郭順萍 ，張亞麗 ，尚學峰 ，李 杰 ，黃曉宇 ，2*，楊巧麗 ，2，滾雙寶 ，2

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省現(xiàn)代養(yǎng)豬工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730070）

我國一直以來都是農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)業(yè)資源豐富，品種齊全，為我國農(nóng)業(yè)發(fā)展提供了堅實的基礎。近年來，學者們關注到花椒籽作為農(nóng)作物花椒的副產(chǎn)物之一具有很高的利用價值。研究發(fā)現(xiàn)，花椒籽可應用于營養(yǎng)保健品、生物柴油、緩蝕劑、涂料[1]、花椒籽黑色素、保鮮劑、抗菌肽、膳食纖維以及動物飼料[2]等領域。馬養(yǎng)民等[3]通過對花椒籽油脂肪酸組分分析，發(fā)現(xiàn)花椒籽不飽和脂肪酸高達78.4%，其中必需脂肪酸亞油酸和α–亞麻酸占47.56%。姚林杰等[4]試驗分析得出，花椒籽中蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸的含量較高，營養(yǎng)價值豐富，作為飼料加入到動物飼糧中，不僅可以達到補充能量和節(jié)約蛋白的目的，還可以節(jié)約飼料成本，提高經(jīng)濟效益，所以花椒籽的開發(fā)研究對養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展至關重要。

目前，花椒籽在家禽養(yǎng)殖、水產(chǎn)養(yǎng)殖和育肥豬養(yǎng)殖等方面都有涉及，但都是初步研究，沒有廣泛應用。侯玉潔等[5]研究認為花椒籽對家禽生長發(fā)育有促進作用，能顯著提高家禽的生產(chǎn)性能、增強免疫力、改善胴體品質(zhì)、降低飼料成本，顯著提高經(jīng)濟效益。付興周等[6]研究表明，用花椒籽粉飼喂肉雞，可顯著提高肉雞的平均日增重，降低料重比，顯著提高肉雞的生長性能，花椒籽粉的芳香、辛麻特性可刺激肉雞的食欲，提高其機體免疫力，加速肉雞生長。楊克[7]研究發(fā)現(xiàn)，在鯉魚飼料中添加7.5%的花椒籽粉時會大大降低其生長性能，而添加5%的花椒籽粉會降低飼料成本，且對鯉魚的生長性能沒有負面影響；梁永飛等[8]試驗研究了在基礎飼糧中添加不同比例的花椒籽代替玉米對生長育肥豬的生長性能、肉品質(zhì)和背最長肌的影響，結果表明，5%花椒籽替代玉米不僅可以提高育肥豬的生長性能，還能顯著改善背最長肌的脂肪酸組成，改善豬肉品質(zhì)。在此基礎上，本試驗通過HE染色方法測量了添加5%花椒籽替代玉米對生長育肥豬的小腸組織（十二指腸、空腸、回腸）的絨毛高度、隱窩深度、絨毛寬度和腸壁厚度的影響，并分析了小腸組織形態(tài)的變化，探究5%花椒籽替代玉米對生長育肥豬小腸組織（回腸、空腸、十二指腸）形態(tài)結構的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

選擇90日齡、體重33 kg的健康杜×（長h大）三元雜交豬144頭，隨機分成2組，每組設4個重復，每個重復18頭試驗豬只。預試期7 d后，正試期100 d。試驗豬正常飲水和飲食。試驗在臨夏州眾惠豬業(yè)科技有限公司進行[8]。試驗以飼喂5%花椒籽替代基礎飼糧中玉米作為試驗組，飼喂基礎飼糧作為對照組，100 d時采集對照組與試驗組的小腸組織樣品進行對比分析。

1.1.2 試劑耗材

1.1.3 試驗器材

載玻片、蓋玻片、切片盒、組織包埋盒、刀片、高效切片石蠟、轉輪式切片機、JT-12S自動組織脫水機、BMJ-A型包埋機、RS36型全自動染色機、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀、數(shù)字切片掃描儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣本采集

試驗結束后，分別采集對照組和添加5%花椒籽飼喂的杜×（長h大）三元雜交育肥豬（各6頭）的小腸（回腸、空腸和十二指腸）組織片段，并立即保存于10%標準甲醛固定液，保持小腸（回腸、空腸和十二指腸）組織形態(tài)完好。

1.2.2 制作組織切片

1）脫水：固定組織經(jīng)全自動脫水機脫水，脫水酒精濃度及脫水時間見表1。

表1 脫水酒精濃度及脫水時間 h

2）透明：將經(jīng)脫水處理的組織塊浸入二甲苯（透明劑）溶液中浸泡 10 min，再將組織塊取出再次浸入二甲苯溶液中10 min進行透明。

3）包埋：透明處理后，立即將組織塊投入到預先融化的石蠟液中，58 ℃浸漬1 h、2 h、3 h，待石蠟完全包埋組織塊后，迅速夾取組織塊置于提前準備好的、預熱的金屬模具中，并倒入浸沒組織塊的石蠟液進行冷卻。

