劉項(xiàng)峰，謝 璽，陳 微,2，朱守維，滕煒鳴，李大成，李曉東，王慶志

( 1.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，大連市海產(chǎn)貝類(lèi)種質(zhì)資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023； 2.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023； 3.錦州市科學(xué)技術(shù)研究院，遼寧 錦州 121000； 4.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866 )

四角蛤蜊(Mactraveneriformis)俗稱(chēng)白蜆子、白蚶子，屬軟體動(dòng)物門(mén)、雙殼綱、真瓣鰓目、蛤蜊科、蛤蜊屬，營(yíng)底棲生活，廣泛分布于中國(guó)、韓國(guó)及日本沿海的潮間帶中、低潮區(qū)及淺海泥沙灘，肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美[1]。在遼寧沿海潮間帶，四角蛤蜊自然資源分布面積達(dá)到1.1×104hm2，占遼寧潮間帶貝類(lèi)資源分布總面積的28.3%，居灘涂貝類(lèi)之首，資源量約8×104t[2]。遼河口海域?yàn)┩控愵?lèi)資源豐富，盛產(chǎn)四角蛤蜊、文蛤(Meretrixmeretrix)、光滑河籃蛤(Potamocorbulalaevis)、毛蚶(Scapharcasubcrenata)等雙殼貝類(lèi)。2009—2010年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，遼河口海域四角蛤蜊資源量約3.8萬(wàn)t[3]。近年來(lái)，由于各種原因，四角蛤蜊資源量在不同年份常出現(xiàn)較大波動(dòng)，查明該海域四角蛤蜊的繁殖生物學(xué)特性，可為保護(hù)與開(kāi)發(fā)遼河口海域的四角蛤蜊資源提供有益參考。

關(guān)于海產(chǎn)雙殼貝類(lèi)繁殖周期的研究報(bào)道較多，如波紋巴非蛤(Paratapesundulatus)[4]、鈍綴錦蛤(Tapesdorsatus)[5]、櫛江珧(Atrinapectinata)[6]、青蛤(Cyclinasinensis)[7]、長(zhǎng)牡蠣(Crassostreagigas)[8]、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[9]等種類(lèi)均有相關(guān)報(bào)道。關(guān)于四角蛤蜊生殖周期的研究，有對(duì)山東北部沿海四角蛤蜊性腺發(fā)育年周期的研究[10]、韓國(guó)群山沿海四角蛤蜊繁殖周期的研究[11]及東京灣四角蛤蜊繁殖周期的研究[12-13]。海產(chǎn)雙殼貝類(lèi)通常不易精確統(tǒng)計(jì)其確切的產(chǎn)卵次數(shù)，通常只能以一年中的產(chǎn)卵高峰期進(jìn)行界定，且與其生境息息相關(guān)。遼河口海域受地理位置和氣候等因素影響，與上述報(bào)道生境差異較大，但相關(guān)報(bào)道較少，僅見(jiàn)項(xiàng)福椿[14]對(duì)四角蛤蜊性腺的外觀(guān)觀(guān)察，對(duì)遼寧沿海四角蛤蜊的性腺發(fā)育進(jìn)行粗略的分期。筆者對(duì)遼河口海域四角蛤蜊的條件指數(shù)、性腺發(fā)育周期與性比等繁殖生物學(xué)特征進(jìn)行深入研究，以期為四角蛤蜊的人工繁育與資源養(yǎng)護(hù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 采樣地點(diǎn)與方法

試驗(yàn)樣品采自遼寧省盤(pán)錦市大洼縣二界溝鎮(zhèn)西南遼河口南部海域。2018年3—10月，每月現(xiàn)場(chǎng)采樣一次，同時(shí)利用YSI6920水質(zhì)分析儀測(cè)量水溫、鹽度與葉綠素a。隨機(jī)收集80～100枚四角蛤蜊樣品，低溫保存運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析。

1.2 條件指數(shù)

每月取30枚四角蛤蜊樣品進(jìn)行解剖，分離軟體部與貝殼，105 ℃烘干至恒等質(zhì)量，分別稱(chēng)取軟體部與貝殼干質(zhì)量(精確至0.01 g)，計(jì)算條件指數(shù)(軟體部干質(zhì)量占貝殼干質(zhì)量的百分比[15])。

