáng)度比室外低，此外試驗(yàn)采用搖瓶不充氣的方式，也可能因?yàn)槠貧獠怀浞?，使大溪地等鞭金藻的空間位置在較長時(shí)間內(nèi)沒有充分置換，進(jìn)而降低了光能的利用，今后在擴(kuò)大培養(yǎng)中可通過補(bǔ)充CO2進(jìn)行改良。在室內(nèi)培養(yǎng)條件下大溪地等鞭金藻灰分含量顯著（P<0.05）低于室外條件下，該結(jié)果表明，室外培養(yǎng)條件更利于大溪地等鞭金藻有機(jī)物的積累。

4 結(jié)論

研究認(rèn)為，大溪地等鞭金藻具有耐高溫和耐強(qiáng)光的特性，適宜在室外條件下培養(yǎng)，因此，該藻作為優(yōu)質(zhì)餌料生物在室外規(guī)模化培養(yǎng)方面具有一定的可行性。此外室外培養(yǎng)可減少成本投入，提高效益，具有廣闊的應(yīng)用前景。pH 值、溫度和光照作為影響大溪地等鞭金藻的3 個(gè)重要環(huán)境因子，其中光照在很大程度上影響著藻細(xì)胞的生長。后期可進(jìn)一步開展光照強(qiáng)度對藻細(xì)胞生化成分的影響研究，進(jìn)一步推動大溪地等鞭金藻的室外規(guī)模化養(yǎng)殖，更好地為水生動物養(yǎng)殖提供優(yōu)質(zhì)餌料。