我們本該明白教育應做什么：智育是要發(fā)展好奇心和理性思考的能力，而不是灌輸知識；德育是要鼓勵崇高的精神追求，而不是鼓吹規(guī)范；美育是要培育豐富的靈魂，而不是傳授技藝。

4）切片：待包埋石蠟的組織塊完全冷卻變硬后，小心從模具中取出包埋塊，并置于切片機上切片，切片厚度以4～5 μm為宜。

1.2.3 HE常規(guī)染色

1）脫蠟、復水：將組織切片依次經(jīng)過以下溶液脫蠟復水，處理溶液及時間見表2。

表2 脫蠟、復水處理溶液及所需時間 min

2）染色：實驗采用 H.E 染色方法，選用蘇木精-伊紅染色劑，在 35 ℃條件下，將脫蠟后的組織切片按照HE常規(guī)染色進行染色。如表3所示。

表3 HE染色處理溶液及所需時間

1.2.4 封片

將切片從二甲苯中取出稍微晾干，然后滴加中性樹膠封片（取中性樹膠滴入載玻片的組織上，取蓋玻片從一端逐步蓋下，避免產(chǎn)生氣泡），最后利用顯微鏡進行鏡檢，觀察組織形態(tài)上發(fā)生的改變。

1.2.5 圖像采集及測量

采用濟南丹吉爾電子有限公司生產(chǎn)的pannoramic 250型全景數(shù)字幻燈片掃描儀對切片進行圖像采集，采集圖像時先在低倍鏡下觀察全部組織，然后再選擇要觀察的區(qū)域在40倍鏡下采集圖片。用Caseviewer圖像分析軟件Annotation中的Draw an open polygon測量工具對各組織的絨毛高度、隱窩深度、絨毛寬度、腸壁厚度進行測量并記錄。

1.2.6 數(shù)據(jù)整理與分析

試驗共測量小腸組織（空腸、回腸、十二指腸）的絨毛高度、隱窩深度、絨毛寬度和腸壁厚度四個指標，將所測得的數(shù)據(jù)整理到Excel表格中，計算絨毛高度與隱窩深度的比值；再用SPSS26.0中的單因子方差分析和獨立樣本t檢驗對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，檢驗各組間的差異顯著性，結果表示為平均值f標準誤。

2 結果與分析

2.1 花椒籽對回腸組織形態(tài)的影響

由表4和圖1可知，試驗組與對照組的回腸組織絨毛高度、隱窩深度、腸壁厚度和絨隱比均存在顯著差異（P＜0.05），而絨毛寬度無顯著差異（P＞0.05）；試驗組的絨毛高度為542.91 μm，顯著高于對照組的370.39 μm ，隱窩深度為214.37 μm，顯著低于對照組的515.15 μm，絨隱比為2.59，顯著高于對照0.80。試驗結果表明，在飼糧中添加5%花椒籽可以顯著增加回腸絨毛高度、降低隱窩深度。

表4 試驗組與對照組回腸組織測量結果 μm

圖1 試驗組與對照組回腸組織切片結果

2.2 花椒籽對空腸組織形態(tài)的影響

由表5和圖2可知，試驗組與對照組生長育肥豬的空腸腸壁厚度存在顯著差異（P＜0.05），絨毛高度、隱窩深度、絨毛寬度和絨隱比均無顯著差異（P＞0.05），添加5%花椒籽的腸壁厚度為448.35μm，顯著高于對照組325.94 μm。試驗表明，飼糧中添加5%花椒籽可以顯著增加空腸的腸壁厚度，從而加強空腸的消化吸收能力。

圖2 試驗組與對照組空腸組織切片結果

表5 試驗組與對照組空腸組織測量結果 μm

2.3 花椒籽對十二指腸組織形態(tài)的影響

由表6和圖3可知，試驗組與對照組的十二指腸的隱窩深度、絨毛寬度和絨隱比存在顯著差異（P＜0.05），絨毛高度和腸壁厚度無顯著差異（P＞0.05）；添加5%花椒籽的隱窩深度347.69 μm，顯著高于對照258.14 μm，絨毛寬度為94.01 μm，顯著低于對照177.75 μm，絨隱比值為1.20，顯著低于對照1.56。試驗表明，飼糧中添加5%花椒籽可以顯著增加十二指腸的隱窩深度，降低絨毛寬度和絨隱比。