1.3 組織學(xué)分析

每月取30～40枚四角蛤蜊樣品進(jìn)行解剖，在性腺組織上切取邊長(zhǎng)5 mm方形組織塊，放入波恩氏液中固定24 h后轉(zhuǎn)移至70%體積分?jǐn)?shù)乙醇中儲(chǔ)存。梯度乙醇脫水、石蠟滲透包埋，進(jìn)行切片(5～6 μm)，蘇木精—伊紅染色，中性樹(shù)脂封片。光學(xué)顯微鏡下鏡檢，辨別性別與性腺發(fā)育程度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件，對(duì)條件指數(shù)月間差異顯著性進(jìn)行單因素方差分析，對(duì)性比進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 環(huán)境因子變化

取樣海區(qū)的海水溫度、鹽度及葉綠素a質(zhì)量濃度月間變化見(jiàn)圖1。水溫季節(jié)性變化明顯，在試驗(yàn)周期內(nèi)，3月水溫最低，為2.0 ℃。隨著春、夏季的到來(lái)及氣溫的升高，水溫持續(xù)升高，8月水溫達(dá)到高峰，為26.40 ℃，秋季水溫下降。鹽度季節(jié)性變化明顯，春季為枯水期，鹽度較高，3月鹽度最高，為31.6；

圖1 取樣海區(qū)水溫、鹽度及葉綠素a質(zhì)量濃度月度變化Fig.1 Monthly variations in water temperature, salinity and chlorophyll a concentration in the survey area

夏、秋季隨著遼河淡水大量進(jìn)入，鹽度降低，7月最低，為27.0；隨著秋、冬季枯水期到來(lái)，鹽度又逐漸升高。葉綠素a質(zhì)量濃度有2個(gè)高峰期，分別為6月(4.63 μg/L)和10月(4.86 μg/L)。

2.2 樣品殼長(zhǎng)、殼高與濕質(zhì)量

全年采集樣品平均殼長(zhǎng)(34.73±1.89) mm，平均殼高(31.88±1.97) mm，平均濕質(zhì)量(15.17±3.18) g(表1)。

表1 四角蛤蜊月平均殼長(zhǎng)、殼高與濕質(zhì)量

2.3 繁殖周期

2.3.1 條件指數(shù)

條件指數(shù)在6月最低，為8.66，3—6月維持相對(duì)穩(wěn)定，7月開(kāi)始顯著增高，到9月達(dá)到峰值，為14.43，10月又降至10.30(圖2)。

圖2 四角蛤蜊各月干殼質(zhì)量、軟體部干質(zhì)量及條件指數(shù) Fig.2 Monthly values of dry shell weight, dry soft part weight and the condition index of clam M. veneriformis不同字母表示組間差異顯著 (P<0.05).Different letters show the significant difference between groups (P<0.05).

2.3.2 性腺發(fā)育周期

參考文獻(xiàn)[9]對(duì)海產(chǎn)雙殼貝類(lèi)性腺發(fā)育各期特點(diǎn)的描述，將四角蛤蜊性腺發(fā)育過(guò)程分為6期(圖3、圖4)：

休止期：生殖細(xì)胞未發(fā)育，無(wú)法分辨性別。

形成期(2—4月、7月)：兩性性腺開(kāi)始發(fā)育；雌性?xún)H在濾泡壁上可見(jiàn)剛剛發(fā)育的卵，卵很小 (圖3a)；雄性在濾泡壁上出現(xiàn)分層的精原細(xì)胞，數(shù)量逐漸增加并且逐漸有精母細(xì)胞產(chǎn)生，無(wú)精細(xì)胞或精子(圖4a)。

圖3 雌性四角蛤蜊性腺發(fā)育分期Fig.3 Gonadal developmental stages for female clam M. veneriformisa.形成期；b～c.增殖期；d.成熟期；e.排放期；f.耗盡期.a.early developing; b—c.late developing; d.ripe; e.spawning; f.spent.