圖3 試驗組與對照組十二指腸組織切片結果

表6 試驗組與對照組十二指腸測量結果 μm

3 討論

花椒樹作為一種我國本土常綠植物，在我國普遍種植，花椒籽作為花椒的主要副產(chǎn)物，占花椒總量的60%左右，是一種含油量和蛋白質(zhì)資源非常豐富的作物[9]?；ń烦吮娝苤目梢杂米髡{(diào)味品之外，《本草綱目》中還記載其可以作藥用，可用于治療腹痛、感冒、嘔吐、腹瀉和濕疹，對一些作物害蟲有麻痹、驅逐、預防的作用。花椒樹側根發(fā)達，形成復雜的網(wǎng)狀根系，可以發(fā)揮防風固壩和防止水土流失的作用[10]。黃鵬等報道[2]、付興周等[6]的試驗研究表明，花椒籽粉可以提高肉雞的生產(chǎn)性能、免疫器官指數(shù)、改善肉品質(zhì)，因此花椒籽粉可以直接用作飼料添加劑。

小腸作為消化系統(tǒng)的重要組成部分，其絨毛高度、隱窩深度、絨毛寬度、腸壁厚度是衡量消化能力的重要指標。絨毛高度與隱窩深度的比值能更加直觀地體現(xiàn)小腸組織的消化吸收能力，絨隱比下降，意味著消化能力降低，同時會產(chǎn)生腹瀉等病癥現(xiàn)象，嚴重時會使動物的正常生長發(fā)育受到損害；絨隱比上升，意味著消化能力增強，可明顯減少動物腹瀉現(xiàn)象，促進動物正常的生長發(fā)育[11]。小腸正常的絨毛結構有利于豬只營養(yǎng)物質(zhì)的消化，絨毛越寬越高，絨毛密度越大，保證腸道的有效利用表面積；腸道隱窩是腸道細胞繁殖分裂最活躍的組織，隱窩深度反映了小腸上皮的更新速度，隱窩深度變淺意味著上皮細胞成熟率上升，分泌功能增加[12]。這與王子旭[13]、劉秋東[14]、雷麗[15]等的報道一致，絨毛高度和絨毛寬度增加，會增加小腸組織的腸道表面積，從而提高腸道組織的消化吸收能力，而隱窩深度與小腸上皮絨毛細胞有關，隱窩深度越淺，消化能力越強。Kim等[16]發(fā)現(xiàn)在小鼠日糧中添加5%菊粉后其回腸絨毛顯著加長，有效改善回腸組織形態(tài)；Mathlouthi等[17]報道飼喂黑麥日糧的肉仔雞，其回腸絨毛高度、絨毛寬度和表面積均會下降，添加木聚糖酶可以改善回腸絨毛形態(tài)，并提高絨隱比。利凱等[18]研究表明，斷奶仔豬腹瀉和體重下降的主要原因是小腸絨毛高度、絨毛寬度和腸壁厚度降低，添加復方中藥豬痢停后，小腸組織的絨毛高度、絨毛寬度和腸壁厚度明顯升高，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，明顯改善腸道組織，減少斷奶仔豬腹瀉的發(fā)生，增加斷奶仔豬的體重。John等[19]研究表明，斷奶仔豬飼喂豆粕飼料會提高絨毛高度，改善絨毛結構，促進消化吸收；鮑偉光等[20]的試驗結果表明，在飼料中添加硫辛酸，可以有效增加空腸和十二指腸的絨毛高度；吳維達等[21]試驗結果表明，將菊粉添加到豬只日糧中，可以使其回腸和十二指腸的絨毛高度增加，隱窩深度降低，絨隱比提高，有效改善了十二指腸和回腸的組織形態(tài)結構。

本試驗中，采用單因素分析和獨立樣本t檢驗的統(tǒng)計學分析方法，通過HE染色方法，對生長育肥豬的小腸組織（回腸、空腸和十二指腸）的絨毛高度、絨毛寬度、隱窩深度、腸壁厚度和絨隱比進行了測量計算并分析，結果顯示，在生豬育肥豬飼糧中添加5%花椒籽替代玉米，可以使其回腸的絨毛高度和絨隱比顯著增加；空腸的絨毛高度、絨毛寬度、隱窩深度等指標無顯著變化，但腸壁厚度顯著增加；與上述研究結果基本一致。

4 結論

綜上所述，本試驗研究表明，在生長育肥豬飼糧中添加5%的花椒籽代替玉米，可以顯著提高其回腸的絨毛高度和腸壁厚度，降低隱窩深度，提高絨隱比，增加空腸的腸壁厚度，提高十二指腸的絨隱比。由此可見花椒籽可能具有促進豬只消化吸收的功能。