增殖期(3—5月、7—8月)：兩性性腺加速發(fā)育；雌性在濾泡腔中可見(jiàn)成熟卵子，但數(shù)量較少，多數(shù)卵子依靠短柄附著于濾泡壁上(圖3b～c)；雄性濾泡中同時(shí)存在精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精細(xì)胞和精子 (圖4b～c)。

成熟期(4—6月、8—9月)：兩性性腺體積增大，生殖細(xì)胞大量成熟；雌性在濾泡腔內(nèi)充滿(mǎn)大量成熟卵子，濾泡壁薄(圖3d)；雄性在濾泡腔內(nèi)充滿(mǎn)大量成熟精子 (圖4d)。

圖4 雄性四角蛤蜊性腺發(fā)育分期Fig.4 Gonadal developmental stages for male M. veneriformisa.形成期； b～c.增殖期； d.成熟期； e.排放期； f.耗盡期.a.early developing; b—c.late developing; d.ripe; e.spawning; f.spent.

排放期(5—7月、10月)：兩性生殖細(xì)胞開(kāi)始排放；雌性濾泡內(nèi)游離卵子的數(shù)量減少，濾泡壁破裂(圖3e)；雄性在濾泡中成熟精子占比巨大，并因精子排放而出現(xiàn)空腔(圖4e)。

耗盡期(7—8月、11月)：兩性性腺的濾泡破裂、分散，發(fā)生吞噬作用；雌性?xún)H有少量卵子殘留 (圖3f)；雄性殘留少量精子(圖4f)。

2.3.3 性比

共采集四角蛤蜊樣本712個(gè)，其中41.43%為雌性，46.49%為雄性，1.41%無(wú)法分辨性別，10.67%為雌雄同體。雌雄同體表現(xiàn)為雄性生殖腺混有少量雌性生殖細(xì)胞或?yàn)V泡的雌性化特征。性比1∶1.12，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，與期望值(1∶1)差異不顯著(χ2=1.014；df=1；P>0.05)(圖5)。

圖5 四角蛤蜊性別百分比Fig.5 Proportions of males, females, androgynies and undifferentiated individuals of clam M. veneriformis

3 討 論

3.1 環(huán)境因子與繁殖周期的關(guān)系

海洋雙殼貝類(lèi)廣泛分布于世界各地，棲息環(huán)境也各不相同，因此其應(yīng)對(duì)自身?xiàng)h(huán)境所選擇的繁殖策略也各不相同。Taylor等[16-18]研究指出，溫度和餌料對(duì)貝類(lèi)繁殖影響最大。適宜的溫度和充足的食物是四角蛤蜊進(jìn)行繁殖活動(dòng)的必要條件[10]。本試驗(yàn)中，在3月水溫最低的時(shí)候，葉綠素a質(zhì)量濃度較高，四角蛤蜊開(kāi)始進(jìn)行配子發(fā)生，隨著溫度升高，雌、雄配子逐漸發(fā)育成熟，此時(shí)，水體中葉綠素a質(zhì)量濃度也在逐漸升高；在5—6月，成熟的精子和卵子大量排放，而水體中葉綠素a質(zhì)量濃度達(dá)到一年中的第一個(gè)高峰，水溫達(dá)21 ℃，此時(shí)環(huán)境因子有利于胚胎的發(fā)育和幼體存活；7月開(kāi)始，水溫繼續(xù)升高，葉綠素a質(zhì)量濃度持續(xù)下降，四角蛤蜊開(kāi)始進(jìn)入快速恢復(fù)期，在10月水溫降至15～20 ℃，葉綠素a質(zhì)量濃度上升并達(dá)到第二個(gè)高峰時(shí)，一部分四角蛤蜊第二次排放配子。

3.2 條件指數(shù)

條件指數(shù)一般在貝類(lèi)繁殖生物學(xué)研究領(lǐng)域用來(lái)評(píng)定貝類(lèi)的成熟度。Kang等[8]報(bào)道，條件指數(shù)與長(zhǎng)牡蠣的性腺發(fā)育密切相關(guān)，隨著性腺成熟度不斷提高而升高，隨著配子排放而降低。本試驗(yàn)中，觀(guān)察性腺發(fā)現(xiàn)，條件指數(shù)與四角蛤蜊性腺發(fā)育周期密切正相關(guān)。條件指數(shù)在3月隨著性腺成熟而升高；在4—6月的配子排放期中保持不變并在后期降低；在7月耗盡期結(jié)束后急速上升，并維持較高水平直至9月；在10月第二次產(chǎn)卵高峰后又下降。

3.3 繁殖周期

海產(chǎn)雙殼貝類(lèi)很難精確測(cè)定其產(chǎn)卵次數(shù)，一般通過(guò)形態(tài)學(xué)和組織學(xué)方法進(jìn)行觀(guān)察，確定每年主要的產(chǎn)卵高峰期[19]。本試驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)四角蛤蜊樣品條件指數(shù)的計(jì)算和性腺組織學(xué)的觀(guān)察，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析得知，盤(pán)錦遼河口海域四角蛤蜊全年有兩個(gè)產(chǎn)卵高峰，一個(gè)為4—6月，另一個(gè)為10月上旬。相較而言，10月上旬產(chǎn)卵(排精)個(gè)體少于4—6月。這與項(xiàng)福椿[14]報(bào)道的遼寧沿海四角蛤蜊產(chǎn)卵期結(jié)果相似，其主要產(chǎn)卵期在5—6月，9月上旬為第二次產(chǎn)卵期；也與Iwata等[12-13]對(duì)東京灣四角蛤蜊繁殖周期的研究結(jié)果相似，為東京灣四角蛤蜊每年的產(chǎn)卵季分別為4—7月和9—10月上旬。但柯巧珍等[10-11]研究表明，山東北部沿海四角蛤蜊產(chǎn)卵期和韓國(guó)群山沿海四角蛤蜊的產(chǎn)卵期每年只有一次，為7—8月，這與本試驗(yàn)結(jié)果不同，這可能是由不同海域環(huán)境因子差異較大所致。本試驗(yàn)組織學(xué)觀(guān)察結(jié)果顯示，四角蛤蜊樣品的兩性性腺發(fā)育同步，精子和卵子同時(shí)排放，在7月幾乎全部排空；8月一部分個(gè)體性腺進(jìn)行第二次發(fā)育，10月上旬排出兩性配子。兩性性腺同時(shí)發(fā)育，兩性配子同時(shí)排出是貝類(lèi)繁殖成功的重要基礎(chǔ)[17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，四角蛤蜊精子和卵子在第一次產(chǎn)卵高峰(4—6月)大量集中排放，第二次產(chǎn)卵高峰(10月上旬)排放量較少，這可為提高該地區(qū)四角蛤蜊人工育苗技術(shù)水平提供理論依據(jù)。

3.4 性比

從性比上看，本試驗(yàn)采樣海域的四角蛤蜊雌、雄數(shù)量差異不顯著，與項(xiàng)福椿[14](1∶1.08)和Chung等[11](1∶1.046)的研究結(jié)果相近，與安立會(huì)等[21]的研究結(jié)果有一定差異，與柯巧珍等[10](1.138∶1)的研究結(jié)果相反。這有可能與不同地理種群差異或抽樣誤差有關(guān)。同時(shí)安立會(huì)等[21]報(bào)道了遼東灣四角蛤蜊出現(xiàn)雌雄同體的性變現(xiàn)象，并認(rèn)為是由壬基酚和雙酚A的污染影響所致，并且性變比例與性腺成熟度呈正相關(guān)。本試驗(yàn)也有相同結(jié)果，但性變比例較小，這種不同的主要原因應(yīng)是采樣方法和采樣時(shí)間不同，本試驗(yàn)所采性腺成熟度高的樣本比例較安立會(huì)等[21]的比例低。

4 結(jié) 論

遼河口海域四角蛤蜊有兩個(gè)產(chǎn)卵高峰，主要是4—6月，其次為10月。條件指數(shù)分析結(jié)果顯示，在7—9月有一個(gè)快速恢復(fù)期，一部分四角蛤蜊個(gè)體的性腺第二次發(fā)育，并在10月排出配子。條件指數(shù)分析結(jié)果和組織學(xué)觀(guān)察結(jié)果相符合，可以作為判斷性腺成熟度的指標(biāo)。